佐剂的制作方法
【专利摘要】本发明是基于无机(金属/金属氧化物)纳米粒的佐剂性质的识别。因此，本发明提供包含无机纳米粒、由其组成或基本由其组成的佐剂。本发明还提供包含所述佐剂的组合物和疫苗以及使用所述佐剂无机纳米粒的方法。
【专利说明】佐剂 发明领域
[0001] 本发明提供新的佐剂，其用于改变、调节或增强人或动物受试者中的免疫反应。本 发明还提供包含所述佐剂的组合物和疫苗。
[0002] 发明背景
[0003] 疫苗被认为是预防传染病中的最终免疫学工具，其是通过以良好的抗体反应提供 长效保护性免疫[1 ;2]。佐剂的作用是加强免疫系统对通过抗原递呈细胞的活化供给的最 小量抗原的特异性反应[3]。理想的佐剂自身将不具有抗原性并且将促进免疫反应同时不 诱发免疫系统的过度反应，免疫系统的过度反应可能伤害患者（如诱发过度局部炎症、过 敏或迟发型超敏反应）。
[0004] 出于安全性考虑，得到许可的佐剂非常有限，并且注射位点处的疼痛和炎症是在 临床疫苗中使用佐剂的常见副作用。在人疫苗中被最广泛使用的佐剂是含有铝的[4]，如明 矾、无机盐，其通常由Al (OH)3或Al (PO)4组成。明矾佐剂因此是金属氧化物颗粒。
[0005] 在小鼠中，含铝佐剂诱发体液免疫，主要是通过促进Th2型反应，同时刺激依赖 Thl的抗体的能力较弱。此类型的佐剂通常不会诱发强的细胞介导的免疫反应，尤其是具有 细胞毒性的T细胞反应[4]，虽然据报道其在额外的脂质佐剂的存在下引发细胞毒性的CD8 反应[5]。因此，含明矾的佐剂适合于针对蛋白质抗原或失活有机体的反应，但是对于诱发 对胞内病原体的反应来说不是最佳的[1-4]。
[0006] 纳米粒（NP)已经被扩展至各种各样的生物医学用途，这归因于与大体积的化学 品相比其独特的理化性质[6]。例如，NP具有更大的表面积并且通过静电相互作用而具有 高的蛋白质结合亲和力[7]。NP还能够渗入到组织深部并且加强细胞摄取以及避开溶酶体 腔室[7-9]。这些独特的性质导致NP被认为是潜在的佐剂[10 ;11]。NP的大小表现出影 响佐剂能力，并且较小的NP已被证明产生更大的抗体和细胞免疫反应[12]。然而，用于疫 苗佐剂的NP候选物中的大多数是有机物质[13]。
[0007] 据报道，在鼠的哮喘模型中，多壁碳纳米管[14]、柴油机尾气颗粒[15]和纳米尺 寸的超细炭黑[16]通过类似佐剂的机制增加血清IgE水平。与使用含明矾佐剂报道的数 据[17;18]比较，纳米尺寸的炭黑显示与IgGl类似的佐剂作用，并且IgE增加[16]。
[0008] 已经证明，氧化镍NP (NiONP)和氧化钴NP (Co3O4NP)能够在雌性Wistar大鼠的肺 中诱发Thl相关性细胞因子反应[19]。
[0009] 本发明试图消除与现有技术相关的一种或多种问题并且提供另外的佐剂，所述佐 剂适合于与疫苗一起使用以针对细胞介导的免疫反应对于预防或治愈来说是重要的疾病。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明是基于对无机（金属/金属氧化物）纳米粒的佐剂性质的鉴定。
[0012] 在第一方面，本发明提供包含无机纳米粒、由其组成或基本由其组成的佐剂。
[0013] 在一个实施方案中，所述佐剂可以不包含明矾。
[0014] 本发明提供的佐剂的无机纳米粒可以包括金属纳米粒。例如，所述金属纳米粒可 以包括金属氧化物纳米粒。
[0015] 有利地，本发明的佐剂可以包括一种或多种类型的金属纳米粒。例如，本文中 所述的佐剂可以包括不同类型的无机（金属氧化物）纳米粒的混合物（cocktails or mixtures)。在一个实施方案中，本文中所述的佐剂还可以包含一些基于明研^的佐剂。
[0016] 如此，本发明的一个实施方案提供包含金属和/或金属氧化物纳米粒、由其组成 或基本由其组成的佐剂。
[0017] 本发明的佐剂可以包含钴纳米粒、由其组成或基本由其组成。在一个实施方案 中，钴纳米粒包含钴氧化物。适合用作本发明的佐剂的钴氧化物纳米粒可以包括，例如，钴 (II，III)氧化物（Co3O4)纳米粒。
[0018] 鉴于以上，本发明提供包含钴和/或钴（II，III)氧化物（Co3O4))纳米粒、由其组 成或基本由其组成的佐剂。
[0019] 技术人员将理解，存在其他形式的钴氧化物，并且这些可以具有作为佐剂的类似 用途-因此，本文中所述的佐剂还可以包含氧化钴（钴（II)氧化物：C〇0)和/或氧化高 钴（钴（III)氧化物：c〇203)或可以由其组成或基本由其组成。
[0020] 本发明人发现包含无机纳米粒的佐剂，尤其是包含金属纳米粒如钴纳米粒的那些 佐剂，当在体内施用时，诱发平衡的Thl和Th2型反应。这与其他佐剂（包括，例如，包含明 矾的那些）形成对比，后者仅诱发Thl反应或Th2反应。技术人员将理解，虽然Thl反应可 以有效地帮助清除胞内病原体，但是大部分佐剂引发Th2反应，其在清除胞外病原体方面 更有效。如此，本发明的无机或钴纳米粒佐剂可以与各种各样的疫苗一起使用，并且尤其适 合于与针对这样的疾病的疫苗一起使用，在所述疾病中体液和/或细胞介导的免疫反应对 于预防或治愈是重要的。
[0021] 此外，本发明人观察到，与基于明矾的佐剂（其主要包含微粒明矾（即0.1 至 IOOym的明矾颗粒）或由其组成）形成对比的是，本发明的无机（基于钴的）纳米粒佐剂 诱发的免疫反应包含少得多的'变应性' IgE免疫球蛋白同种型。这是重要的，因为其在佐 剂施用后减少超敏反应。
[0022] 作为另外的优点，本发明人发现，基于无机纳米粒的佐剂-如，例如，本文中所述 的钴纳米粒佐剂，在敏化和攻击位点诱发较少的炎症。这具有优点，即减轻可以通常在佐剂 如明矾的施用后的疼痛肿胀。
[0023] 鉴于以上，并且不希望受制于理论，作为诱发平衡的THl和TH2免疫反应的结果， 与基于明矾的佐剂相比减小的毒性以及变应性副作用的相对缺少，无机纳米粒（例如，包 含钴和/或钴氧化物（具体地Co3O4)的金属纳米粒），代表了适合于与疫苗一起使用的通 用佐剂，其中需要Thl或Th2反应或Thl和Th2反应两者来清除病原体。
[0024] 术语纳米粒涵盖直径为约Inm至约IOOnm的颗粒。例如，纳米粒可以为约（或者 其平均直径为）lnm，5nm，10nm，15nm，20nm，25nm，30nm，40nm，50nm，60nm，70nm，80nm，90nm， 95nm或99nm。在一个实施方案中，本发明提供的佐剂组合物的纳米粒的平均直径可以为 约15nm, 16nm, 17nm, 18nm, 19nm或20nm。当纳米粒包含钴时，其直径（或平均直径）可以 17nm, 17. 5nm, 18nm, 18. lnm, 18. 2nm, 18. 3nm, 18. 4nm, 18. 5nm, 18. 6nm, 18. 7nm, 18. 8nm, 18. 9nm,19nm,19. 5nm 或 20nm〇
[0025] 在一个实施方案中，本文中所述的佐剂的钴纳米粒（包括钴（II，III)氧化物纳米 粒）的平均直径为约18. 4±5. Onm。
[0026] 在第二方面，本发明提供本文所述的无机金属纳米粒（包括钴/钴氧化物）纳米 粒作为佐剂的用途。在其他实施方案中，本发明提供用作佐剂的本文所述的无机金属纳米 粒（包括钴/钴氧化物）纳米粒。例如，本发明可以提供Co3O4纳米粒作为佐剂的用途和用 作佐剂的Co3O4纳米粒。
[0027] 在第三方面，本发明提供的佐剂可以被提供作为组合物。在一个实施方案中，本发 明的佐剂组合物可以包含选自由以下各项组成的组的一种或多种组分：
[0028] (i) -种或多种类型的无机金属纳米粒；
[0029] (ii)另外的佐剂组分（例如基于明研1的佐剂）；和
[0030] (iii)药学上可接受的或生理学上可接受的赋形剂、溶剂、载体或稀释剂。
[0031] 合适的赋形剂可以包括，例如油，并且技术人员将理解，术语"油"可以包括链烷 烃，烯烃，炔烃，及其相应的酸和醇，其醚和酯，及它们的混合物。油的具体化合物有轻质烃 化合物，即，此种组分具有6至30个碳原子。所述油可以合成制备或自石油产品纯化。所 述"油"可以具有直链或支链结构。其可以是完全饱和的或具有一个或多个双键或三键。用 于本发明的一些非可代谢油包括例如矿物油、石蜡油和环烷烃。
[0032] 术语油也意在包括"轻质矿物油"，即这样的油，其通过蒸馏矿脂类似地获得，但是 具有比石蜡油稍微低的比重。用作赋形剂的其他"油"可以包括可代谢（无毒性）油。此 类油可以包括，例如植物油，鱼油，动物油或可以被将被施用以所述佐剂的受试者（人或动 物）的身体代谢并且没有毒性的合成制备的油。植物油的来源包括坚果，种子和谷物。
[0033] 技术人员将理解，本文所述的任何油赋形剂可以作为水包油、油包水或水包油包 水乳液形式被提供。
[0034] 本发明提供的水包油乳液由AMPHIGEN(R)制剂组成。此制剂包含水成组分， 卵磷脂，矿物油，和表面活性剂。描述所述制剂的组分的专利包括US 5, 084, 269和US 6, 572, 861。典型地，本发明的油组分以按体积计1 %至50%的量；或10%至45%的量；或 20 %至40 %的量存在。
[0035] 本文所述的佐剂组合物的其他组分可以包括药学上可接受的赋形剂，如载体、溶 齐U、和稀释剂、等张剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、血管收缩剂、抗细菌剂、抗真菌剂等。典型的 载体、溶剂和稀释剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油、油等。代表性的等张剂包括氯化钠、 右旋糖、甘露醇、山梨醇、乳糖等。有用的稳定剂包括明胶、清蛋白等。
[0036] 表面活性剂用于帮助稳定被选择充当佐剂和抗原的载体的乳液。适用于本发明的 表面活性剂包括天然生物相容性表面活性剂和非天然合成表面活性剂。生物相容性表面 活性剂包括磷脂化合物或磷脂的混合物。优选的磷脂有磷脂酰胆碱（卵磷脂），如大豆或 蛋卵磷脂。卵磷脂可以通过以下方法作为磷脂和甘油三酯的混合物获得：水洗未加工的植 物油，并且分离和干燥所得的水合胶。精制的产物可以通过以下方法获得：对通过丙酮洗 涤除去甘油三酯和植物油后剩余的丙酮不溶性磷脂和糖脂的混合物进行分馏。备选地，卵 磷脂可以获得自多个商业来源。其他合适的磷脂包括磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝 氨酸（phosphatidylsehne)，磷脂酸，心磷脂，和磷脂酰乙醇胺。磷脂可以分离自天然来源 或可以是常规合成的。适用于本发明的非天然、合成表面活性剂包括脱水山梨醇系非离子 表面活性剂，例如脂肪酸取代的脱水山梨醇表面活性剂（以商品名SPAN(R)或ARLACEL(R) 市售的），聚乙氧基化的山梨醇的脂肪酸酯（TWEEN(R))，来自来源如蓖麻油的脂肪酸的聚 乙二醇酯（EMULFOR(R));聚乙氧基化的脂肪酸（例如，可以商品名SMULSOL M-53(R)获 得的硬脂酸），聚乙氧基化的异辛基苯酚/甲醛聚合物（TYLOXAPOL(R))，脂肪醇聚氧乙烯 醚（BRIJ(R));壬基酚聚氧乙烯醚（TRITON(R)N)，异辛基苯基聚氧乙烯醚（TRITON(R)X)。 一般而言，表面活性剂或表面活性剂的组合（如果使用两种以上表面活性剂）以按体积计 0. 01 %至10 %、优选地0. 1 %至6. 0 %、更优选地0. 2 %至5. 0 %的量存在于乳液中。
[0037]当在本文中使用时，"药学上可接受的载体"包括任何和全部溶剂、分散介质、涂 料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂、吸附延迟剂等。载体应当 在与组合物的其他组分相容并且对受试者无害的意义上是"可用的"。典型地，载体将是无 菌且无热原的，并且基于要使用的施用模式进行选择。本领域技术人员公知的是，药学上可 接受的载体的某些制剂包含在由美国（US)农业部或美国食品和药品管理局（或非美国国 家中的同等的政府机构）颁布的可适用的规定中批准的那些载体。因此，用于组合物的商 业制备的药学上可接受的载体可以是已经或将被美国或外国的适当的政府机构批准的载 体。
[0038] 所述组合物可以任选地包含相容的药学上可接受的（即，无菌或无毒性）液体、半 固体或固体稀释剂，其充当药物载体、赋形剂或介质。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙 醇、甘油等。等张剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，等等。稳定剂包括清 蛋白，等等。
[0039] 所述组合物还可以含有抗生素或其他防腐剂，包括，例如，庆大霉素、硫柳汞 (merthiolate)或氯甲酚。可选择的多种类型的抗生素或防腐剂是技术人员熟知的。
[0040] 在一个实施方案中，本发明的佐剂组合物可以包含一种或多种另外的佐剂组分。 例如，佐剂组合物除了本文所述的无机（钴）纳米粒以外还可以包含选自由以下各项组成 的组的一种或多种佐剂：明矾（包含氢氧化铝/磷酸铝）；油系佐剂和有机佐剂（例如角鲨 烯）。
[0041] 在一个实施方案中，本文所述的佐剂和/或佐剂组合物可以以冻干形式或作为冻 干组合物被提供。技术人员将理解，本发明的冻干佐剂/佐剂组合物可以使用本文所述的 任何药学上可接受的载体/稀释剂和/或赋形剂重建。
[0042] 有利地，本文所述的佐剂和佐剂组合物还可以包含一种或多种保存剂-包括，例 如，防冻剂。
[0043] 佐剂经常被用作疫苗组合物的组分-尤其是当疫苗的抗原的免疫原性弱时。技 术人员将理解，佐剂可以用于改变、调节、修改或增大疫苗的效果从而刺激合适或适当的免 疫反应-所述免疫反应有助于从人或动物宿主中清除病原体。如此，在另一方面，本发明 扩展至用于人或动物使用的疫苗，其中所述疫苗包含本文所述的佐剂或利用其配制。
[0044] 在另一个实施方案中，本发明提供用于加强人或动物受试者中的免疫反应的本发 明的佐剂（即，钴系佐剂）。在一个实施方案中，本发明的佐剂与疫苗一起或同时施用。典 型地，将佐剂与疫苗配制在一起以用于施用于人或动物受试者。在其他实施方案中，使用的 佐剂可以被配制成单独的组合物（与合适的药物载体、稀释剂和/或赋形剂一起）以在施 用疫苗之前或之后向人或动物受试者施用。
[0045] 技术人员将理解，对本文中使用的"疫苗"的指代可以涵盖用于产生（raise)人或 动物宿主中的免疫反应的任何抗原制剂。目前使用的有很多不同类型的疫苗并且这些中的 很多使用佐剂配制/与佐剂结合或与佐剂一起施用（同时地或分开地）以提高、增加或改 变产生的免疫反应的性质。在一些情况中，佐剂被用作提高人或动物宿主中的免疫反应的 手段。例如，佐剂可以用于提高由低（亚最优）剂量的抗原引起的免疫反应。在这点上，本 发明的佐剂/佐剂组合物可以与亚最优剂量的疫苗或抗原组合-所述疫苗或抗原用来增 加由亚最优剂量引起的免疫反应。当与本发明的佐剂或佐剂组合物一起施用时，由亚最优 疫苗/抗原剂量产生的免疫反应，可以比得上单独（即，没有佐剂）施用最优剂量的疫苗/ 抗原产生的免疫反应。
[0046] 在一个实施方案中，病毒和/或细菌抗原疫苗可以与本文所述的佐剂/佐剂组合 物组合或一起施用（同时地或分开地）。例如，针对例如'流感'、白喉、百日咳、麻疹、腮腺 炎、风疹、小儿麻痹症、结核病、脑膜炎、破伤风、黄热病、狂犬病的形式的疫苗可以与本文所 述的佐剂组合或一起施用。
[0047] 在另一方面，本发明提供（i)产生免疫反应的方法和/或（ii)加强、调节或增强 人或动物受试者中的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向有此需要的人或动物受 试者施用本发明的第一方面提供的疫苗和佐剂。
[0048] 在一个实施方案中，佐剂可以与疫苗配制在一起以致所述佐剂与疫苗一起被施用 至人或动物宿主。在其他实施方案中，佐剂被配制成单独的组合物，以致其可以与疫苗分开 施用或与其同时施用。
[0049] 详述
[0050] 现在将参考以下附图详细地描述本发明，以下附图显示：
[0051] 图I =Co3O4NP(A)和I-明矾⑶的形状和尺寸。颗粒分散在蒸馏水中并且通过透 射电子显微镜测量。
[0052] 图2 :NP或I-明矾对RAW264. 7细胞的细胞毒性。在存在或不存在1 % OVA的情况 下将颗粒（给出的浓度以U g/ml计）添加到RAW264. 7细胞中达24h。对于细胞毒性，测量 乳酸脱氢酶（LDH)的水平。注意到，与Co3O4NP相比，I-明矾显示约6倍更多的细胞毒性， 并且OVA增加颗粒的毒性。数据为平均值土 SEM (n = 4/组）。将用1 % OVA或不用OVA处 理的颗粒的细胞毒性数据与其各自对照相比。***P〈〇. 001。
[0053] 图3 :第二次皮下敏化后7天血清中的OVA特异性IgGl水平。其他免疫球蛋白 (IgG2a、IgE、IgA和IgM)不显示增加（数据未显示）。数据是平均值土 SEM(n = 5/组）。
[0054] 图4 :使用卵清蛋白腹膜内攻击后7天存在于血清中的OVA特异性免疫球蛋白水 平。测试的免疫球蛋白有仏)1§61，出)1§62&，（〇1 §￡，（0)1§4，和伍)1§11。数据是平均值 土SEM(代表数据，n = 5/组）。（F)使用OVA腹膜内攻击后7天的脾细胞的增殖。仅用培 养基或在10 U M OVA存在下培养的细胞的3H-胸腺嘧啶掺入。
[0055] 图5 :使用卵清蛋白攻击后7天腹腔灌洗液中的OVA特异性IgGl水平。其他免疫 球蛋白（IgG2a、IgE、IgA和IgM)不显示增加（数据未显示）。数据是平均值土 SEM(n = 5/ 组）。
[0056] 图6 :攻击后7天收集的腹腔灌洗液中的细胞因子的水平。（A) IFN- Y ; (B) IL-I 3。 数据是平均值土 SEM (n = 5/组）。*P〈0. 05,与PBS处理组相比。
[0057] 图7 :攻击后7天收集的腹腔灌洗液的分类细胞计数。数据是平均值土SEM(n = 5/ 组）。*P〈0. 05，**P〈0. 01，并且 ***P〈0. 001，与 PBS 处理组相比。
[0058] 图8 :攻击后7天注射位点的代表性组织学。A，PBS ;B，NP-OVA ;C，I-明矾-OVA ; D，单独的NP。注意到，NP-OVA和单独的NP组显示轻微的炎症（箭头）以及NP的沉积（黑 点），同时I-明研I _〇VA显不严重炎症和坏死（箭头）。
[0059] 图9 :显示表达特定标志的树突细胞的数目的图表。
[0060] 图10 :显示对钴氧化物纳米粒的细胞毒性反应的图表。
[0061] 图11 :显示对Imject Alum的细胞毒性反应的图表。
[0062] 图12 :显示响应于氧化钴NP±1 % OVA的DC的细胞毒性的图表。
[0063] 图13 :显示响应于Imject Alumil % OVA的DC的细胞毒性的图表。
[0064] 图14 :显示通过用氧化钴NP±1 % OVA处理的DC的IL-I @产生。
[0065] 图15 :显示通过用Imject Alum± 1 % OVA处理的DC的IL-I P产生。
[0066] 实施例1
[0067] 因为几乎没有佐剂能够诱发Thl反应，所以考虑NP可以用于提高针对模式抗原卵 清蛋白（OVA)的Thl免疫性。
[0068] 我们选择Co3O4NP作为候选佐剂，因为Co3O 4NP在不产生在NiONP的情况下见到的 严重的延迟型超敏病理学[19]的情况下产生Thl反应。目的是确定Co3O4NP是否可以通过 诱发针对经皮下施用至雌性C57BL/6小鼠的模式抗原OVA的平衡的Thl和Th2反应而适合 用作佐剂。
[0069] 为此，我们将由Co3O4NP诱发的抗-OVA反应与由市售含铝佐剂诱发的那些相比。 选择的佐剂是Imject Alum(I-明矾），这是一种被广泛用于鼠类实验的金属颗粒佐剂，其 含有氢氧化铝和氢氧化镁的50/50混合物以及无活性的稳定剂。除了卵清蛋白特异性反应 以外，还在注射位点处评估毒性，并且使用小鼠巨噬细胞细胞系评估抗原递呈细胞的细胞 毒性。
[0070] 材料和方法
[0071] 除非另外指出，所有化学品和试剂都购自Sigma-Aldrich (Poole, UK)。
[0072] 颗粒的表征和分散.
[0073] 使用透射电子显微镜（JEM-1200EX II，JEOL，Tokyo, Japan)测量 Co3O4NP (Nanostructural and Amorphous Materials, TX, USA)和 Imject Alum(Thermo Scientific, Cramlington, UK)的尺寸。使用粒度分析仪（90Plus/BI_MAS ;Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA)，在不同浓度的分散介质存在下，测量颗粒的流 体力学尺寸。对于体内研究，鸡蛋卵清蛋白（V级）被用作用于C〇304NP+0VA (NP-OVA)和I-明 矾+0VA(I-明矾-0VA)的分散介质，同时收集自健康的C57BL/6小鼠的热失活血清（终浓 度：5% )被用于 NP-单独。使用 Limulus Amebocyte Lysate 测定（Cambrex，MD, USA)测 量颗粒悬浮液中的内毒素水平。根据之前描述的方法[19]，在酸性人造溶酶体液（pH 5.5) 或碱性人造间质液（pH 7.4)中，测试Co3O4NP和I-明矾的溶解度。
[0074] 剂量选择的理由.
[0075] 基于我们之前的研究，我们选择I-明矾的剂量为2. Omg/小鼠[17]。相对地，基于 肺中的炎症原性（inf lammogenicity) ,Co3O4NP的剂量被选择为25 ii g/小鼠；灌注419 ii g/ 大鼠的Co3O4NP显示急性嗜中性细胞炎症和慢性淋巴细胞/嗜中性细胞炎症以及小泡脂蛋 白累积病（alveolar lipoproteinosis) [19] 〇
[0076] 细胞毒性测定（LDH).
[0077] 将小鼠巨噬细胞细胞系RAW264. 7在37°C，在5% CO2的情况下，在含有L-谷氨酰 胺、抗生素（青霉素和链霉素）和10%热失活的胎牛血清（FBS)的Dulbecco' s Modified Eagle's Medium(DMEM)中培养。使用accutase剥离细胞并且将其以5X105接种在 12孔板（Corning，NY，USA)中以用于实验。使用乳酸脱氢酶（LDH)测定试剂盒（Roche Applied Science, Sussex, UK)，根据手册说明，测量NP和明研^的细胞毒性作用。使用 Ti02NP(30.5±1.8nm) (Nanostructural and Amorphous Materials, TX, USA)作为基准颗 粒。将含有或不含〇VA(l% )的NP或I-明矾溶液供应至RAW264. 7细胞达24h。以10、30、 100和500 ii g/ml的浓度测试各NP，同时以80、240和800 ii g/ml的浓度测试I-明矾。在 温育后，将无细胞的培养物上清在17000Xg离心20min以除去颗粒。将细胞毒性计算为与 阳性对照（〇? 1% Triton-X)相比的百分比。
[0078] 动物免疫.
[0079] 六周龄雌性 C57BL/6 小鼠获得自 Harlan Laboratories (Hillcrest，UK)。所有动 物都在由英国内政部向作者中的一位（SEMH)授权的、保证所有动物实验中的人道处理和 减轻痛苦的特殊许可下维持和处理。在1周的驯化后，以2周的间隔将小鼠（5只小鼠/组） 免疫两次。通过在尾部的底部皮下注射以含有25 ill PBS、50 ill (100 ii g)无内毒素的卵清 蛋白（Worthington Biochemical Corporation，NJ，USA)和 25 u 1 的佐剂（I-明研i :2. Omg ; Co3O4NP :25 ii g)的 100 ill 剂量敏化每只小鼠。将 PBS (100 ill)和 Co3O4NP (25 ii g，在含有 5 %小鼠血清的PBS中）用于阴性对照。然后，将在100 ill的PBS中的50 ii g的OVA注射 到腹膜中作为攻击。在第二次敏化后7天，从尾静脉收集血液。在攻击后7天，通过心脏穿 刺收集血液并且使用2ml的0.9%盐水进行三次腹腔灌洗。保留第一次的灌洗液以用于免 疫球蛋白和细胞因子ELISA，同时汇集来自三次灌洗的细胞以用于对细胞进行计数。注射位 点也用10%中性缓冲的福尔马林固定以用于组织学分析。
[0080] 2. 5.免疫球蛋白ELISA.对于OVA特异性免疫球蛋白IgA、IgE、IgGl、IgG2c (之 如被称为IgG2ab)和IgM子类的存在，分析在免疫后1周和攻击后1周收集的血液样品。 将血清和腹腔灌洗液样品适当地稀释在含有1 % BSA的PBS中。如下地稀释生物素缀 合的二抗：抗-IgA- 1:1000 ;抗-IgGl - 1:8000 ;抗-IgG2c- 1:1000 ;抗-IgM- 1:1000 ; 抗-IgE- 1:250。在测量IgE前，将血清与G蛋白偶联的小珠温育一小时以除去IgG[17 ; 18]。
[0081] 细胞因子ELISA.
[0082] 为了评估细胞因子分布，在腹腔灌洗液中测试Thl型细胞因子（IFN-Y )、Th2型细 胞因子（IL-10和IL-13)以及来源于巨噬细胞的促炎性细胞因子（IL-1 P )。所有试剂盒都 购自R&D Systems (Abingdon, UK)，并且根据生产商的说明测量细胞因子。
[0083] 腹腔灌洗液分类细胞计数.
[0084] 通过使用细胞核计数器（Chemometec，Surrey, UK)估计灌洗液中的细胞总数。使 用甩片机将细胞涂片于载玻片（Thermo Scientific, Cramlington，UK)上，用甲醇固定并且 用Diff-Quik(Raymond Lamb，Eastbourne，UK)染色。在光学显微镜下，根据其形态，每片约 计数300-500个细胞。
[0085] 淋巴细胞增殖测定.
[0086] 将脾从小鼠中移除并且通过使其通过40 y m滤器制备单细胞悬液。将细胞分层放 置在 lympholyte-M?(Fisher Scientific, Loughborough, UK)密度梯度分离介质上并且在 2000Xg旋转15分钟以除去死细胞、红血球和粒细胞。移除界面处的单核细胞层，将其洗涤 并重悬在组织培养基（补充有10%FCS、100U/ml青霉素、100iig/ml链霉素、2mM L-谷氨酰 胺和50 ii M 2-ME的RPMI 1640 ;Sigma，UK)中。对活细胞进行计数，并且将在200 ill中含 有4X IO5个细胞、不含有或含有IOii M无内毒素的卵清蛋白的一式三份的培养物铺板于96 孔板中。将培养物温育48小时并且向每孔中加入0.5 ii Ci 3-H-胸腺嘧啶过夜。收获培养 物并且在betaplate闪烁计数器（Wallac UK, Milton Keynes, UK)中对掺入的胸腺啼陡进 行计数。在72小时时收获来自平行的未标记培养物的上清用于细胞因子分析。
[0087] 组织学.
[0088] 将石蜡包埋的福尔马林固定的来自注射位点的组织切割成3 切片并且用苏木 精和曙红染色。
[0089] 统计分析.
[0090] 利用 GraphPad Prism Software(Version 5,GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA, USA)分析数据。为了比较处理组，应用单向方差分析以及事后Tukey成对比较。 P〈〇. 05被认为在统计上是显著的。
[0091] 结果
[0092] 颗粒的理化性质?
[0093] Co3O4NP显示为球形并且一级尺寸为18. 4±5. Onm。I-明矾显示为更多样的形状并 且平均尺寸为88. 7±32. 4nm(长度）和28. 9±19. 7nm(宽度）（图1)。两者颗粒的内毒素 水平都低于检测极限（0.1EU/ml)。Co3O4NP在没有分散介质的情况下显示为大的团块而在 卵清蛋白作为分散剂的情况下显示为小的团块（表1)。I-明矾即使在没有分散介质的情 况下也显示为小的团块。大部分I-明矾在3天内溶解在酸性人造溶酶体液（pH 5.5)中， 同时最低限度地溶解在人造间质液（pH 7.4)中（数据未显示）。Co3O4NP在两种条件下都 显示最小溶解（数据未显示）。
[0094] 3. 2.体外细胞毒性.I-明研^是到目前为止在小鼠巨噬细胞上测试的NP中毒性最 大的（图2)。当利用OVA分散颗粒时，颗粒毒性更大。
[0095] 表1.分散后24小时颗粒的流体力学尺寸和多分散性（平均值土SD)。
[0096]
【权利要求】
1. 包含无机纳米粒、由其组成或基本由其组成的佐剂。
2. 权利要求1的佐剂，其中所述佐剂不包含明矾。
3. 任一前述权利要求的佐剂，其中所述佐剂包含至少一种金属纳米粒和/或至少一种 金属氧化物纳米粒。
4. 任一前述权利要求的佐剂，其中所述佐剂包含钴纳米粒和/或钴氧化物纳米粒。
5. 权利要求4的佐剂，其中所述钴氧化物纳米粒包含钴（II，III)氧化物（C〇304)纳米 粒。
6. 任一前述权利要求的佐剂，其中所述佐剂包含或进一步包含氧化钴（钴（II)氧化 物：CoO)纳米粒和/或氧化高钴（钴（III)氧化物：C〇203)纳米粒。
7. 任一前述权利要求的佐剂，其中所述纳米粒的直径为约lnm至约lOOnm。
8. 权利要求4、5、6或7的佐剂，其中所述钴纳米粒的平均直径为约18. 4±5. Onm。
9. 无机金属纳米粒、钴纳米粒和/或钴氧化物纳米粒作为佐剂的用途。
10. 权利要求9的用途，其中所述纳米粒包含C〇304纳米粒。
11. 佐剂组合物，所述佐剂组合物包含：权利要求1-8中任一项的佐剂，药学上或生理 学上可接受的赋形剂、溶剂、载体或稀释剂。
12. 权利要求11的佐剂组合物，其中所述组合物包含一种或多种另外的佐剂组分。
13. 疫苗，所述疫苗包含权利要求1-8中任一项的佐剂。
14. 根据权利要求1-8中任一项的佐剂或根据权利要求13的疫苗，其用于加强人或动 物受试者中的免疫反应。
15. 在人或动物受试者中（i)产生免疫反应和/或（ii)加强、调节或增强免疫反应的 方法，所述方法包括以下步骤：将根据权利要求1-8中任一项的佐剂或权利要求13的疫苗 施用于有此需要的人或动物受试者。
【文档编号】A61K39/39GK104427998SQ201380027056
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年3月26日
【发明者】萨拉·豪伊, 肯尼思·唐纳森, 赵完燮 申请人:爱丁堡大学董事会