新的疏水蛋白释放系统的制作方法

新的疏水蛋白释放系统的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是包含与具有主要是疏水性质的治疗学和/或生物学活性蛋白质联合的特定透明质酸酰胺的新释放系统，用于随时间推移的持续缓慢释放，其提高了药物功效和患者顺从性。
【专利说明】新的疏水蛋白释放系统
[0001] 本发明涉及包含与具有治疗学和/或生物学活性的具有主要是疏水性质的蛋白 质联合的特定透明质酸酰胺的药物组合物，用于制备持续缓慢的蛋白质释放系统。
[0002] 发明背景
[0003] 通过将活（细菌）系统进行工程化而获得的第一个药物是胰岛素，其在1982年由 食品药品管理局（FDA)批准。以前从尸体中提取的人生长激素也很快进行了工程化。在 1986年，FDA批准了第一个重组人疫苗，其对抗乙型肝炎。采用活系统作为生物反应器进行 药物的工业化生产从此变得普及，并且现在是很多药物的优选合成方法，尤其是由于其相 对低的生产成本。
[0004] 通过生物工程技术生产了很多被设计用于治疗（和非治疗）用途的人蛋白质，包 括红细胞生成素（用于治疗贫血）、白细胞介素2 (用于治疗肾癌）、IL-IRadL-I受体拮抗 剂）、胰高血糖素、干扰素、人DNase酶、降钙素和很多其它蛋白质。
[0005] 所述药物主要具有蛋白质或多肽性质，通常经胃肠外施用，因为口服施用将引起 活性成分快速降解。但是，胃肠外施用可引起患者顺从性的问题，因为需要重复施用以确保 治疗效果。这些蛋白质通常具有非常短的半衰期；例如，生长激素hGH(通过基因生产）需 要每天注射。因此，为了减少施用次数和增加患者顺从性，已经进行了很多实验来开发具有 增加的半衰期的蛋白质/药物释放系统。
[0006] 所述释放系统必须保证药物的活性得以维持，因此必须确保蛋白质/药物的三维 结构保持完整；然而，在其制备期间可发生的应激状态如有机溶剂的存在和/温度和PH的 变化可引起蛋白质链的脱酰胺化或氧化，从而导致变性和治疗活性的丧失。
[0007] 例如，已知PLGA(聚乳酸/乙醇酸）微球的使用是用于小肽的释放系统，其具有优 良的结果（Hutchinson F.G.，Biochem. Soc. Trans.，1985, 13:520-523);然而，将其用于配 制hGH释放的贮库制剂是不可能的，因为该蛋白质的变性产生了炎性问题。
[0008] 对不具有毒性、但是所递送活性成分的功效未改变的蛋白质/药物释放系统所进 行的持续寻找已经指向了使用用于配制的天然聚合物，其（由于它们与活性成分的联合） 可以改变与它们所联合的药物的动力学。
[0009] 透明质酸（HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的交替残基组成的杂多 糖。它是一种天然的直链聚合物，分子量范围根据其获得来源和所用的制备方法为50, 000 至 13xl06Da。
[0010] 它天然存在于细胞外凝胶中、存在于脊椎动物结缔组织的基质（其为其中的主要 组分之一）中以及存在于关节滑液、玻璃体液和脐带中。
[0011] 因此，HA通过给很多组织如皮肤、腱、肌肉和软骨的细胞提供机械支持而在活生物 体中发挥重要的生物学作用。
[0012] 由于其性质，透明质酸保护组织免受自由基损害、控制炎性过程和刺激血管生成， 并且已经证明在创伤愈合的所有主要阶段的调控中特别有效（EP1196179)。
[0013] 在与透明质酸的简单联合或成盐中，使用所述多糖作为多种药物的载体是已知 的，因为其生物相容性、生物降解性、无免疫原性、粘度和水合性的特性使得其特别适于 用作局部和全身水平的药物和分子释放系统（EP197718、EP445255)。还已经研究了所述 多糖用于特定蛋白质的药物递送，所述蛋白质例如有IL-IRa(US 6, 096, 728)、红细胞生 成素（Hahn SK?等人，Int J Pharm. ,2006, 28, 322:44-51)、胰岛素（Nomura M?等人，J Pharm Pharmacol, 1994, 46:768-770)、生长激素（Kim SJ?等人，Journal of Controlled Release, 2005, 104:323-335)、干扰素和促卵泡激素（US8, 025, 900)。
[0014] 在所有这些情况中，药物与所述多糖的联合已经导致了所载蛋白质的"缓慢"释 放，但是不足以缓慢到减少药物施用次数。
[0015] HA是完全天然的多糖，其被体内存在的酶（透明质酸酶）迅速降解，相对迅速地 释放出所联合的药物。由于这些原因，已经对HA的羧基和羟基进行了化学修饰以产生交 联衍生物（US 4, 582, 865、US 4, 713, 448、US 5, 676, 964、US 4, 957, 74、US 5,827,937)或 者用其它天然或合成聚合物或用具有不同大小和物理化学特性的分子进行了衍生化（US 4, 851，521);然而，所述衍生物的制备方法往往损害所输送药理学物质的完整性。
[0016] 发明描述
[0017] 本发明的目的是包含与具有主要是疏水性质的治疗学和/或生物学活性蛋白质 联合的特定透明质酸酰胺的新的释放系统，用于随时间推移持续缓慢释放，其提高了药物 功效和患者顺从性。
[0018] 下文列出了本发明的具有主要是疏水性质的治疗学和/或生物学活性蛋白质的 一些实例：
[0019] 胰岛素 是具有合成代谢性质的蛋白质激素，由胰腺内的胰岛P细胞产生；它由两 条通过两个硫桥连接的链组成。其最知名的功能是调控血糖水平。因此，该蛋白质用于治 疗产生非常少胰岛素或不产生胰岛素的1型或2型糖尿病。该激素通过皮下注射施用（因 为如果将其直接注射到血流中，则药物吸收过快，可能导致低血糖）。该治疗方法基于由患 者进行的血糖测试的不同每日次数，随后施用校准剂量（3个或更多）的胰岛素。
[0020] 牛长激素（GH)是垂体前叶的肽激素，由191个氨基酸组成，分子量为22, 005Da。 其主要功能是通过促进几乎所有身体组织的细胞的生长和有丝分裂来刺激人体（和很多 其它脊椎动物的身体）发育（特别是其促进骨、软骨和结缔组织的生长）。
[0021] 在婴幼期，GH分泌不足引起垂体性侏儒症，而分泌过多则引起垂体性巨人症。如 果分泌过多是在生长结束后开始（通常是由于肿瘤），则出现肢端肥大症，其中面部、手和 足的骨头相当大程度地增大。
[0022] 因此，其被用于仍处于生长阶段的患者和患有垂体肿瘤的成人。
[0023] GH还用于治疗不是由GH缺乏引起的障碍，例如特纳综合征、慢性肾脏疾病、 ISS(特发性身材矮小症）和多发性硬化，以及用于增加肥胖患者的体重减轻，用于纤维肌 痛、节段性回肠炎和溃疡性结肠炎。
[0024] 在骨关节炎（OA)的治疗中，对hGH关节内施用进行的实验获得了极好的结果， 这也证明了所述激素在修复由OA造成的软骨损伤中的功效（EP1153607 ;Kim SB等人，J Korean Med Sci. ,2010, 25:776-80)。
[0025] 降钙素（CT)是一种由32-氨基酸多肽组成的激素，其在人中由甲状腺滤泡旁细胞 (也称为C细胞）产生。降钙素的主要功能是通过抵消甲状旁腺激素甲状旁腺素的作用而 降低血液中的钙浓度。已经在鱼、爬行动物、鸟和哺乳动物中发现了这种钙调节机制。降钙 素激素也在肾脏水平发挥作用，刺激肾小管消除钙。sCT(鲑鱼CT)通常被用于治疗骨质疏 松症、高钙血症、骨转移和佩吉特病。
[0026] 同样，最新实验数据已经证实了降钙素在骨关节炎治疗中的有效性：已经证明它 的施用保护关节面免于OA引起的侵蚀（Manicourt DH等人，J Musculoskelet Neuronal Interact, 2005, 5(3):285-293)。
[0027] ILl-Ra是细胞因子IL_1的受体拮抗剂，细胞因子IL_1是局部和全身炎性过程的 强诱导剂。IL-I主要由B和T淋巴细胞以及巨噬细胞在细菌刺激或其它细胞因子刺激后产 生；它也由肺泡巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞、成纤维细胞、破骨细胞、滑膜 细胞和很多其它细胞类型分泌。IL-I尤其牵涉在严重障碍如银屑病和败血症性休克中以及 牵涉在某些类型肿瘤的发病机制中。IL-I与其它细胞因子组合地代表了炎性过程的主要介 质之一，因此牵涉在多种障碍如骨质疏松症、类风湿性关节炎（RA)、银屑病性关节炎和骨关 节炎（OA)中：实际上，已经在患有类风湿性关节炎和/或骨关节炎的患者的滑液中发现了 大量IL_l〇
[0028] IL-I的表达对于OA的发病机制是关键的，因为IL-I促进金属蛋白酶（MMP)的合 成、分泌和活化，所述MMP是由软骨细胞产生的蛋白酶，其负责软骨基质的降解。
[0029] 所有有关OA过程的实验数据均有力地支持如下概念：IL_1和TNFa代表了参与 关节组织破坏的主要代谢系统；实际上，已经证明，通过阻断IL-I的产生和/或活化能够阻 止和 / 或减少关节基质的破坏（Caron J. P?等人，Arthritis Rheum, 1996, 39:1535-1544)。
[0030] 目前，含有受体拮抗剂IL-IRa的新药物用于抵消这种细胞因子的影响， 因为已经证明阻断该受体是治疗其中牵涉IL-I的障碍的有效方法（Burger D.等 人，Cytokine Reference, Oppenheim JJ 和 Feldmann M,编辑，纽约，伦敦，Academic Press，2000，p. 31-336; Jiang Y?等人，Arthritis Rheum, 2000, 43 (5): 1001-9)。
[0031] IL-IRa是作为所述白细胞介素的抑制剂的蛋白质；然而，含有IL-IRa的药物（如 基于阿那白滞素的JBlMref魏阿那白滞素是人蛋白质IL-IRa的重组非糖基化形式）具有 非常短的半衰期，这往往损害临床结果。因此，重要的是，配制含有IL-IRa的新药物组合物 以便以持续缓慢的方式递送药物，保证了较长的半衰期，以确保加强的临床结果。
[0032] 粒细朐集落刺激闵子（G-CSF)是174-180个氨基酸糖蛋白，其刺激骨髓产生粒细 胞和干细胞，所述粒细胞和干细胞随后释放至血液中。已经证明这种生长因子具有神经营 养蛋白活性，因此目前正被研究用于治疗大脑局部缺血和肌萎缩性侧索硬化症。它通常用 于肿瘤患者，以消解与化疗相关的中性白细胞减少症；最后，最近实验研究已经证明，G-CSF 静脉治疗促进了受损心脏细胞的再生。
[0033] 血小板衍牛牛长闵子（PDGF)是一种由二聚物鉬成的牛物活件蛋白质，所沭二聚 物由两个通过二硫桥连接的多肽（称为A和B)组成。其主要在巨核细胞中合成，在人中代 表了间充质来源的细胞的主要血清有丝分裂剂。它被用于促进创伤/溃疡的愈合，因为它 是基质结缔组织形成的介质，由于所有这些原因，其目前还被用于促进新骨组织的形成。
[0034] 转化牛长闵子3 (TGF-P)是一种在调节免疫系统和在组织再生、细胞分化和胚 胎发育中发挥关键作用的肽。其主要用作创伤愈合剂，因为它增强皮肤创伤/溃疡的愈合 和促进骨折的闭合；出于这些原因，其也用于治疗骨质疏松症和0A。最后，实验数据证明： 在心脏缺血损伤后，TGFP还具有心脏保护性质。
[0035] 表皮牛长因子（EGF)是在调节牛长以及在细胞增殖和分化中发挥重要作用的生 长因子。人EGF是6045道尔顿的蛋白质，由53个氨基酸残基和三个分子内二硫桥组成。它 发现于血小板、巨噬细胞、尿液、唾液、乳汁和血浆中。
[0036] 其为用作胃保护剂的蛋白质，因为它刺激胃肠粘膜细胞的增殖；其用于促进皮肤 组织再生，因为其在皮肤、静脉和其它类型的创伤/溃疡的处理中刺激新肉芽组织的形成。 最后，EGF的局部应用已经在受损角膜组织的再生中得到了极好的结果，例如在角膜手术后 或在退行性疾病如角膜炎的情况下。
[0037] 血管内皮牛长闵子（VEGF-B)是参与血管生成（即胚胎期循环系统的从头发生）、 神经发生和血管形成的蛋白质生长因子。它也是一种保护神经元免受NMDA介导的缺血性 损伤的神经保护剂。
[0038] 红细胞牛成素（EPO)是在人中由肾脏以及在较小稈度上由肝和脑产牛的一种糖 蛋白激素，其主要功能是调节红细胞生成（由骨髓生产血红细胞）。
[0039] 也已经在实验室中产生了 EP0,并用作药物以治疗罹患肾脏疾病或血液疾病的患 者的贫血或用于在给癌症患者施用化疗后加速恢复。在最近的研究中，已经观察到EPO作 为抗炎剂发挥神经保护作用。
[0040] 红细胞生成素是一种分子量为约30000D的糖蛋白分子。最后，自1989年以来， EPO已经可作为药物获得，用于进行透析的贫血患者。随后，其应用也扩展到接受保守治疗 的慢性肾功能衰竭患者，帮助改善他们的生活质量。通过重组DNA方法进行红细胞生成素 的药物生产。
[0041] 神经牛长因子（NGF)是下丘脑中由甲状腺和垂体分泌的蛋白质;它也由平滑肌细 胞和成纤维细胞产生。其活性形式是26KDa的NGFP，NGFP是具有两个二硫桥连接两个 118-氨基酸蛋白质链的同二聚体。其负责外周NS神经元和CNS胆碱能神经元的分化和功 能。因此，其用于治疗神经变性疾病如痴呆；还已经证明NGF可用于治疗青光眼。
[0042] 转铁蛋白是血流中的主要铁转运蛋白。转铁蛋白由肝和单核细胞-巨噬细胞系统 合成，其以非常稳定但可逆的方式结合在肠水平吸收的和源自红血细胞降解的铁，将其携 带至使用部位（特别是骨髓）和储存部位（特别是肝脏）。
[0043] 从结构的观点来看，它是由分子量为约80KD的679-氨基酸多肽链形成的糖蛋白， 具有两个对亚铁离子（Fe2+)没有亲合力的铁离子（Fe3+)结合位点；其半衰期为约8天。
[0044] 转铁蛋白主要由肝脏合成，其在血液中的参考值为200_360mg/dL。转铁蛋白水平 在使用避孕药期间、妊娠期间、铁缺乏事件中增加。相反地，它们在肾病综合征、肝脏疾病、 营养不良、慢性炎性疾病、肿瘤以及铁或可的松治疗的情况中下降。生理性减少可发生于新 生儿或老年。
[0045] IIIE是抑制金属蛋白酶（即参与软骨基质降解的酶）的蛋白质；TMP家族包括由 软骨细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、成骨细胞、神经元、巨噬细胞、平滑肌细胞、肝细胞及其它 细胞生产的TMP-2、HMP-3和TMP-4形式。
[0046] 因此，它们对软骨细胞和OA引起的软骨侵蚀发挥了保护作用。
[0047] 发明详述
[0048] 本发明涉及包含与具有治疗学和/或生物学活性的具有主要是疏水性质的蛋白 质联合的特定透明质酸酰胺的新药物组合物，用于制备持续缓慢的蛋白质释放系统。
[0049] 本发明的系统导致了 ：
[0050] ?所述蛋白质的持续释放，持续很长时间（与"原样"施用的相同蛋白质相比）。 这种连续释放增加了药物的治疗窗，因为紧接施用后的时间不会（如在施用"原样"药物的 情况下通常的那样）大量释放所述蛋白质。作为与特定HA酰胺联合的释放系统的施用调 节了药物的释放量（相对于时间）和释放期（因此获得了蛋白质释放量随时间推移逐渐增 力口，导致最终释放期超过当其"原样"施用时的释放期）；总之，蛋白质的动力学释放曲线被 显著改变，如同其治疗功效特征那样。
[0051] ?新的释放系统是无毒的，因为它是生物相容的和生物可降解的，并且其决定了所 载蛋白质/药物的缓慢释放，保证了治疗活性得以维持；活性成分的三维结构未经过任何 变性，因此其完整性得以确保。
[0052] ?本发明的释放系统未导致所载蛋白质发生任何化学改变，因为它是通过特定HA 酰胺与所载蛋白质的联合而形成的，所述蛋白质与特定HA酰胺合并/混合。因此，在载体 和药物之间没有建立共价化学键，由此保证了蛋白质/药物的结构完整性。
[0053] ?这些新特征极大地提高了患者顺从性，因为药物可以根据新的药代动力学和因 此以不同剂量进行施用：施用之间的时间间隔更长，并且改变了药物的施用量，从而导致功 效更强和副作用更少。
[0054] 形成本发明的目标的药理学和/或生物学活性蛋白质必须具有根据GRAVY(平均 亲水性）指数测定主要是疏水的特性；肽或蛋白质的GRAVY值计算为蛋白质中存在的所 有氨基酸的亲水值总和除以蛋白质序列中它们的残基数目。每个氨基酸具有给定的亲水 指数，其范围是从异亮氨酸（具有由芳香烃基团形成的残基的氨基酸，该芳香烃基团赋予 分子明确的非极性并因此是疏水性的）的4. 5至精氨酸（具有带正电荷残基的氨基酸） 的-4. 5 (Kyte J.等人，J. Mol. Biol. ,1982, 157:105-132)。该标尺表明，所分析氨基酸的 亲水指数越高，则其疏水性就越强（图1)。为了容易地确定所分析蛋白质的GRAVY值，通 常使用 ProtParam(Gasteiger E.等人，Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, JM Walker 编辑，The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press，2005, 571-607)程序，其通过分析所研究蛋白质的序列提供了它们的各种理化性质； 当输入所述氨基酸序列后，程序将计算其疏水性程度待测量的蛋白质的GRAVY值。
[0055] 根据本发明，"具有主要是疏水性质的蛋白质"指具有不低于-0. 5至正值的GRAVY 指数的那些蛋白质：同样，所分析蛋白质的GRAVY指数越高，则其疏水性越强。
[0056] 下文列出了本发明涉及的具有主要是疏水性质的蛋白质的一些实例：
[0057] ?胰岛素：GRAVY 指数=0? 2
[0058] ?人生长激素，hGF =GRAVY 指数=-0. 3
[0059] ?降钙素，sCT (鲑鱼 CT) :GRAVY 指数=-0? 5
[0060] ? IL-I，IL-IRa 受体拮抗剂：GRAVY 指数=-0? 4
[0061] ?粒细胞集落刺激因子，G-CSF =GRAVY指数=0. 2
[0062] ?血小板衍生生长因子，PDGF :GRAVY指数=-0. 5, PDGF-BB = -0. 1是优选的
[0063] ?转化生长因子TGF- @ :GRAVY指数=-0? 3
[0064] ?表皮生长因子，EGF :GRAVY指数=-0? 5
[0065] ?血管内皮生长因子B，VEGF-B :GRAVY指数=-0? 2
[0066] ?红细胞生成素（人）或EPO :GRAVY指数=-0? 03
[0067] ?神经生长因子或NGF P :GRAVY指数=-0. 3
[0068] ?转铁蛋白（人）：GRAVY指数=-0? 2
[0069] ?金属蛋白酶-2 (人）组织抑制剂，TMP-2 :GRAVY指数=-0? 2
[0070] ?金属蛋白酶_3 (人）组织抑制剂，TMP-3 :GRAVY指数=-0? 3
[0071] ?金属蛋白酶_4(人）组织抑制剂，TMP-4 :GRAVY指数=-0? 18。
[0072] 本 申请人:已经证明下文列出的形成本发明目的的透明质酸酰胺形成了这样的释 放系统：该释放系统决定了包含在其中的疏水性蛋白质的持续缓慢释放，而与相同酰胺联 合的具有主要是亲水性质的蛋白质不形成适于随时间推移持续缓慢释放它们的释放系统。
[0073] 形成本发明目的的适于形成所述释放系统的HA酰胺有：
[0074] ? HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比（通过IH-NMR 测定）为7%至14%、优选8%至9% ;
[0075] ? HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比(通过IH-NMR测定）为 10%至 15%、优选 10%至 11% ;
[0076] ? HA十二烷某酰胺：具有十二烷某胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比（通过IH-NMR 测定）为10%至15%、优选10%至11% ;
[0077] ? HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比(通过IH-NMR测 定）为7%至12%、优选7%至8% ;
[0078] ? HA苄基酰胺:具有苄胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比（通过IH-NMR测定）为 7%至15%、优选8%至9%。
[0079] 本发明中用于制备所述酰胺的HA可以从任意来源获得，例如从鸡冠花 (cockscombs)提取（EP138572)或发酵（例如来自马链球菌（Streptococcus equi)，如 本领域技术人员已知的那样）或者通过工艺方法（例如来自芽孢杆菌属（Bacillus)， W02012/032154)，具有 400 至 3xl06Da、优选 50 至 730KDa、750 至 1230KDa 或 1500 至 2500Kda、甚至更优选150至250KDa和/或500至730KDa的重均分子量（通过有限粘度值 测定：Terbo jevich 等人，Carbohydrate Research, 1986, 149:363-377 方法）。
[0080] 具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量的HA十六烷基酰胺是优选的。
[0081] 形成本发明目的的上文所列的HA酰胺可以如EP1095064中所述制备，EP1095064 还描述了其不同的用途，包括形成用于药理活性物质的释放系统，但是对所用药物的化学 类型和所选的酰胺类型没有做出任何区分，并且最重要的是没有描述所获得的效果。然而， 现在已经发现：与具有治疗学和/或生物学活性的具有主要是疏水性质（和因此超过-0. 5 的GRAVY指数）的蛋白质联合的、具有特定酰胺化百分比和所选丽范围的特定HA酰胺如 十六烷基酰胺、辛基酰胺、十二烷基酰胺、叔丁基酰胺和苄基酰胺可用于制备用于所述蛋白 质的新的持续缓慢释放系统。
[0082] 以下蛋白质是优选的：
[0083] ?胰岛素
[0084] ? hGH
[0085] ? sCT
[0086] ? IL-IRa
[0087] ? G-CSF
[0088] ? PDGF，优选 PDGF-BB
[0089] ? TGF- 3
[0090] ? EGF
[0091] ? VEGF-B
[0092] ? EPO
[0093] ? NGF 旦
[0094] ?转铁蛋白
[0095] .Hmpumpump-L
[0096] 所述蛋白质可通过重组DNA技术或通过从组织中提取而制备。
[0097] 本发明的另一目的是新的释放系统，其包含：
[0098] I. HA十六烷基酰胺、辛基酰胺、十二烷基酰胺、叔丁基酰胺或苄基酰胺，与如下联 合：
[0099] 2?胰岛素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、PDGF、优选 PDGF-BB、TGF- P、EGF、VEGF-B、 EPO、NGFP、转铁蛋白、TMP-2、TMP-3和TMP-4,可能与稳定剂（当需要时）和赋形剂联 合。
[0100] 特别地，本发明的目的是包含如下的系统：
[0101] I. HA十六烷基酰胺，优选具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量的HA 十六烷基酰胺；
[0102] 2.hGH 或 sCT，
[0103] 3.可能与稳定剂和赋形剂联合。
[0104] 该新系统可用于持续缓慢地释放它们所含的活性剂，因为它们改变了与它们联合 的蛋白质/药物的治疗窗：因此，不同的剂量方案是可能的，导致了较好的患者顺从性。
[0105] 存在于释放系统中的蛋白质将决定系统的用途。例如，包含HA十六烷基酰胺与 hGH或sCT的释放系统将优选通过关节内施用来治疗0A、类风湿性和银屑病关节炎以及骨 质疏松症。
[0106] 本 申请人:已经证明：这种新释放系统决定了 hGF在所治疗关节的滑液中持续释 放，产生了更好的治疗效果，但是没有允许活性剂进入血浆中（由此降低其在关节中的浓 度），因而预防了药物的全身副作用。
[0107] 本发明的目的还有包含如下的系统：
[0108] ?如前文所列和所述的一种或多种HA酰胺，以及胰岛素；本 申请人:将这种新系统 描述为缓慢释放胰岛素的新贮库制剂，其用于治疗需要较低药物施用的糖尿病。
[0109] 本发明的目的还有包含如下的系统：
[0110] ?如前文所列和所述的一种或多种HA酰胺，优选十六烷基酰胺，与蛋白质如 I3DGF(优选TOGF-BB)、TGF-P、EGF或VEGF-B联合，用于注射、关节内或局部应用或用于口 服施用。
[0111] 上述蛋白质因子（PDGF、TGF-0、EGF和VEGF-B)是已知其存在的生长因子，特别集 中于人的富血小板血浆（PRP)中。含有它们的新释放系统将优选可用于治疗由OA导致的 关节损伤、腱炎中和用于修复心肌损伤、修复骨撕裂伤/骨折/空腔以促进新骨组织形成和 最后可用于皮肤溃疡/创伤/撕裂伤愈合以促进新结缔组织形成。
[0112] 本发明的目的还有包含如下的系统：
[0113] ?如前文所列和所述的一种或多种HA酰胺，优选十六烷基酰胺，与金属蛋白酶抑 制剂TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4联合，用于注射应用、优选关节内应用。
[0114] 新释放系统将优选可用于治疗由OA引起的关节软骨损伤和修复骨软骨侵蚀。
[0115] 下文描述了新释放系统的制备实施例和 申请人:所进行的用于证明本发明的所述 系统的功效的实验。
[0116] 实施例1 :重询MW为500至730kDa的HA十六烷某酰胺衍牛物Hvadd4的合成，具 有8%至9%的靡尔酰胺化百分比
[0117] 将5. OOg发酵来源的具有500至730KDa丽的透明质酸钠盐溶于250ml水中，将 所得溶液通过玻璃柱渗滤，所述玻璃柱预填装有IOOml四丁基铵形式的Dowex树脂。洗脱 TBA盐形式的HA溶液，收集并冷冻干燥。
[0118] 将2g如此获得的产物溶于200ml二甲亚砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 53mgl，1' -羰二咪唑，将混合物在缓慢搅拌下于室温放置1小时。然后加入998mg十六烷 基胺，于42°C进行酰胺化反应24小时。
[0119] 加入5ml饱和NaCl水溶液停止该反应，30分钟后加入1. 5倍体积的无水乙醇以分 离所得衍生物。将沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在无水乙醇中洗涤，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0120] 得到I. 3g衍生物，通过IH-NMR测定了其酰胺化程度。
[0121] 实施例2 :重询MW为500至730kDa的HA辛某酰胺衍牛物Hvadd2的合成，具有 10%至11 %的靡尔酰胺化百分比
[0122] 将5. OOg发酵来源的具有500至730KDa MW的透明质酸钠盐溶于250ml水中，将 所得溶液通过玻璃柱渗滤，所述玻璃柱预填装有IOOml四丁基铵形式的Dowex树脂。洗脱 TBA盐形式的HA溶液，收集并冷冻干燥。
[0123] 将2g如此获得的产物溶于200ml二甲亚砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 61. 4mgl，1'-羰二咪唑，将混合物在缓慢搅拌下于室温放置1小时。然后加入330mg辛胺， 于42°C进行酰胺化反应24小时。
[0124] 加入5ml饱和NaCl水溶液停止该反应，30分钟后加入1. 5倍体积的无水乙醇以分 离所得衍生物。将沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在无水乙醇中洗涤，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0125] 得到I. 2g衍生物，通过IH-NMR测定了其酰胺化程度。
[0126] 实施例3 :重询MW为500至730kDa的HA十二烷某酰胺衍牛物Hvadd3的合成，具 有10%至11 %的靡尔酰胺化百分比
[0127] 将5. OOg发酵来源的具有500至730KDa MW的透明质酸钠盐溶于250ml水中，将 所得溶液通过玻璃柱渗滤，所述玻璃柱预填装有IOOml四丁基铵形式的Dowex树脂。洗脱 TBA盐形式的HA溶液，收集并冷冻干燥。
[0128] 将2g如此获得的产物溶于200ml二甲亚砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 54. 2mgl，1' -羰二咪唑，将混合物在缓慢搅拌下于室温放置1小时。然后加入448mg十二 烷基胺，于42°C进行酰胺化反应24小时。
[0129] 加入5ml饱和NaCl水溶液停止该反应，30分钟后加入I. 5倍体积的无水乙醇以分 离所得衍生物。将沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在无水乙醇中洗涤，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0130] 得到I. 25g衍生物，通过IH-NMR测定了其酰胺化程度。
[0131] 实施例4 :重询MW为500至730kDa的HA叔丁某酰胺衍牛物Hvadd6的合成，具有 7%至8%的靡尔酰胺化百分比
[0132] 将5. OOg发酵来源的具有500至730KDa MW的透明质酸钠盐溶于250ml水中，将 所得溶液通过玻璃柱渗滤，所述玻璃柱预填装有IOOml四丁基铵形式的Dowex树脂。洗脱 TBA盐形式的HA溶液，收集并冷冻干燥。
[0133] 将2g如此获得的产物溶于200ml二甲亚砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 53mgl，1' -羰二咪唑，将混合物在缓慢搅拌下于室温放置1小时。然后加入178mg叔丁基 胺，于42°C进行酰胺化反应24小时。
[0134] 加入5ml饱和NaCl水溶液停止该反应，30分钟后加入1. 5倍体积的无水乙醇以分 离所得衍生物。将沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在无水乙醇中洗涤，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0135] 得到I. 25g衍生物，通过IH-NMR测定了其酰胺化程度。
[0136] 实施例5 :重询MW为500至730kDa的HA苄某酰胺衍牛物Hvaddl的合成，具有8% 至9%的靡尔酰胺化百分比
[0137] 将5. OOg发酵来源的具有500至730KDa MW的透明质酸钠盐溶于250ml水中，将 所得溶液通过玻璃柱渗滤，所述玻璃柱预填装有IOOml四丁基铵形式的Dowex树脂。洗脱 TBA盐形式的HA溶液，收集并冷冻干燥。
[0138] 将2g如此获得的产物溶于200ml二甲亚砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 54. Omgl，1' -羰二咪唑，将混合物在缓慢搅拌下于室温放置1小时。然后加入260mg苄基 胺，于42°C进行酰胺化反应24小时。
[0139] 加入5ml饱和NaCl水溶液停止该反应，30分钟后加入1. 5倍体积的无水乙醇以分 离所得衍生物。将沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在无水乙醇中洗涤，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0140] 得到L 25g衍生物，通过IH-NMR测定了其酰胺化程度。
[0141] 实施例6 :以10:1和20: lw/w的比例含有HA和hGF的制剂的制各
[0142] 将8mg发酵来源的具有150至250KDa(LMW)和500至730kDa(MMW)MW的透明质酸 钠盐溶于Iml pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液中。完全溶解后，加入0. 8mg hGH得到10:1的多 糖/蛋白质重量比和加入〇.4mg hGH得到20:1的多糖/蛋白质重量比。将两种成分适宜 混合，使组合物均匀。如下计算装载量：将混合物以1:10稀释于缓冲液中，在280nm处测定 UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 GH浓度值。
[0143] 实施例7 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和hGF形成的释放系统的制剂 的制各
[0144] 将8mg如实施例1中所述制备的HA十六烧基酰胺衍生物HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中。完全溶解后，加入预溶于水溶液中的hGHO. 8mg并适宜混合，以便使 组合物均匀并且蛋白质被捕获入凝胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲 液中，在280nm处测定UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 GH浓度值。
[0145] 实施例8 :含有由10: lw/w比例的HA叔丁某酰胺和hGF形成的释放系统的制剂的 制各
[0146] 将8mg如实施例4中所述制备的Hyadd6溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入预溶于水溶液中的hGHO. 8mg并适宜混合，以便使组合物均勻 并且蛋白质被捕获入凝胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲液中，在 280nm处测定UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 GH浓度值。
[0147] 实施例9 :含有由10: lw/w比例的HA辛某酰胺和hGF形成的释放系统的制剂的制 备
[0148] 将8mg如实施例2中所述制备的Hyadd2溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入预溶于水溶液中的hGHO. 8mg并适宜混合，以便使组合物均勻 并且蛋白质被捕获入凝胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲液中，在 280nm处测定UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 GH浓度值。
[0149] 实施例10 :含有由10: lw/V比例的HA十二烷某酰胺和hGF形成的释放系统的制 剂的制各
[0150] 将8mg如实施例3中所述制备的Hyadd3溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入预溶于水溶液中的hGHO. 8mg并适宜混合，以便使组合物均勻 并且蛋白质被捕获入凝胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲液中，在 280nm处测定UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 GH浓度值。
[0151] 实施例11 :含有由10: lw/w比例的HA苄某酰胺和hGF形成的释放系统的制剂的 制各
[0152] 将8mg如实施例5中所述制备的Hyaddl溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入预溶于水溶液中的hGHO. 8mg并适宜混合，以便使组合物均勻 并且蛋白质被捕获入凝胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲液中，在 280nm处测定UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 GH浓度值。
[0153] 实施例12 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和sCT形成的释放系统的制 剂的制各
[0154] 将8mg如实施例1中所述制备的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中。 完全溶解后，加入预溶于磷酸盐缓冲液中的鲑鱼降钙素（sCT)0. 8mg以获得10:1的w/w比 例，适宜混合以便使组合物均匀并且蛋白质被捕获入凝胶中。如下计算凝胶的装载量：将其 以1:10稀释于缓冲液中，在280nm处测定UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 降钙素浓度值。
[0155] 实施例13 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和IL-IRa形成的释放系统的 泡丨齐I丨的泡丨备
[0156] 将8mg如实施例1中所述制备的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中。 完全溶解后，加入预溶于水溶液中的IL-IRaO. 8mg，适宜混合以便使组合物均匀并且蛋白质 被捕获入凝胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲液中，在280nm处测定 UV吸光度，所述吸收度通过使用校准曲线提供了 IL-IRa浓度值。
[0157] 实施例14 :基于10: lw/w的HA十六烧基酉先胺和RNase的制齐[j的制备
[0158] 将8mg如实施例1中所述制备的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中。 完全溶解后，加入预溶于磷酸盐缓冲液中的RNaseO. 8mg，适宜混合以便蛋白质被捕获入凝 胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲液中，在280nm处测定UV吸光度， 所述吸收度通过使用校准曲线提供了 RNase浓度值。
[0159] 实施例15 :含有由10: lw/V比例的HA十六烷某酰胺和胰岛素形成的释放系统的 泡丨齐I丨的泡丨备
[0160] 将8mg如实施例1中所述制备的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸盐缓冲液中。 完全溶解后，加入预溶于磷酸盐缓冲液中的胰岛素0. 8mg，适宜混合以便蛋白质被捕获入凝 胶中。如下计算凝胶的装载量：将其以1:10稀释于缓冲液中，在280nm处测定UV吸光度， 所述吸收度通过使用校准曲线提供了 IL-IRa浓度值。
[0161] 实施例16 :用HA或HA酰胺配制的hGH的释放研究
[0162] 将如实施例6-11所述制备的制剂引入具有IOOkDa截留的透析管中，浸入温和搅 拌的PH7磷酸盐缓冲液中，监测从供体隔室的释放。为了比较，将0.8mg hGH与Iml磷酸盐 缓冲液（PBS)混合，将制剂引入透析管中。
[0163] 在所有实验中始终维持漏槽状态。在预设时间，从供体隔室取50 iU等分试样并 1:10稀释以确定随时间推移的蛋白质含量。通过在280nm的UV读数和220nm的RP-HPLC 平行进行分析，以确定剩余蛋白质及其降解（如果有的话）的量。还进行了散射测量以研 究所配制蛋白质的聚集。最后，从接收隔室取出样品以检查蛋白质的释放量对应于从供体 隔室中消失的量，并且进行质谱测量（Esi-Tof)以证实所释放的GH未经历任何结构降解。 通过显示随时间推移释放的蛋白质百分比构建了释放曲线。图2、3、4和5。
[0164] 结果
[0165] 图2显示了通过由HyadcM和hGH形成的系统确定的hGH释放特性对比于通过在 PBS中制备的相同蛋白质代表的对照。
[0166] Ml显示了与LMW-HA和MMW-HA联合配制的hGH蛋白质的释放特性：在两种情况 下，测试了两种不同的HA和hGH重量比(10:1和20:1)，因为 申请人:通过该实验旨在证实： 对比于通过在PBS、即在水性溶剂中制备所获得的特性，具有疏水性质的蛋白质即使与大量 具有不同MW的HA联合也不会使蛋白质的释放特性产生任何变化。
[0167] 图4将由本发明的酰胺和hGH形成的释放系统的hGH释放特件与由hGH在PBS中 所代表的对照进行了比较。
[0168] 图5显示了由本发明的酰胺形成的释放系统的50% hGH释放时间，同样对比于如 上文所述的对照。
[0169] 如果将图3与图2和4相比较，可以看出：对比于由在PBS中分析的蛋白质所代表 的对照以及对比于在具有不同MW的HA中以不同重量比配制的蛋白质，由HA酰胺（如上文 所述和所要求）与具有主要是疏水性质的蛋白质（在此情况中为hGH)形成的释放系统以 显然显著的方式引起了蛋白质随时间推移持续缓慢释放。因此，决定所研究的疏水性蛋白 质的释放特性改变的不是所述多糖的浓度和/或MW，而是该聚合物的化学性质。所有这些 在图5中更清楚，图5比较了 50% hGH释放时间：该图显示，对比于对照（在PBS中的hGH)， 本发明涉及的新释放系统使释放时间升高一直到3倍。
[0170] 实施例17 :sCT、ILl_Ra和胰岛素的释放对比于亲水件蛋白质RNase A的释放特件 的研究
[0171] 将如实施例12-15所述制备的制剂各自引入具有IOOkDa截留的透析管中，浸入温 和搅拌的PH7磷酸盐缓冲液中。为了比较，将0. 8mg降钙素、IL-IRa、胰岛素或RNase与Iml 磷酸盐缓冲液混合，将制剂引入透析管中，以监测其随时间推移从供体隔室的释放。
[0172] 在所有实验中始终维持漏槽状态。在预设时间，从供体隔室取IOiU等分试样并 1:10稀释以确定随时间推移的蛋白质含量。通过在280nm的UV读数平行进行分析，以确定 剩余蛋白质的量。还进行了散射测量以研究所配制蛋白质的聚集。最后，从接收隔室取出 样品以检查蛋白质的释放量对应于从供体隔室中消失的量。构建了释放曲线，对比于对照 显示了随时间推移释放的蛋白质百分比。
[0173] 蛋白质RNase A的GRAVY指数=-0. 67,因此不能归类为主要为疏水性的蛋白质， 而是亲水性蛋白质。下文进行了描述以将其释放特性与由联合有主要具有疏水性质的蛋白 质的Hyadd释放系统所得到的特性相比较，从而证实存在差异。
[0174]
[0175] 图6-8显示了所分析的三种具有主要是疏水性质的蛋白质的释放曲线：在所有三 种情况中，由HA十六烷基酰胺联合所述蛋白质形成的系统决定其持续缓慢释放达到比对 照长得多的时间。
[0176] 相反，图9证实：相同的十六烷基酰胺以相同重量比（10:lw/w)与蛋白质 RNase(具有主要是亲水的性质且GRAVY指数=-0.67)的联合决定了与由相同蛋白质在 PBS中配制所产生的释放特性相同的释放特性。
[0177] 实施例18 :hGH释放入源自骨关节炎患者的人滑液（LS)的研究
[0178] 首先，将激素hGH与荧光探针（Cy5. 5)共价结合，从而可以在其它滑液蛋白质存在 的情况下清楚地识别出激素hGH。为此目的，将1.5mg hGH溶于2ml pH8硼酸盐缓冲液中， 向其中加入2mg预溶于60 ill DMSO中的Cy5. 5。在遮光和温和搅拌下进行标记反应18小 时。然后通过针对磷酸盐缓冲液透析4天和针对MilliQ水透析1天进行纯化。然后通过 凝胶过滤分析经标记的蛋白质，以验证其纯度。
[0179] 如实施例7所述以10:1重量比制备基于HyadcM和hGH_Cy5. 5的制剂。将两种成 分适宜混合，以便使组合物均匀并且蛋白质被捕获入凝胶中。将如此获得的凝胶引入具有 IOOkDa截留的透析管中，浸入由PBS和源自骨关节炎患者的滑液组成（v/vl:l)的介质中， 维持在温和搅拌下。
[0180] 在预设时间测定随时间推移释放到接收隔室的蛋白质量。该分析通过具有荧光检 测器的RP-HPLC进行，不仅确定hGH含量，而且还检查了该蛋白质未经历降解。构建释放曲 线，显示了长达48小时的随时间推移释放的蛋白质的百分比。
[0181]
[0182] 图10显示了所得结果：hGH从由HyadcM联合所研究蛋白质形成的系统向LS中的 释放证实，以前在图2中证实的持续缓慢释放保持不变。因此，可以说明：Hyadd系统中所 包含的蛋白质/药物受到保护，并且在富含酶、蛋白质（有些具有未知性质）和促炎分子的 释放介质如OA患者的滑液中未经受降解。
[0183] 实施例19 :由Hvadd4和hGH形成的系统在关节内施用于大鼠后的药物动力学研 究
[0184] 将8mg如实施例1中所述制备的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9磷酸盐缓冲液中，于 121°C湿热灭菌。随后，在无菌环境下加入0. SmghGH (预溶于水溶液中并通过0. 2微米再生 纤维素滤器进行过滤灭菌）并适宜混合，以便使组合物均匀并且蛋白质被捕获入凝胶中。
[0185] 对于体内研究，将等同于IOOii g蛋白质/动物的制剂量注射入大鼠膝盖中。在预 定时间（0. 15、1、2、3、4、5、6、7、8、24和4811)取血浆样品，进行￡1154测试以评估1.&.施用 后穿透到血浆中的hGH浓度。该实验一式三份进行。
[0186] 为比较目的，将一组动物用等量的游离hGHdOOyg)同样通过关节内施用进行处 理。通过将血浆中发现的hGH浓度（ng/ml)作为时间（一直到48h)的函数作图，获得了药 物动力学曲线。
[0187] 益果
[0188] 如图11所示，在关节内注射后立即能在血浆中发现所注射的蛋白质。
[0189] 但是，由于Hyadd系统产生的蛋白质持续释放，其保留在原位、即关节腔中并且未 穿透到血流中，从而其全部作用均发生在注射部位。
【权利要求】
1. 用于持续释放治疗学和/或生物学活性蛋白质的系统，包含： a) 具有主要是疏水性质的蛋白质，和 b) 透明质酸（HA)酰胺 其中所述具有主要是疏水性质的蛋白质具有超过_〇. 5的GRAVY指数，并且所述HA酰 胺选自： ?HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为7%至14%、优选 8%至 9% ; ? HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为10%至15%、优选10%至 11% ； ? HA十二烷基酰胺：具有十二烷基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为10%至15%、优 选 10%至 11% ; ?HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为7%至12%、优选7% 至8% ; ?HA苄基酰胺：具有苄胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为7%至15%、优选8%至9%。
2. 权利要求1所要求的用于持续释放蛋白质的系统，其中用于制备酰胺的HA具有400 至3-106Da、特别是50至730KDa、750至1230KDa或1500至2500KDa、甚至更特别是150至 250KDa或500至730KDa的重均分子量。
3. 权利要求1-2所要求的用于持续释放蛋白质的系统，其中所述的具有主要是疏水 性质的治疗学和/或生物学活性蛋白质是胰岛素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、TOGF、优选 PDGF-BB、TGF- P、EGF、VEGF-B、EPO、NGF P、转铁蛋白、HMP-2、HMP-3 和 TMP-4。
4. 权利要求1-3所要求的用于持续释放蛋白质的系统，其中所述HA酰胺是十六烷基酰 胺，并且用于制备所述酰胺的HA具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量。
5. 权利要求4所要求的用于持续释放蛋白质的系统，其中所述治疗学和/或生物学活 性蛋白质是hGH或sCT，任选与稳定剂和赋形剂联合。
6. 权利要求3所要求的用于持续释放蛋白质的系统，其中所述治疗学和/或生物学活 性蛋白质是胰岛素，任选与稳定剂和赋形剂联合。
7. 权利要求4所要求的用于持续释放蛋白质的系统，其中所述治疗学和/或生物学活 性蛋白质是TOGF、优选TOGF-BB、TGF- 0、EGF或VEGF-B，任选与稳定剂和赋形剂联合。
8. 权利要求4所要求的用于持续释放蛋白质的系统，其中所述治疗学和/或生物学活 性蛋白质是金属蛋白酶抑制剂TMP-2、TMP-3或TMP-4,任选与稳定剂和赋形剂联合。
9. 权利要求1-8任一项所要求的用于持续释放蛋白质的系统，用于在治疗由骨关节炎 导致的关节损伤、治疗腱炎、修复心肌损伤、修复骨折/空腔或愈合皮肤溃疡/创伤/撕裂 伤中用于注射、关节内或局部应用。
10. 权利要求5所要求的用于持续释放蛋白质的系统，用于在治疗骨关节炎、类风湿性 或银屑病性关节炎和/或骨质疏松症中用于关节内应用。
11. 权利要求3所要求的用于持续释放蛋白质的系统，用于在治疗由骨关节炎导致的 关节损伤、治疗腱炎、修复心肌损伤、修复骨折/空腔或愈合皮肤溃疡/创伤/撕裂伤中用 于注射、关节内或局部应用。
12. 权利要求7所要求的用于持续释放蛋白质的系统，用于在治疗由骨关节炎导致的 关节损伤、治疗腱炎、修复心肌损伤、修复骨折/空腔或愈合皮肤溃疡/创伤/撕裂伤中用 于注射、关节内或局部应用。
13. 权利要求8所要求的用于持续释放蛋白质的系统，用于在治疗由骨关节炎引起的 关节软骨损伤和/或修复骨软骨侵蚀中用于注射或关节内应用。
14. 透明质酸（HA)酰胺和具有主要是疏水性质的蛋白质在形成用于持续释放治疗学 和/或生物学活性蛋白质的系统中的用途，其中所述具有主要是疏水性质的蛋白质具有超 过-0. 5的GRAVY指数，并且其中所述HA酰胺选自： a) HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为7%至14%、优 选8%至9% ; b) HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为10%至15%、优选10%至 11% ； c) HA十二烷基酰胺：具有十二烷基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为10%至15%、优 选 10%至 11% ; d) HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为7 %至12 %、优选7 % 至8% ; e) HA苄基酰胺：具有苄胺的HA酰胺，摩尔酰胺化百分比为7%至15%、优选8%至9%; 其中用于制备酰胺的HA具有400至3xl06Da、特别是50至730KDa、750至1230KDa或 1500至2500KDa、甚至更特别是150至250KDa或500至730KDa的重均分子量。
15. 权利要求14所要求的用途，其中所述具有主要是疏水性质的治疗学和/或生物学 活性蛋白质是胰岛素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、PDGF、优选 PDGF-BB、TGF- 0、EGF、VEGF-B、 EPO、NGFP、转铁蛋白、HMP-2、HMP-3 和 TMP-4。
16. 权利要求15所要求的用途，其中所述HA酰胺是十六烷基酰胺。
17. 权利要求16所要求的用途，其中所述治疗学和/或生物学活性蛋白质是hGH或 sCT，任选与稳定剂和赋形剂联合。
18. 权利要求17所要求的用途，用于骨关节炎、类风湿性或银屑病性关节炎和/或骨质 疏松症的关节内治疗。
19. 权利要求15所要求的用途，用于在治疗由骨关节炎导致的关节损伤、治疗腱炎、修 复心肌损伤、修复骨折/空腔或愈合皮肤溃疡/创伤/撕裂伤中用于注射、关节内或局部应 用。
20. 权利要求16所要求的用途，其中所述治疗学和/或生物学活性蛋白质是金属蛋白 酶抑制剂TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4,任选与稳定剂和赋形剂联合，用于注射或关节内治疗 由骨关节炎引起的关节软骨损伤和/或修复骨软骨侵蚀。
【文档编号】A61K47/36GK104349788SQ201380028007
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】M·坎皮西, C·古丽瑟, D·雷尼尔 申请人:菲迪亚制药股份公司