用于肟键联的亲核性催化剂的制作方法

用于肟键联的亲核性催化剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的材料和方法，所述方法包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触。更具体地说，本发明涉及上述材料和方法，其中所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟或腙键联，并且其中所述缀合在亲核性催化剂存在下进行。
【专利说明】用于肟键联的亲核性催化剂 发明领域
[0001 ] 本发明涉及用于使水溶性聚合物与蛋白质缀合的材料和方法。
[0002] 发明背景
[0003] 通过在水溶性聚合物与治疗性蛋白质之间形成共价键联来制备缀合物可通过多 种化学方法进行。多肽药物的聚乙二醇化在循环中对其进行保护并且改良其药效学和药物 动力学特征（Harris和Chess，NatRevDrugDiscov. 2003 ;2 :214-21)。聚乙二醇化过程 将乙二醇的重复单元（聚乙二醇（PEG))连接至多肽药物。PEG分子具有大的流体动力学体 积（为球状蛋白质大小的5-10倍），水溶性高并且可被水合，无毒，非免疫原性并且自身体 快速清除。分子的聚乙二醇化可使得药物对酶降解的抗性增加，体内半衰期延长，给药频率 降低，免疫原性降低，物理和热稳定性增加，溶解性增加，液体稳定性增加和聚集减少。第一 个聚乙二醇化药物由FDA在二十世纪九十年代早期批准。自此以后，FDA已批准若干种聚 乙二醇化药物用于口服、注射和局部施用。
[0004] 聚唾液酸（PSA)也称为聚乙酰神经氨酸（colominicacid，CA)，为天然产生的多 糖。其为具有a(2 -8)酮苷键的N-乙酰基神经氨酸的均聚物，并且在其非还原末端含有 邻位二醇基。其带负电荷并且为人体的天然成分。其可以容易地由细菌大量地以预定物理 特征产生（美国专利号5, 846, 951)。因为细菌产生的PSA在化学上和在免疫学上与在人体 中产生的PSA相同，因此细菌PSA不具免疫原性，甚至在偶合至蛋白质时也是如此。不同于 一些聚合物，PSA酸可生物降解。聚乙酰神经氨酸与过氧化氢酶（catalase)和天冬酰胺酶 (asparaginase)的共价偶合已显示会增强在蛋白水解酶或血衆存在下的酶稳定性。与聚唾 液酸化和未修饰天冬酰胺酶的体内比较研宄揭示，聚唾液酸化增加酶的半衰期（Fernandes 和Gregoriadis，IntJPharm. 2001;217 :215-24)〇
[0005] PEG-衍生物与肽或蛋白质的偶合由Roberts等（AdvDrugDelivRev2002 ; 54:459-76)综述。一种用于偶合水溶性聚合物与治疗性蛋白质的方法为通过蛋白质的 碳水化合物部分来缀合聚合物。蛋白质中碳水化合物的邻位羟基（OH)可容易地用高碘 酸钠（NaIO4)氧化形成活性醛基（RothfusetSmith，JBiolChem1963 ;238 :1402-10 ; vanLentenetAshwell，JBiolChem1971 ;246 :1889-94)。随后可以通过使用含有例如 活性酰肼基的试剂将聚合物偶合至碳水化合物的醛基（WilchekM和BayerEA，Methods Enzymol1987;138:429-42)。最近的技术为使用含有氨氧基的试剂，所述氨氧基与醛反应 形成肟键联（W0 96/40662、TO2008/025856)。
[0006] 描述水溶性聚合物与治疗性蛋白质的缀合的其它实例描述于以下文献中：WO 06/071801，其教导氧化冯威里氏因子（VonWillebrandfactor)中的碳水化合物部分 并随后使用酰肼化学反应与PEG偶合；美国公布号2009/0076237,其教导氧化rFVIII并 随后使用酰肼化学反应与PEG和其它水溶性聚合物（例如PSA、HES、葡聚糖）偶合；WO 2008/025856,其教导氧化不同凝血因子（例如rFIX、FVIII和FVIIa)并随后使用氨氧基化 学反应通过形成肟键联而与例如PEG偶合；和美国专利号5, 621，039,其教导氧化FIX并随 后使用酰肼化学反应与PEG偶合。
[0007] 最近描述了一种改进的方法，其包括唾液酸的温和高碘酸盐氧化以生成醛，随后 在催化量苯胺的存在下与含有氨氧基的试剂反应（DirksenA?和DawsonPE，Bioconjugate Chem. 2008 ;19, 2543-8 ;和ZengY等，NatureMethods2009 ;6 :207-9)。苯胺催化显著 加速肟连接，从而允许使用极低浓度的试剂。亲核性催化剂的使用还描述于以下文献中： Dirksen，A?等，JAmChemSoc.，128 :15602-3(2006) ;Dirksen，A?等，Angewchem?国际版， 45 :7581-4(2006) ;Kohler，J.J.，ChemBioChem.，10 :2147-50(2009) ;Gius印pone，N?等，J AmChemSoc.，127 :5528-39(2005);和Thygesen，M.B?等，JOrgChem.，75 :1752-5(2010)〇 [0008] 尽管苯胺催化可加速肟连接，从而允许短反应时间和使用低浓度的氨氧基试 剂，但苯胺具有毒性，当例如缀合的治疗性蛋白质形成药物基础时，此必须加以考虑。例 如，已显示苯胺诱发高铁血红蛋白血症（Harrison，J.H..和Jollow，D.J.，Molecular Pharmacology，32(3)423-431，1987)。已显示对大鼠进行长期膳食处理会诱发脾肿瘤 (Goodman，DG?等，JNatlCancerInst.，73(1) :265_73，1984)。体外研宄还已显不苯胺具 有诱发染色体突变的可能性并且具有可能的基因毒性活性（BombhardE.M.etHerboldB， CriticalReviewsinToxicology35,783-835,2005)。
[0009] 仍然存在对用于将水溶性聚合物与蛋白质缀合的材料和方法的需要，所述缀合改 善所述蛋白质的药效学和/或药物动力学性质，同时最小化与各种试剂相关的成本并且最 小化对人类接受者的健康风险。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供用于使聚合物与蛋白质缀合的材料和方法，其改进所述蛋白质的药效 学和/或药物动力学性质，同时使与各种试剂相关的成本和当由亲核性催化剂催化缀合反 应时患者接受者的健康风险降至最小。在本发明的各种实施方案中，提供取代苯胺的替代 性催化剂。
[0012] 本公开还提供用于制备各种水溶性聚合物-氨氧基接头试剂的优化程序，所述接 头试剂可用于缀合如本文所述的治疗性蛋白质。最近的NMR研宄显示如果在室温下进行 PSA-氨氧基试剂的制备，则可能在PSA的还原端发生副反应。因此，在本公开的各种实施 方案中，在2°C-8°C之间的温度下进行新的方法。在一个实施方案中，根据本发明的方法在 4°C下制备PSA-氨氧基试剂。此外，本发明还涵盖在2°C-8°C之间的温度下使用色谱纯化 步骤（例如IEX)对所述试剂的纯化。当在2°C-8°C之间的温度下进行整个方法（化学反 应和通过IEX对缀合物的纯化）时，在PSA的还原端处的不想要副反应得到实质性减少。
[0013] 在根据本公开的一个实施方案中，提供了将水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化 型碳水化合物部分缀合的方法，其包括使氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物在 允许缀合的条件下接触；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚 乙二醇（PEG)、支链PEG、PolyPtXi.?(WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸 (PSA)、淀粉、羟烷基淀粉（HAS)、羟乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、 透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷（PAO)、聚烷 二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙 烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚（1-羟 甲基亚乙基羟甲基缩甲醛）（PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵（MPC);其 中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包括以下的方法制备：a)在允许在氧化型水溶性 聚合物与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型水溶性聚合物的 溶液与包含活性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于约1分钟与约24小时 之间的时段；介于约2°C与约8°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下； 从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)在介于约2°C与约8°C之间的温度下，通过 选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合 物；所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧 化：高碘酸钠（NaIO4)、四乙酸铅（Pb(OAc)4)和高钌酸钾（KRuCM);其中在所述氧化型碳水 化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联；并且其中所述肟键联形 成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲 酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和 对茴香胺。
[0014] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含氧化型 水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在4°C下孵育1小时。在另一个实施 方案中，提供上述方法，其中通过在4°C温度下的阴离子交换色谱来纯化含有活性氨氧基的 水溶性聚合物。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中氧化型水溶性聚合物为PSA并且 通过与NaIO4-起孵育进行氧化。
[0015] 在本公开的另一个实施方案中，提供了将水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型 碳水化合物部分缀合的方法，其包括使氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物在允 许缀合的条件下接触；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚乙 二醇（PEG)、支链PEG、P〇lyPE(丨 (WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸 (PSA)、淀粉、羟烷基淀粉（HAS)、羟乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、 透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷（PAO)、聚烷 二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙 烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚（1-羟 甲基亚乙基羟甲基缩甲醛）（PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵（MPC);其 中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包括以下的方法制备：a)在允许在水溶性聚合物 与活化的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件下将包含水溶性聚合物的溶液与包含活 性氨氧基的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段；介 于约22°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含 有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法 来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下 组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化：高碘酸钠（NaIO4)、四乙酸铅（Pb(OAc)4)和高 钌酸钾（KRuCM);其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基 之间形成肟键联；并且其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化： 邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、 间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
[0016] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含水溶性 聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接头在22°C下孵育2小时。在另一个实施方案 中，提供上述方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含水溶性聚合物的溶液和包含活性氨 氧基的氨氧基接头在22°C下孵育2小时；所述方法还包括将溶液的温度增加到介于约32°C与约37°C之间的温度并孵育另外12-24小时的步骤。在另一个实施方案中，提供上述方法， 其包括就在增加温度之前添加另外量的包含活性氨氧基的氨氧基接头的另外步骤。在另一 个实施方案中，提供上述方法，其中在22°C温度下通过选自由透析、超滤/渗滤（UF/DF)和 色谱组成的组的方法纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。在另一个实施方案中，提供上 述方法，其进一步包括在4°C下通过选自由透析、UF/DF或色谱组成的组的方法纯化含有活 性氨氧基的水溶性聚合物的步骤。
[0017] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质是选自由以下组成的 组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子（VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶（FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、 PAI-1、组织因子（TF)、ADAMTS13 蛋白酶、IL-Ia、IL-I0、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-Il、集落刺激因子-I(CSF-I)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、EPO、 干扰素 _a(IFN-a)、复合干扰素、IFN-13、IFN-y、IFN-w、IL-7、IL-8、IL-9、IL-KKIL-12、 IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、 IL-31、IL-32a、IL-33、血小板生成素（TPO)、Ang-I、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管生成素样 多肽I(ANGPTL1)、血管生成素样多肽2 (ANGPTL2)、血管生成素样多肽3 (ANGPTL3)、血管生 成素样多肽4(ANGPTL4)、血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、 血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管内皮生长因子（VEGF)、血管生成素、活化素 A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态 发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋 白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、 骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、 骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫 状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导 的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2a、细胞因子诱导的 嗜中性粒细胞趋化因子20、0内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮 调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成 纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子 8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞 生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成 纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长 因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营 养因子受体a1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体a2、生长相关蛋白、生长相关蛋 白a、生长相关蛋白0、生长相关蛋白Y、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细 胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰 岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白 血病抑制因子受体a、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、 神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生 长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板 源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子 受体a、血小板源性生长因子受体|3、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子（SCF)、干细胞 因子受体、TNF、TNFO、TNF1、TNF2、转化生长因子a、转化生长因子0、转化生长因子0 1、 转化生长因子0 1. 2、转化生长因子0 2、转化生长因子0 3、转化生长因子0 5、潜伏转化 生长因子M、转化生长因子e结合蛋白I、转化生长因子e结合蛋白II、转化生长因子 0结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子 受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白（PUP)、胰岛素、植物凝集素 蓖麻毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子、 IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、a-半乳糖苷酶、0 -半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激 素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝 血酶、瘦素、修美乐（Humira)(阿达木单抗（adalimumab))、普罗利亚（Prolia)(迪诺赛单 抗（denosumab))、恩利（Enbrel)(依那西普（etanercept))、表1中的蛋白质、或其生物活 性片段、衍生物或变体。
[0018] 在又一实施方案中，提供上述方法，其中在与活化的水溶性聚合物接触之前，包含 初始浓度介于约〇. 3mg/ml与约3.Omg/ml之间的治疗性蛋白质的溶液被调整至介于约5. 0 与约8. 0之间的pH值。在一个实施方案中，治疗性蛋白质的初始浓度为约I.Omg/ml并且 pH为约6. 0。
[0019] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质接触期望的过量浓度的 活化的水溶性聚合物，其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度与约300摩尔浓度过量之间。在 一个实施方案中，过量浓度为约50倍摩尔浓度过量。
[0020] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质在包含以下的条件下与 活化的水溶性聚合物一起孵育：介于约0. 5小时与约24小时之间的时段；介于约2°C与约 37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在一个实施方案中，所述条 件包含约120分钟的时段、约22°C的温度、不存在光；和在搅拌下。
[0021] 在另一个实施方案中，提供一种上述方法，其中亲核性催化剂在包含以下的条件 下以使得亲核性催化剂的最终浓度介于约I.OmM与约50mM之间的量添加：介于约0. 1分钟 与约30分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅 拌或不搅拌下。在一个实施方案中，亲核性催化剂的最终浓度为约10mM，并且所述条件包含 至多约15分钟的时段、约22°C的温度、不存在光；和在搅拌下。
[0022] 在又一实施方案中，提供上述方法，其中氧化剂在包含以下的条件下以使得氧化 剂的最终浓度介于约50yM与约1000yM之间的量添加：介于约0. 1分钟与120分钟之间 的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在 一个实施方案中，氧化剂的最终浓度为约400yM，并且所述条件包含约10分钟的时段、约 22 °C的温度、不存在光和在搅拌下。
[0023] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化 型碳水化合物部分的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲 硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亚硫酸氢钠（Na2S2O5)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲 酚、咪唑和其组合；其中所述淬灭剂在包含以下的条件下以使得淬灭剂的最终浓度介于约 ImM与约IOOmM之间的量添加：介于约5分钟与约120分钟之间的时段；介于约2°C与约 37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。在一个实施方案中，淬灭剂 为L-半胱氨酸。在又一实施方案中，L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为约IOmM并且所述 条件包含约60分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下。
[0024] 在另一个实施方案中，提供一种上述方法，其包括：a)第一步骤，其包括将包含治 疗性蛋白质的溶液的pH值调整至介于约5. 0与约8. 0之间的pH值，其中治疗性蛋白质浓 度介于约0. 3mg/ml与约3.Omg/ml之间；b)第二步骤，其包括氧化治疗性蛋白质上的一个 或多个碳水化合物，其中氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使 得最终浓度介于约50yM与约1000yM之间：介于约0. 1分钟与约120分钟之间的时段；介 于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；c)第三步骤， 其包括在包含以下的条件下使治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接 触，其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度过量与约300摩尔浓度过量之间：介于约0. 5小时 与约24小时之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅 拌或不搅拌下；d)第四步骤，其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中，其中 所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度介于约ImM与约50mM之间：介 于约0. 1分钟与约30分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存 在下；和在搅拌或不搅拌下；e)第五步骤，其中治疗性蛋白质在允许活化的水溶性聚合物 与治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与活化的水溶性聚合物 和亲核性催化剂一起孵育，所述条件包含介于约〇. 5小时与约24小时之间的时段、介于约 2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；和f)第六步骤，其 中所述第五步骤中水溶性聚合物与治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合 通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、 Na2S205(偏亚硫酸氢钠）、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合；其中所 述淬灭剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为约ImM和约IOOmM:介于约5分钟与 约120分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌 或不搅拌下。在另一个实施方案中，第一步骤中治疗性蛋白质的初始浓度为约lmg/ml并且 pH为约6. 0 ;其中第二步骤中氧化剂的最终浓度为约400yM，并且第五步骤中的条件包含 约10分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下；其中第三步骤中的过量浓度为约 50摩尔浓度过量；其中第三步骤中的条件包含约15分钟的时段、约22°C的温度、不存在光 和在搅拌下；其中第四步骤中亲核性催化剂的最终浓度为约10mM，并且第四步骤中的条件 包含约15分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下；其中第五步骤中将治疗性蛋 白质与活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育的条件包含约2小时的时段；约22°C 的温度；不存在光；和在搅拌下；并且其中第六步骤中的淬灭剂为L-半胱氨酸；并且其中 L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为约IOmM并且第六步骤中的条件包含约60分钟的时段、 约22°C的温度、不存在光和在搅拌下。在又一实施方案中，水溶性聚合物为PSA。在一个实 施方案中，水溶性聚合物为PEG。在另一个实施方案中，水溶性聚合物为HES。在又一实施 方案中，水溶性聚合物为HAS。在另一个实施方案中，PSA由约10-300个唾液酸单元构成。 在另一个实施方案中，治疗性蛋白质为FIX。在另一个实施方案中，治疗性蛋白质为FVIIa。 在另一个实施方案中，治疗性蛋白质为FVIII。
[0025] 在另一个实施方案中，提供一种上述方法，其中氧化剂为高碘酸钠（NaIO4)。
[0026] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部 分位于凝血蛋白的活化肽中。
[0027] 在另一个实施方案中，提供上述方法，其中PSA包含选自由以下组成的组的活化 的氨氧基接头：a)下式的3_氧杂-戊烧_1，5-二氧基胺接头：
【权利要求】
1. 一种使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括 在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触； 所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚乙二醇（PEG)、支链PEG、PolyPEG?(WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸（PSA)、淀粉、轻烧 基淀粉（HAS)、羟乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软 骨素、硫酸皮肤素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷（PA0)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇 (PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚 噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚（1-羟甲基亚乙基羟甲基缩 甲醛）（PHF)、2_甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸铵（MPC); 其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过以下方法制备，所述方法包括： a) 在允许在氧化型水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键 联的条件下将包含所述氧化型水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所 述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约2°C与约8°C之间的温度；在光存 在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b) 在介于约2°C与约8°C之间的温度下，通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组 的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物； 所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而 氧化：高碘酸钠（NaI04)、四乙酸铅（Pb(0Ac)4)和高钌酸钾（KRu04); 其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟 键联；并且 其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间 氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯 胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述氧化型水溶 性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在4°C下孵育1小时。
3. 根据权利要求3所述的方法，其中通过在4°C温度下的阴离子交换色谱来纯化所述 含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述氧化型水溶性聚合物为PSA并且通过与NaI04 一起孵育而氧化。
5. -种使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括 在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触； 所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚乙二醇（PEG)、支链PEG、PolyPEG?(WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸（PSA)、淀粉、轻 烷基淀粉（HAS)、羟乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸 软骨素、硫酸皮肤素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷（PA0)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇 (PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚 噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚（1-羟甲基亚乙基羟甲基缩 甲醛）（PHF)、2_甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸铵（MPC); 其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过以下方法制备，所述方法包括： a) 在允许在水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条 件下将包含所述水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介 于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约22°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在 下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b) 通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的 水溶性聚合物； 所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而 氧化：高碘酸钠（NaI04)、四乙酸铅（Pb(OAc)4)和高钌酸钾（KRu04); 其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟 键联；并且 其中所述肟键联形成是由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：苯胺、邻氨基苯 甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、 对甲苯胺、邻甲氧基苯胺、间甲氧基苯胺和对甲氧基苯胺。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述水溶性聚合 物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在22°C下孵育2小时。
7. 根据权利要求5所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述水溶性聚合 物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在22°C下孵育2小时；所述方法还包括 将所述溶液的温度增加到介于约32°C与约37°C之间的温度并孵育另外12-24小时的步骤。
8. 根据权利要求7所述的方法，其包括就在增加所述温度之前添加另外量的包含活性 氨氧基的氨氧基接头的另外步骤。
9. 根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其中在22°C温度下通过选自由透析、超滤 /渗滤（UF/DF)和色谱组成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
10. 根据权利要求9所述的方法，其还包括在4°C下通过选自由透析、UF/DF或色谱组 成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步骤。
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成 的组：因子^$^)、因子￥111$￥111)、因子￥11 &$￥11&)、冯威勒布兰德因子（胃?)、因子 FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶（FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、 PAI-1、组织因子（TF)、ADAMTS13 蛋白酶、IL-1a、IL-1 0、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-11、集落刺激因子-1 (CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、EPO、 干扰素 _a (IFN-a)、复合干扰素、IFN-13、IFN-y、IFN-w、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、 IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、 IL-31、IL-32a、IL-33、血小板生成素（TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管生成素样 多肽1 (ANGPTL1)、血管生成素样多肽2 (ANGPTL2)、血管生成素样多肽3 (ANGPTL3)、血管生 成素样多肽4(ANGPTL4)、血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、 血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管内皮生长因子（VEGF)、血管生成素、活化素 A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态 发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋 白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、 骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、 骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫 状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导 的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2a、细胞因子诱导的 嗜中性粒细胞趋化因子2 0、0内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮 调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成 纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子 8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞 生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成 纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长 因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营 养因子受体a1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体a2、生长相关蛋白、生长相关蛋 白a、生长相关蛋白0、生长相关蛋白丫、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细 胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰 岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白 血病抑制因子受体a、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、 神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生 长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板 源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子 受体a、血小板源性生长因子受体|3、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子（SCF)、干细胞因 子受体、TNF、TNFO、TNF1、TNF2、转化生长因子a、转化生长因子0、转化生长因子0 1、转 化生长因子0 1. 2、转化生长因子0 2、转化生长因子0 3、转化生长因子0 5、潜伏转化生长 因子0 1、转化生长因子0结合蛋白I、转化生长因子0结合蛋白II、转化生长因子0结 合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体 II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白（PUP)、胰岛素、植物凝集素蓖麻 毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、 IgE、IgM、IgA和IgD、a-半乳糖苷酶、0 -半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激素、雌激 素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦 素、修美乐（阿达木单抗）、普罗利亚（迪诺赛单抗）、恩利（依那西普）、表1中的蛋白质、 或其生物活性片段、衍生物或变体。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中在与所述活化的水溶性聚合物接触之前，包含 初始浓度介于约〇. 3mg/ml与约3.Omg/ml之间的所述治疗性蛋白质的溶液被调整至介于约 5.0与约8.0之间的pH值。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的初始浓度为约1.Omg/ml并 且所述pH值为约6.0。
14. 根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是与期望的过量浓度的活化 的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度与约300摩尔浓度过量之间。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述过量浓度为约50倍摩尔浓度过量。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中所述治疗性蛋白质在包含以下的条件下与所述 活化的水溶性聚合物一起孵育：介于约0. 5小时与约24小时之间的时段；介于约2°C与约 37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述条件包含约120分钟的时段、约22°C的温 度、不存在光；和在搅拌下。
18. 根据权利要求11所述的方法，其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下以使得 亲核性催化剂的最终浓度介于约1.OmM与约50mM之间的量添加：介于约0. 1分钟与约30 分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅 拌下。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述亲核性催化剂的最终浓度为约10mM，并且 所述条件包含至多约15分钟的时段、约22°C的温度、不存在光；和在搅拌下。
20. 根据权利要求11所述的方法，其中所述氧化剂在包含以下的条件下以使得氧化剂 的最终浓度介于约50yM与约1000yM之间的量添加：介于约0. 1分钟与120分钟之间的 时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述氧化剂的最终浓度为约400yM，并且所述 条件包含约10分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下。
22. 根据权利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的氧 化型碳水化合物部分的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、 甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亚硫酸氢钠（Na2S205)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲 酚、咪唑和其组合； 其中所述淬灭剂在包含以下的条件下以使得淬灭剂的最终浓度介于约ImM与约lOOmM之间的量添加：介于约5分钟与约120分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度； 在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述淬灭剂为L-半胱氨酸。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为约 10mM并且所述条件包含约60分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下。
25. 根据权利要求11所述的方法，其包括： a) 第一步骤，其包括将包含所述治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至介于约5. 0与约 8. 0之间的pH值，其中所述治疗性蛋白质浓度介于约0? 3mg/ml与约3. 0mg/ml之间； b) 第二步骤，其包括氧化所述治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物，其中所述氧 化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度介于约50yM 与约1000yM之间：介于约0. 1分钟与约120分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的 温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下； c) 第三步骤，其包括在包含以下的条件下使所述治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活 化的水溶性聚合物接触，其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度过量与约300摩尔浓度过量 之间：介于约〇. 5小时与约24小时之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存 在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下； d) 第四步骤，其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中，其中所述亲核性 催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度介于约ImM与约50mM之间：介于约0. 1分 钟与约30分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在 搅拌或不搅拌下； e) 第五步骤，其中所述治疗性蛋白质在允许所述活化的水溶性聚合物与所述治疗性蛋 白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与所述活化的水溶性聚合物和亲核 性催化剂一起孵育，所述条件包含介于约〇. 5小时与约24小时之间的时段、介于约2°C与约 37°C之间的温度；在光存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；和 f) 第六步骤，其中所述第五步骤中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的一个或多 个氧化型碳水化合物的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止：L-半胱氨酸、 甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、Na2S205 (偏亚硫酸氢钠）、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲 酚、咪唑和其组合；其中所述淬灭剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为约ImM和 约lOOmM:介于约5分钟与约120分钟之间的时段；介于约2°C与约37°C之间的温度；在光 存在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述第一步骤中所述治疗性蛋白质的初始浓度 为约lmg/ml并且所述pH值为约6. 0 ; 其中所述第二步骤中所述氧化剂的最终浓度为约400yM，并且所述第五步骤中的条件 包含约10分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下； 其中所述第三步骤中的过量浓度为约50摩尔浓度过量；其中所述第三步骤中的条件 包含约15分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下； 其中所述第四步骤中所述亲核性催化剂的最终浓度为约10mM，并且所述第四步骤中的 条件包含约15分钟的时段、约22°C的温度、不存在光和在搅拌下； 其中所述第五步骤中将所述治疗性蛋白质与所述活化的水溶性聚合物和亲核性催化 剂一起孵育的条件包含约2小时的时段；约22°C的温度；不存在光；和在搅拌下；并且 其中所述第六步骤中的淬灭剂为L-半胱氨酸；并且其中所述L-半胱氨酸添加成使得 最终浓度为约10mM并且所述第六步骤中的条件包含约60分钟的时段、约22°C的温度、不存 在光和在搅拌下。
27. 根据权利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物为PSA。
28. 根据权利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物为PEG。
29. 根据权利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物为HES。
30. 根据权利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物为HAS。
31. 根据权利要求27所述的方法，其中所述PSA由约10-300个唾液酸单元构成。
32. 根据权利要求11-31中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FIX。
33. 根据权利要求11-31中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FVIIa。
34. 根据权利要求11-31中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为FVIII。
35. 根据权利要求11-34中任一项所述的方法，其中所述氧化剂为高碘酸钠（NalO4)。
36. 根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的氧化型碳水 化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。
37. 根据权利要求27所述的方法，其中所述PSA包含选自由以下组成的组的活化的氨 氧基接头： a)下式的3_氧杂-戊烧_1，5-二氧基胺接头：
其中所述PSA通过与氧化剂一起孵育而氧化以在所述PSA的非还原端形成末端醛基。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述氨氧基接头为3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基 胺。
39. 根据权利要求11-38中任一项所述的方法，其中所述亲核性催化剂以介于约ImM与 约50mM之间的浓度提供。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述亲核性催化剂为间甲苯胺。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述间甲苯胺以约10mM的浓度存在于所述缀合 反应中。
42. 根据权利要求11-41中任一项所述的方法，其还包括纯化所述缀合的治疗性蛋白 质的步骤。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质通过选自由色谱、过 滤和沉淀组成的组的方法来纯化。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述色谱选自由以下组成的组：疏水性相互作 用色谱（HIC)、离子交换色谱（IEC)、尺寸排阻色谱（SEC)、亲和色谱和反相色谱。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中于色谱加载步骤和色谱洗涤步骤中使用抗离液 盐。
46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述色谱在柱中进行。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述柱包含选自由苯基-琼脂糖FF和丁基-琼 脂糖FF组成的组的色谱树脂。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中所述树脂以介于约5cm与约20cm之间的床高度 存在于所述柱中。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述床高度为约10cm。
50. 根据权利要求46所述的方法，其包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向设定为 向上流动并且其中流速介于约0. 2cm/min与约6. 7cm/min之间。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述流速为约2cm/min。
52. 根据权利要求47-52中任一项所述的方法，其包括一个或多个洗脱步骤，其中流动 方向设定为向下流动并且其中流速介于约〇.lcm/min与约6. 7cm/min之间。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述流速为约lcm/min。
54. 根据权利要求42-53中任一项所述的方法，其还包括通过超滤/渗滤（UF/DF)浓缩 所述缀合的治疗性蛋白质。
55. 根据权利要求42-54中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质的最终浓度介 于约0. 5mg/ml与约3mg/ml之间。
56. 根据权利要求42-55中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质包含约5个至约 11个水溶性聚合物部分。
57. 根据权利要求11所述的方法，其中所述缀合的治疗性蛋白质使用色谱纯化；其中 于加载步骤和洗涤步骤使用抗离液盐；所述方法包括一个或多个洗涤步骤，其中流动方向 设定为向上流动并且其中流速介于约〇. 2cm/min与约6. 7cm/min之间；和一个或多个洗脱 步骤，其中流动方向设定为向下流动并且其中流速介于约〇. 2cm/min与约6. 7cm/min之间； 所述方法还包括通过超滤/渗滤（UF/DF)浓缩所述缀合的治疗性蛋白质。
58. 根据权利要求51所述的方法，其中所述色谱为疏水性相互作用色谱（HIC);其中 所述一个或多个洗涤步骤流速为约2cm/min;并且其中所述一个或多个洗脱步骤流速为约 lcm/min〇
59. -种修饰的治疗性蛋白质，其通过根据权利要求1至58中任一项所述的方法产生。
60. -种制备含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括： a) 在允许在氧化型水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键 联的条件下将包含所述氧化型水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所 述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约2°C与约8°C之间的温度；在光存 在或不存在下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b) 在介于约2°C与约8°C之间的温度下，通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组 的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物； 所述水溶性聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇（PEG)、支链PEG、P〇lyPEG?(WarwickEffectPolymers;Coventry,UK)、聚唾液酸（PSA)、轻烧基淀粉（HAS)、轻乙基 淀粉01ES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀 粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷（PA0)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑 P林、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙 烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚（1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛）（PHF)、 2-甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸铵（MPC); 从而在所述水溶性聚合物与所述氨氧基接头之间形成肟键联。
61. 根据权利要求60所述的方法，其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核 性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰 胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
62. 根据权利要求60所述的方法，其中所述水溶性聚合物为PSA。
63. 根据权利要求60所述的方法，其中所述水溶性聚合物为PEG。
64. 根据权利要求60所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述氧化型水 溶性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在4°C下孵育1小时。
65. 根据权利要求64所述的方法，其中通过在4°C温度下的阴离子交换色谱来纯化所 述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
66. -种制备含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括： a)在允许在水溶性聚合物与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条 件下将包含所述水溶性聚合物的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含介 于约1分钟与约24小时之间的时段；介于约22°C与约37°C之间的温度；在光存在或不存在 下；和在搅拌或不搅拌下；从而形成所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b)通过选自由色谱、过滤、透析和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的 水溶性聚合物； 从而在所述水溶性聚合物与氨氧基接头之间形成肟键联。
67. 根据权利要求66所述的方法，其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核 性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰 胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
68. 根据权利要求66所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述水溶性聚 合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在22°C下孵育2小时。
69. 根据权利要求66所述的方法，其中在光不存在下，在搅拌下将包含所述水溶性聚 合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接头在22°C下孵育2小时；所述方法还包 括将所述溶液的温度增加到介于约32°C与约37°C之间的温度以及孵育另外12-24小时的 步骤。
70. 根据权利要求69所述的方法，其包括就在增加所述温度之前添加另外量的包含活 性氨氧基的氨氧基接头的另外步骤。
71. 根据权利要求66所述的方法，其中在22°C温度下通过选自由透析、超滤/渗滤 (UF/DF)和色谱组成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
72. 根据权利要求71所述的方法，其还包括在4°C下通过选自由透析、UF/DF或色谱组 成的组的方法纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步骤。
73. -种制备PSA-氨氧基试剂氨氧基的方法，其包括： a) 在允许在氧化型PSA与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条件 下将包含所述氧化型PSA的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含1小时 的时段；4°C的温度；在光不存在下，和在搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的PSA;和 b) 在4°C的温度下通过阴离子交换色谱纯化所述含有活性氨氧基的PSA; 所述活化的氨氧基接头为下式的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺接头：
从而在所述PSA与所述氨氧基接头之间形成肟键联。
74. -种制备PSA-氨氧基试剂氨氧基的方法，其包括： a) 在允许在非氧化型PSA与包含活性氨氧基的氨氧基接头之间形成稳定肟键联的条 件下将包含所述非氧化型PSA的溶液与所述活化的氨氧基接头一起孵育，所述条件包含2 小时的时段；22°C的温度；在光不存在下，和在搅拌下；从而形成含有活性氨氧基的PSA;和 b) 在22°C的温度下通过透析纯化所述含有活性氨氧基的PSA; 所述活化的氨氧基接头为下式的3-氧杂-戊烷-1，5-二氧基胺接头：
从而在所述非氧化型PSA与所述氨氧基接头之间形成肟键联。
75.-种使水溶性聚合物与血凝蛋白的氧化型碳水化合物部分缀合的方法，其包括在 允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触； 所述凝血蛋白选自由以下组成的组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子（VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子 XII(FXII)、凝血酶（FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子（TF)和ADAMTS13蛋白酶 或其生物活性片段、衍生物或变体； 所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且选自由以下组成的组：聚乙二醇（PEG)、支链PEG、聚唾液酸（PSA)、碳水化合物、多糖、普鲁兰糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮 肤素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷（PAO)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑 P林、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙 烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚（1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛）（PHF)、 2-甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸铵（MPC);并且 所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而 氧化：高碘酸钠（NaI04)、四乙酸铅（Pb(OAc)4)和高钌酸钾（KRu04);其中在所述氧化型碳 水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联。
【文档编号】A61K47/48GK104487095SQ201380037823
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2012年5月16日
【发明者】J·西克曼, S·海德尔, H·罗滕斯滕, P·图雷切克 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特保健股份有限公司