用于将gdnf和bdnf递送至中枢神经系统的融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白，其包括充当穿过血脑屏障的载体的肽载体如angiopep-2，连接于胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、或相关分子，如它们的类似物或片段。本发明的化合物可以用来治疗其中期望增加神经元存活或生长的任何疾病，例如神经变性疾病如帕金森病或肌萎缩侧索硬化。能够利用所述化合物进行治疗的其他疾病包括精神分裂症和抑郁症。
【专利说明】用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白
[0001]本申请是申请日为2010年6月11日的题为“用于将⑶NF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白”的中国专利申请号201080031759.6的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种包括肽载体和胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)或脑源性神经营养因子(BDNF)的轭合物(结合物或共轭物，conjugate)，及其用途。
【背景技术】
[0003]与神经元损失或损伤相关的疾病是严重病症并且在世界范围内影响数百万人。尽管疗法如GDNF在治疗神经变性病如帕金森病中具有前景，但是在本发明之前，这样的疗法至脑的递送由于活性剂不能穿过(跨越或越过，cross)血脑屏障而是复杂的。事实上，涉及用于帕金森病的GDNF疗法的先前临床试验要求使用将药剂直接注入脑中，并且用于治疗肌萎缩侧索硬化的BDNF试验涉及药剂的胸内注射。这些方法是繁琐且困难的。
[0004]由于对于其中增加神经元存活或生长是有益的各种各样的疾病的治疗性治疗存在需要，所以期望具有穿过血脑屏障的能力的基于⑶NF和BDNF的治疗剂。
【发明内容】
[0005]现在本发明的发明人开发了这样的化合物，其包括轭合至⑶NF、BDNF、或相关分子的肽载体(peptide vector)。这些化合物可以例举包括⑶NF或BDNF序列和Angiopep-2序列的融合蛋白。在某些实施方式中，这些化合物能够穿过血脑屏障，并因此可以用作治疗具有神经变性疾病或神经元受损的对象(个体，subject)的治疗剂。
[0006]因此，在第一方面 ，本发明的特征在于一种包括下式的化合物
[0007]A-X-B
[0008]其中A是肽载体；B是与以下基本上相同(具有统一性的，identical)的多肽:(i)GDNF、其具有至少一种GDNF活性的片段、或GDNF类似物(例如本文中描述的任一种)；或
(ii)BDNF、其具有至少一种BDNF活性的片段、或BDNF类似物(例如本文中描述的任一种)；以及X是结合A与B的连接物(接头，linker)(例如本文中描述的任一种)。该化合物可以能够(例如有效地)穿过血脑屏障。该化合物可以包括⑶NF的成熟形式(例如亚型I的氨基酸118-211)或BDNF的成熟形式(例如亚型A的氨基酸129-247)。⑶NF片段可以包括或可以是亚型I的氨基酸78-211。该化合物可以进一步包括标签(tag)如His标签，或切割位点如凝血酶切割位点。在某些是实施方式中，该化合物具有图2或图14所示的结构。在某些实施方式中，X是肽键或X是至少一个氨基酸，其中A和B各自通过肽键共价地键接于X。在某些实施方式中，连接物是柔性连接物(例如(GGGGS)n，其中η为1、2或3)、刚性连接物(例如PAPAP和(PT)nP，其中η为2、3、4、5、6或7)，或者α -螺旋连接物(例如A(EAAAK)ηΑ，其中η为1、2、3、4或5)。肽载体可以存在于⑶NF、BDNF或相关分子的N-或C-端。本发明的特征还在于一种编码该化合物的核酸分子，其中X是肽键、氨基酸或肽连接物。该核酸可以是载体的一部分，并且该核酸可以可操作地(operably)连接于启动子。本发明的特征还在于一种通过在细胞中表达由所述载体编码的多肽，并纯化该多肽而制备一种化合物的方法。本发明的特征还在于一种通过在固体支撑物(固体载体，solid support)上合成所述化合物而制备该化合物的方法。
[0009]在另一方面，本发明的特征在于一种治疗(例如预防地)具有神经变性病或神经元受损或损伤的对象(例如人)的方法，通过给予该对象有效量的本发明的化合物。神经变性病可以选自由多聚谷氨酰胺序列延长病(多聚谷氨酰胺扩张紊乱，polyglutamineexpansion disorder)、脆性X染色体综合征、脆性XE精神发育迟缓、弗里德赖希共济失调症(Friedreich’ sataxia)、营养不良性肌强直(myotonic dystrophy)、8型脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia type8)和12型脊髓小脑性共济失调、亚历山大病(Alexander disease)、阿耳拍病(Alper，s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’ sdisease)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、运动失调性毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia)、Batten 病(Batten disease, SVSB 四氏病(SpieImeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease))、卡纳万病(Canavan disease)、Cockayne综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性(Corticobasal degeneration)、克雅二氏病(Ceutzfeldt-Jakob disease)、缺血性中风(ischemia stroke)> 克拉伯病(Krabbedisease)、Lewy体痴呆(Lewy body dementia)、多发性硬化、多系统萎缩(multiple systematrophy)> 帕金森病、佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、匹克病(Pick，sdisease)、原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis)、植烧酸忙积症(Refsum，sdisease)、Sandhoff 病(Sandhoff disease)、谢耳德病(Schilder，s disease)、脊髓损伤(spinal cord injury)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)、SRO 三氏病(Steele-Richardson-Olszewski disease)、以及脊髓瘦(Tabes dorsalis)组成的组。多聚谷氨酰胺复发病(polyglutamine repeat disease)可以是亨廷顿氏病(HD)、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(dentatorubropallidoluysian atrophy)、肯尼迪病(Kennedy，sdisease)(也称为脊髓延髓肌萎缩(spinobulbar muscular atrophy)),或选自由I型、2型、3型(马-约病(Machado-Josep`h disease))、6型、7型、和17型组成的组中的脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia)。神经元损伤可以由缺血性中风、出血性中风(hemorrhagic stroke)、或脊髓受损引起。能够利用本发明的化合物治疗的其他疾病包括抑郁症和精神分裂症(schizophrenia)。
[0010]在以上这些方面的特定实施方式中，A是Angiop印-2 (SEQ ID N0:97)，X是肽键，而B是h⑶NF78_211，其中A通过X结合于B的N-端；A是Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X是肽键，而B是h⑶NF78_211,其中A通过X连接于B的C-端；A是反向Angiopep-2 (reversedAngiopep-2)(SEQ ID NO: 117)，X是肽键，而B是h⑶NF78_211，其中A通过X连接于B的N-端；A 是 Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X 是(GGGGS)2，而 B 是 h⑶NF78_211，其中 A 通过 X 连接于 B的N-端汸是么叩化口印-2 (SEQID N0:97)，X是PAPAP，而B是h⑶NF78_211，其中A通过X连接于 B 的 N-端；或 A 是 Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X 是 A(EAAAK)2A，而 B 是 h⑶NF78-211，其中A通过X连接于B的N-端。
[0011]在以上方面的任一个中，肽载体可以是与表1列出的序列中的任一个基本相同的多肽、或其片段。在某些实施方式中，肽载体具有Angiop印-1 (SEQ ID N0:67)、Angiopep-2 (SEQ ID N0:97)、Angiopep-3 (SEQ ID NO: 107)、Angiopep_4a (SEQ IDNO: 108)、Angiopep_4b (SEQ ID NO: 109)、Angiopep-5 (SEQ ID NO: 110)、Angiopep-6(SEQ ID NO: 111)、Angiop印-7 (SEQ ID NO: 112)、或反向 Angiop印-2 (SEQ ID NO: 117)的序列。本发明的肽载体或化合物可以被有效地输送到特定细胞型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任一种、两种、二种、四种或五种)，或可以有效地穿过哺乳动物BBB (例如Angiopep-1、-2、-3、-4a> -4b> -5、以及-6)。在另一实施方式中,肽载体或化合物能够进入特定细胞型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任一种、两种、三种、四种或五种)，但不会有效地穿过BBB (例如包括Angiop印-7的轭合物)。肽载体可以为任意长度，例如至少6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200、或 500 个氨基酸，或者是这些数值之间的任意范围。在某些实施方式中，肽载体的长度为10~50个氨基酸。多肽可以通过重组遗传技术或化学合成生产。
[0012]表1:示例性肽载体
【权利要求】
1.一种包含下式的化合物:
A-X-B 其中，A包括与选自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向Angiop印_2(SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQ ID NO:67)、cys_Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113)和 Angiopep-2-cys (SEQID NO: 114)组成的组中的序列至少70%相同的氨基酸序列；B是与以下基本相同的多肽: ⑶NF、其具有至少一种⑶NF活性的片段、或⑶NF类似物； 以及 X是将A结合于B的连接物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物能够穿过血脑屏障。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述B包括GDNF的成熟形式。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述序列同一性为至少90%。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中，A包括选自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向 Angiopep-2 (SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQ ID NO:67)、cys-Angiopep-2 (SEQID NO: 113)和 Angiopep-2-cys (SEQ ID NO: 114)组成的组中的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中，A由选自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向 Angiopep-2 (SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQID NO:67)、cys-Angiopep-2 (SEQ IDNO: 113)和Angiopep·-2-cys (SEQ ID NO: 114)组成的组中的氨基酸序列构成。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中，X是肽键。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中，X是至少一个氨基酸；并且A和B各自通过肽键共价键接于X。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，X选自由以下构成的组:(GGGGS)n，其中η为1、2 或 3 ;PAPAP ; (PT)pP，其中 ρ 为 2、3、4、5、6 或 7 ;以及 A (EAAAK) qA，其中 q 为 1、2、3、4 或 5。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ ID N0:97);X是肽键;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通过X结合于B的N-端。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中，A是Angiopep-2(SEQ ID N0:97);X是肽键;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通过X结合于B的C-端。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中，A是反向Angiop印-2(SEQ ID N0:117);X是肽键；以及B是h⑶NF78_211 ;其中A通过X结合于B的N-端。
13.根据权利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ ID N0:97);X是(GGGGS) 2 ;以及B是h⑶NF78-211 ;其中A通过X结合于B的N-端。
14.根据权利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQID NO:97);X是PAPAP ;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通过X结合于B的N-端。
15.根据权利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ IDN0:97);X是A (EAAAK) 2A ;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通过X结合于B的N-端。
16.一种编码根据权利要求7-15中任一项所述的化合物的核酸分子。
17.一种载体，包括根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述核酸可操作地连接于启动子。
18.一种制备根据权利要求7或8所述的化合物的方法，所述方法包括在细胞中表达由根据权利要求17所述的载体编码的多肽，以及纯化所述多肽。
19.一种制备根据权利要求7或8所述的化合物的方法，所述方法包括在固体载体上合成所述化合物。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物在制备用于治疗具有神经变性疾病的对象的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述神经变性疾病选自由以下组成的组:多聚谷氨酰胺序列延长病、脆性X染色体综合征、脆性XE精神发育迟缓、弗里德赖希共济失调症、营养不良性肌强直、8型脊髓小脑性共济失调、和12型脊髓小脑性共济失调、亚历山大病、阿耳珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、运动失调性毛细血管扩张症、Batten病(SVSB四氏病)、卡纳万病、Cockayne综合征、皮质基底节变性、克雅二氏病、缺血性中风、克拉伯病、Lewy体痴呆、多发性硬化、多系统萎缩、帕金森病、佩-梅二氏病、匹克病、原发性侧索硬化、植烷酸贮积症、SandhofT病、谢耳德病、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、SRO三氏病以及脊髓痨。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述多聚谷氨酰胺复发病是亨廷顿氏病(HD)、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、肯尼迪病(也称为脊髓延髓肌萎缩)，或选自由I型、2型、3型(马-约病)、6型、7型和17型组成的组中的脊髓小脑性共济失调。
23.根据权利要求20所述的用途，其中，所述对象是人。
24.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物在制备用于治疗具有神经元损伤的对象的药物中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述神经元损伤是由缺血性中风、出血性中风或脊髓受损引起的。
26.根据权利要求24 所述的用途，其中，所述对象是人。
27.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物在制备用于治疗具有抑郁症的对象的药物中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途，其中，所述对象是人。
29.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物在制备用于治疗具有精神分裂症的对象的药物中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中，所述对象是人。
【文档编号】A61P25/18GK103819564SQ201410030902
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2010年6月11日 优先权日:2009年6月11日
【发明者】米歇尔·德默勒, 多米尼克·波依温, 让-保罗·卡斯泰恩 申请人:安吉奥开米公司