姜叶三七及其提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用的制造方法与工艺

本发明涉及姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油的新用途，即在制备治疗和/或预防癌症药物方面的新用途，特别是在制备治疗和/或预防肺癌药物方面的新用途。

背景技术：
癌症，亦称恶性肿瘤(Malignantneoplasm)，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。恶性肿瘤由于分化不成熟、生长较快，浸润破坏器官的结构和功能，并可发生转移，因而对机体影响严重。恶性肿瘤除可引起与上述良性肿瘤相似的局部压迫和阻塞症状外，还可有发热、顽固性疼痛，晚期可出现严重消瘦、乏力、贫血和全身衰竭的状态。异位内分泌综合征：一些非内分泌腺肿瘤能产生和分泌激素或激素类物质，引起内分泌紊乱的临床症状，这种肿瘤称为异位内分泌性肿瘤，其所引起的临床症状称为异位内分泌综合征。此类肿瘤多为恶性肿瘤，以癌居多，如胃癌、肝癌、结肠癌，也可见于肉瘤如纤维肉瘤、平滑肌肉瘤等。此外APUD系统(弥散性神经内分泌系统)的肿瘤，也可产生生物胺或多肽激素，如类癌、嗜铬细胞瘤等。由于肿瘤的产物(包括异位激素产生)或异常免疫反应(包括交叉免疫、自身免疫和免疫复合物沉积等)引起内分泌、神经、造血、消化、骨关节、肾脏、皮肤等系统发生病变，引起相应的临床症状，称为副肿瘤综合症状。肺癌是肺部最常见的恶性肿瘤。世界卫生组织调查报告，许多国家和地区，肺癌的发病率占恶性肿瘤的首位。男性多于女性，男女之比约为4-8:1。城市多于农村。年龄多在40岁以上，少数病人在40岁以下。绝大多数的肺癌起源于支气管粘膜上皮，故称支气管肺癌。肺癌是它简称或通常称呼。肺癌的治疗以外科手术切除为首选。原发癌肿局限在支气管肺内，尚未发生远处转移和淋巴结转移时，手术后5年生存率可达50％以上。但多数病人在第一次来外科就诊时病变已属晚期，多数病人已失去根治性切除之机会，因此，早期发现，早期诊断及早期治疗仍是当前医者的重要任务和责任。癌症治疗方法：1、外科手术治疗：切除癌变组织。2、放射疗法：利用高能电磁辐射线作用于生命体，使生物分子结构改变，达到破坏癌细胞目的。放射能够治疗癌症是因为癌细胞对放射线敏感。目前临床上应用的放射线有X线治疗和r线治疗两种。3、化学疗法：将药物经血管带到全身，对身体所有细胞都有影响。这种疗法有时也称为“胞毒疗法”，因为所用药物都是有害的，甚至是带毒性的，体内细胞，无论是否恶性细胞，都受到破坏。4、中医治疗癌症现在已经被国内外医疗专家广泛的认可，大量的临床试验及科研结果已经证实了中医治疗癌症的效果。姜叶三七为姜科植物姜叶三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根状茎及块根。具清热，利湿，止痛，解毒，止血之功效，用于淋浊，胃痛，口疮，痔疮，溃疡，跌打损伤，蛇咬伤，外伤出血等症，为广西特色中药材。“我国姜科药用植物研究Ⅵ姜三七挥发油化学成分分析”(发表于《色谱》1984年第1卷第1期)，用气液色谱和气液色谱-质谱法对姜三七挥发油各成分进行分享和鉴定，鉴定出二氢姜三七酮、α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、蒈烯、柠檬烯、桉叶素、芳樟醇、樟脑、α-胡椒烯、反-丁香烯、香树烯、γ-衣兰油烯、杜松烯、姜三七醌等15种成分。申请号为CN200510098945.2“一种姜叶三七的外用药”，公开了由姜叶三七、钻石风、倒生莲、滇崖爬藤、五角枫根、无腺磷木、络石藤、乙醇组成的一种外用药，对风湿关节痛、跌打瘀痛、跌打损伤、外伤出血、关节疼痛、筋骨扭伤疼痛、筋骨疼痛、瘀肿疼痛、腰膝疼痛、关节酸痛、外伤瘀痛、软组织挫伤疗效确切，疗程更短，效果更佳。此外，公开号为CN1814229的专利申请“一种土千年健祛湿镇痛药酒”、公开号为CN1742972的专利申请“一种四叶细辛外用药”、公开号为CN1814230的专利申请“一种山野豌豆活络镇痛药”、公开号为CN1814228的专利申请“一种矮人陀活络伤湿止痛膏”、公开号为CN101766729的专利申请“祛湿止痛液及穴敷治疗方法”均提及姜叶三七或土田七在跌打损伤或风湿疾病方面的治疗效果。在现有公开文献中，或提到姜叶三七的挥发油成分，或提到姜叶三七治疗跌打损伤等疾病的效果，但未见公开使用姜叶三七、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物及姜叶三七挥发油用于治疗肿瘤、各种癌症的效果，尚未有人对姜叶三七治疗肿瘤、癌症作过全面的研究。

技术实现要素：
本发明的目的是提供姜叶三七植物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用；本发明的目的是提供姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用；本发明的目的是提供姜叶三七挥发油提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用；本发明的另一目的是提供姜叶三七挥发油的制备方法。姜叶三七为姜科植物姜叶三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根状茎、块根。秋末冬初叶片枯黄后采挖，除去杂质，洗净，置沸水中稍烫，晒干。收载于《广西中药材标准》1990年版第8页。姜叶三七的别名有三七姜、姜叶三七、土田七、竹叶三七、姜叶三七、鸡心七、红沙姜、尖三七、拖颠枪(壮族)、内消子、打不死等。根据发明人对姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物以及姜叶三七挥发油进行临床研究和药效学研究，发现姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物以及姜叶三七挥发油能够通过抑制肿瘤细胞增殖、影响肿瘤细胞发生凋亡，以及影响癌细胞周期的改变，呈现G1期阻滞，达到抗肿瘤活性、治疗癌症的功效。在此基础上，本发明人通过对姜叶三七挥发油的有效成分进行有目的提取及含量控制以后，使其用于治疗和/或预防癌症的效果更显著。本发明专利临床应用的安全性较高，在癌症特别是肺癌的药物治疗中不失为一种好药，其拓宽了中药制剂治疗癌症、尤其是肺癌的新方法，在不能开展介入治疗的基层医院尤为适用。因此，申请人提供姜叶三七植物、姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物、姜叶三七挥发油用于制备治疗和/或预防癌症药物方面的新用途。本发明公开了姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七提取物的制备包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加水煎煮提取两次，第一次加入药材重量2-6倍量的水煎煮，沸腾后煮1-3小时，第二次加入药材重量1-4倍量的水煎煮1-3小时，过滤，混合两次煎煮液，浓缩至药材总重量的0.5-2倍，即得。本发明公开了姜叶三七提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七提取物的制备还包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加入乙醇回流提取2-3次，第一次加入2-6倍体积百分比为40-70％的乙醇，提取1-3小时，第二次加入1-4倍量体积百分比为40-70％的乙醇提取1-3小时，合并煎液，过滤，回收乙醇，制成干膏，即得。本发明还公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加石油醚回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的石油醚，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加乙酸乙酯回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的乙酸乙酯，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收乙酸乙酯，得姜叶三七脂溶性成分提取物。本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加水饱和正丁醇回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍的水饱和正丁醇，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收水饱和正丁醇，得姜叶三七脂溶性成分提取物。本发明公开了姜叶三七脂溶性成分提取物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七脂溶性成分提取物的制备还可以包括以下步骤：取姜叶三七根茎切碎，加乙醇回流提取2-3次，每次加入药材总重量3-5倍、体积百分比为30-50％的乙醇，提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，得浓缩液。所述浓缩液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量为浓缩液体积的3-5倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。所述浓缩液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量为浓缩液体积的3-5倍，收集石油醚相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。所述浓缩液加水饱和正丁醇分3次萃取，每次水饱和正丁醇用量为浓缩液体积的3-5倍，收集水饱和正丁醇相，浓缩干燥，得到姜叶三七脂溶性成分提取物。本发明公开了姜叶三七挥发油组合物在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，所述姜叶三七挥发油中含有活性成份，该活性成份由姜叶三七提取的姜叶三七挥发油活性成份组成，其中包括单萜类化合物，单萜氧化物类化合物，倍半萜类化合物，倍半萜氧化物类化合物。优选地，所述的姜叶三七挥发油活性成份包括：20-30重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，2-8重量份的香树烯；1-6重量份的氧化石竹烯。更优选地，所述的姜叶三七挥发油活性成份含量包括：24-28重量份的3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮，3-6重量份的香树烯；2-5重量份的氧化石竹烯。申请人还提供了一种制备所述姜叶三七挥发油的方法，它包括如下步骤：取姜叶三七粉碎成粗粉，加入药材总重量3-7倍的蒸馏水浸泡0.5-3小时，通过水蒸汽蒸馏提取3-6小时，收集上层精油，得姜叶三七挥发油。优选地，姜叶三七挥发油的制备包括以下步骤：取姜叶三七粉碎，加药材总重量5倍的蒸馏水浸泡1h，通过水蒸汽蒸馏提取4h，收集上层精油得姜叶三七挥发油组合物。基于上述姜叶三七提取物、姜叶三七脂溶性提取物、姜叶三七挥发油，本发明的目的是提供以上组合物的一种新用途，即在制备治疗和/或预防癌症药物的应用，特别是制备治疗和/或预防肺癌药物的应用。它可以制成注射液、注射用粉针剂，注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂、滴丸剂制剂，优选制成注射液、注射用冻干粉针剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。以下是本发明中药制剂的药材来源：姜叶三七：姜科植物姜叶三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根状茎及块根。本发明公开了姜叶三七在治疗癌症中的新用途，姜叶三七原植物和常规工艺提取物对于治疗癌症有一定的治疗效果，结果可见实验例1和实验例2，并且，姜叶三七毒性小，不会产生诸如化疗之类的强烈副作用。姜叶三七的挥发油提取物具有更加出色的疗效，如实验例所示的细胞实验，其浓度在120μg/ml时，就已经具有了明显的活性，在24小时或36小时对肿瘤细胞的抑制率超过了对照药物组，而其浓度在360μg/ml以上时，其杀灭癌细胞的活性更是能够超过90％。附图说明图1是姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株(CNE-2)增殖抑制率线图图2是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株(A549)增殖抑制率线图图3是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)增殖抑制率线图图4是姜叶三七挥发油对乳腺癌细胞株(MCF-7)增殖抑制率线图图5是姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株CNE-2凋亡的形态变化图6是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株HepG2凋亡的形态变化图7是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株A549凋亡的形态变化图8是姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株(CNE-2)早期凋亡AnnexinV-PI双染色法荧光散点图图9姜叶三七挥发油对鼻咽癌细胞株(CNE-2)凋亡率条形图图10是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株(A549)早期凋亡AnnexinV-PI双染色法荧光散点图图11是姜叶三七挥发油对肺癌细胞株(A549)凋亡率条形图图12是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)早期凋亡AnnexinV-PI双染色法荧光散点图图13是姜叶三七挥发油对肝癌细胞株(HepG2)凋亡率条形图图14是姜叶三七挥发油对乳腺癌细胞株(MCF-7)早期凋亡AnnexinV-PI双染色法荧光散点图图15是姜叶三七挥发油对乳腺癌细胞株(MCF-7)凋亡率条形图图16是姜叶三七挥发油对CNE-2细胞周期的影响图17是姜叶三七挥发油对A549细胞周期的影响图18是姜叶三七挥发油对HepG2细胞周期的影响图19是姜叶三七挥发油对MCF-7细胞周期的影响具体实施方式下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数(乙醇为体积百分比)。实施例1：姜叶三七挥发油取新鲜姜叶三七150g粉碎成粗粉，加药材450ml的蒸馏水浸泡0.5h，通过水蒸汽蒸馏提取3h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油1.7ml。对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为24％，莰烯为15％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为12％，香树烯为3％；氧化石竹烯为2％。实施例2：姜叶三七挥发油取新鲜姜叶三七根茎150g粉碎，加750ml的蒸馏水浸泡1h，通过水蒸汽蒸馏提取4h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物2.2ml。对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为28％，莰烯为11％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为8％，香树烯为6％；氧化石竹烯为5％。实施例3：姜叶三七挥发油取姜叶三七干燥根茎150g粉碎，加1050ml蒸馏水浸泡3h，通过水蒸汽蒸馏提取6h，收集上层精油，得姜叶三七挥发油组合物2.0ml。对所得姜叶三七挥发油进行检测，成分含量结果：3,6,7,8-四氢化-3,3,6,6-四甲基环戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮为30％，莰烯为20％；1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-茨酮为15％，香树烯为2％；氧化石竹烯为1％。实施例4：姜叶三七脂溶性成分提取物取姜叶三七根茎5000g切碎，加石油醚回流提取2次，第一次加入20000ml石油醚，提取2小时，第二次加入15000ml石油醚提取2小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。实施例5：姜叶三七脂溶性成分提取物取姜叶三七根茎5000g切碎，加石油醚回流提取3次，第一次加入25000ml石油醚，提取3小时，第二次加入20000ml石油醚提取2小时，第三次加入15000ml石油醚提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收石油醚，得姜叶三七脂溶性成分提取物。实施例6：姜叶三七脂溶性成分提取物取姜叶三七根茎5000g切碎，加乙酸乙酯回流提取3次，第一次加入25000ml乙酸乙酯，提取3小时，第二次加入20000ml乙酸乙酯提取2小时，第三次加入15000ml乙酸乙酯，提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收乙酸乙酯，得姜叶三七脂溶性成分提取物。实施例7：姜叶三七脂溶性成分提取物取姜叶三七根茎5000g切碎，加水饱和正丁醇回流提取3次，第一次加入25000ml水饱和正丁醇，提取3小时，第二次加入20000ml水饱和正丁醇提取2小时，第三次加入15000ml水饱和正丁醇提提取时间为1小时，合并提取液，过滤，回收水饱和正丁醇，得姜叶三七脂溶性成分提取物。实施例8：姜叶三七脂溶性成分提取物取姜叶三七干燥根茎5000g切碎，加入乙醇回流提...