近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂,制备方法及用途与流程

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一类新型的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的制备方法，以及其在作为肿瘤引流淋巴结示踪方面的用途。技术背景淋巴结的无创性检查一直备受关注。在恶性肿瘤的诊断和治疗中，评价肿瘤引流区域内的淋巴结非常重要，直接关系到手术术式及治疗方案的选择。目前临床常用的寻找肿瘤引流淋巴结的方法包括淋巴闪烁造影以及使用活性蓝染料配合外科解剖。然而前者的空间分辨率较低，且存在放射性污染，故限制了其在临床的广泛应用；后者不仅是有创性检查，并且只能显示视野表面的染色淋巴结，对较深在的淋巴结无法显示，因此也存在较大的局限性。近年来，超声微泡类造影剂及其靶向技术已经在分子显像与靶向治疗领域取得了诸多研究成果。携带淋巴结特异性配体的超声造影剂经皮下注射后能够被淋巴结中的巨噬细胞选择性吞噬，从而使造影剂在引流淋巴结内停留足够长时间(sonazoid，GE公司)，有利于术中超声扫描识别前哨淋巴结，并且能够显示充盈缺损的微小转移灶。虽然淋巴结靶向超声造影剂有着较高的敏感性，但是很多研究也指出其在寻找淋巴结时需要依据解剖特点行大范围扫查，从而增加了定位的难度；而且对于极表浅的如位于皮下的淋巴结或进入胸腔的淋巴结则因为超声技术的限制无法显像(JUltrasoundMed.2005；24：953-965)。荧光成像是分子生物学和医学研究极为重要的手段。其中近红外区域(波长600～900nm)生物分子的光吸收最低，而自发荧光最弱，大量的红外光可以穿过组织和皮肤而被检测到。因此，其波长范围被认为是光学成像的“诊断窗”。其独特优势为：①敏感性高；②可通过不同荧光探针的设计实现各种肿瘤的靶向性成像；③可提供实时动态的肿瘤活体成像。近几年经皮下注射近红外荧光染料吲哚氰绿行活体荧光成像寻找前哨淋巴结在国内外已有应用，因其使用方便、成像快速且持续时间长而受到外科医生的重视。但是近红外染料受限于成像深度(不超过1cm)，从而影响了在显示深部淋巴结中的应用(AnnThoracSurg.2013Jan；95(1)：312-318)。综上所述单一成像模式的造影剂已经不能满足临床诊断的需要。基于以上考虑，我们开发出了一种新型的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂，其特点是将亲淋巴结特异性配体和波长较长(750-900nm)的近红外荧光染料组装到超声造影剂表面，使造影剂能够选择性结合于肿瘤相关淋巴结，从而使淋巴结组织得到特异性的“标记”。其不仅实现了近红外光/超声双模式显像，并且取长补短，提供了一种深浅兼顾的示踪肿瘤引流淋巴结的新方法。

技术实现要素：
本发明的目的是提供一类近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。本发明的另一目的是提供上述近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的制备方法。本发明的目的还在于提供一种上述近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的用途，该类物质可用于肿瘤引流淋巴结的示踪。本发明所述的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的结构如图1所示。本发明的技术方案是采用超声乳化法结合冷冻干燥技术，该造影剂包括在近红外光区域具有强吸收的染料、氟碳类化合物以及对前哨淋巴结组织具有特异亲和性的物质；该微泡的壳层是由表面活性剂单分子层构成，微泡内包载氟碳类化合物，近红外染料包埋在微泡膜内或共价键连于微泡表面。其中所述近红外染料首选具有生物相容性和生物安全性的吲哚菁绿及其衍生物。其结合方式包括：物理结合如通过吸附(如：静电、弱作用力等)、混合、相嵌、填入、包覆、包埋、相嵌、粘附等；化学结合如配位、键合等。如将吲哚菁绿及其衍生物包埋于造影剂的表面壳层中，同时将磷脂酰丝氨酸等靶向分子组装到该壳层中。所述的超声造影剂由成膜材料包裹气体、液体或者固体所构成，所述微泡造影剂的粒径范围为300nm-7um。所述的成膜材料为具有良好生物安全性、生物相容性和生物可降解性的成膜材料；所述成膜材料包裹的材料包括气体、液体或纳米级生物相容性固体。为了实现上述目的，本发明所述的一种用于淋巴结靶向近红外光/超声双模式微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤：1)将表面活性剂、乳化剂和特异性靶向材料溶于氯仿溶液中，并加入0％-5％的棕榈酸和0.5％-10％近红外荧光染料，旋干溶剂形成薄膜；2)往上述体系中加入5-10mmol的半乳糖或者蔗糖，用30mlPBS缓冲液溶解，置于40-60°水浴超声仪中超声30-50分钟；3)将上述步骤2中所得混悬液转移至烧杯中，再往其中加入特定量的内包材料，使用超声波细胞破碎仪的1/2”探头以最大输出功率连续处理3-5min；4)将上述步骤3中所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。在步骤1)中，所述的表面活性剂选自单月桂酸酯(Tween20，Tween21，Span20)、单棕榈酸酯(Tween40，span40)、单硬脂酸酯(Tween60，Tween61，Span60)、三硬脂酸酯(Tween65，span65)、单油酸酯(Tween80，Tween81，Span80)和三油酸酯(Tween8...