一种金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种由取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的用途。所述修饰金纳米颗粒的取代嘧啶分子为2-巯基-4,6-二氨基嘧啶、2-巯基-4-氨基嘧啶或2-巯基4,6-二羟基嘧啶之中的一种或至少两种的混合。本发明将没有抗凝活性的取代嘧啶部分和没有抗凝活性的金纳米颗粒通过S-Au键相连，并首次应用于抗凝领域，所得的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒取得了出乎意料的抗凝效果，且制备方法简单，所述纳米颗粒粒径分布小，颗粒在水中分散性好，在正常剂量下不会引起出血副作用，可以用于制备抗凝血剂或抗血小板剂。
【专利说明】一种金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种金纳米颗粒的应用，更具体地，涉及一种取代嘧啶修饰的金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的用途。
【背景技术】
[0002]静脉血栓是人类因心血管相关疾病死亡的第三大杀手，而抗凝血药物是目前最有效的预防和治疗药物(Mackman, N.，Nature2008，451 (7181)，914—918)。目前常用的抗凝血药物肝素和华法林钠等容易在使用过程中造成出血等副作用，且容易和其他事物和药物发生相互作用，影响药效的发挥，使用时需要对其进行药物监测(Goldhaber，S.Z.；Bounameaux, H., Lancet2012, 379(9828), 1835-1846 ；Palareti,G.,et al., Lancetl996，348 (9025)，423-428)。人们一直想通过研制新型抗凝血药物来解决传统药物中出现的问题，但是进展缓慢，并且很难替代现有药物(Apostolakis, S., et al., Cardiovasc.Ther.2011，29(6)，el2_e22)。
[0003]金纳米颗粒具有很多优点，例如尺寸可控，表面容易修饰，生物相容性好，目前被广泛用于生物医药研究领域(Boisselier, E.；Astruc, D., Chem.Soc.Rev.2009，38 (6)，1759-1782)。在金纳米颗粒众多优势中，其多价效应尤其引人注意，已经被应用与很多药物的研发和创新中。比如将一些抗癌药物分子(肿瘤坏死因子或者紫杉醇)修饰在金纳米颗粒表面，可以达到比原药更强的抗肿瘤效果，并且可以逆转某些肿瘤对这些药物的耐药性(Paciotti, G.F., et al., Drug Deliv.2004, 11 (3), 169-183 ；Paciotti, G.F.，et al.，Drug Dev.Res.2006，67 (I)，47-54)，这主要是因为金纳米颗粒比表面积大，且容易修饰，所以可以连接很多药物分子，提高药物局部浓度，增强药效。且金纳米颗粒生物相容性好，尺寸较小，可靶向肿瘤组织，减少药物毒副作用，且由于尺寸效应不易被细胞排出，可逆转肿瘤耐药性。类似的现象也在抗生素药物的研究中被发现，将万古霉素连接在金颗粒表面可以逆转细菌的耐药性，降低最小抑菌浓度(MIC) (Gu, H.，et al., Nano Lett.2003，3 (9)，1261-1263)。不仅如此，某些无活性的小分子，比如一些抗菌药物前体小分子，修饰在金颗粒表面也会发挥强大的抗菌作用，不仅可以对抗超级细菌，还不容易诱导细菌产生耐药性(Zhao，Y.，et al., J.Am.Chem.Soc.2010，132(35)，12349-12356)。专利 CN102188383 公开了一种氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，其可广泛地用于抗菌药物的制备。此外，某些抗病毒药物的前体修饰在金颗粒表面可以抑制HIV-1病毒所造成的细胞融合(Bowman, M.C., et al., J.Am.Chem.Soc.2008，130(22)，6896-6897)。
[0004] 目前将金纳米颗粒的多价效应应用在开发新型抗凝血药物的研究还很少。人们将凝血酶、核酸配适体或者肝素连接在金纳米颗粒表面，确实可用于提高抗凝参数，但是这种方法很难控制表面配体的数量，对其是否会造成出血也没有进行评价(Liao, Y.J.，et al.，Langmuir2012, 28 (24)，8944-8951 ；Hsu, C.L.，etal., Chem.Eur.J.2011, 17 (39)，10994-11000 ；Shiang, Y.C., et al., Adv.Funct.Mater.2010，20(18)，3175-3182)。
[0005]嘧啶这种小分子是很多治疗性药物的前药，可以利用其合成抗菌药以及抗凝药物等(Lagorio, S.H.，et al., Eur.J.Med.Chem.2006, 41 (11), 1333-1338 ；Gangjee, A., et al., J.Med.Chem.2007, 50 (13), 3046-3053 ；Bruno, 0., et al., Bioorg.Med.Chem.2006, 14 (I)，121-130)。取代嘧啶可以被可控地连接于金纳米颗粒表面，所得颗粒物理化学稳定，并且可以发挥强大的抗菌作用(Zhao, Y., et al., J.Am.Chem.Soc.2010, 132(35)，12349-12356)。同时嘧啶也是目前在研究的一些抗凝药物的合成前体，这些抗凝药物在前期研究中显示出了比现有药物更为有效的抗凝活性，且不容易造成出血副反应，但是合成过程过于复杂(Abdelhafez, 0.M., et al., Bioorg.Med.Chem.2010, 18 (10)，3371-3378)。因此，本领域急需寻找一种具有优异抗凝效果、不造成出血副反应且合成方便的新型抗凝药物。
【发明内容】
[0006]本发明首次将取代嘧啶修饰的金纳米颗粒应用于抗凝血剂或抗血小板剂的制备，取得了出乎意料的抗凝效果。
[0007]本发明的目的在于提供一种由取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的用途。所述取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒为取代嘧啶部分和金纳米颗粒通过S-Au键相连所形成的纳米颗粒。所述修饰金纳米颗粒的取代嘧啶分子为2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶、 2-巯基-4-氨基嘧啶或2-巯基-4，6- 二羟基嘧啶之中的一种或多种的混合。即所述纳米颗粒中的金元素可结合一种取代嘧啶分子，也可通过其多价效应结合两种或更多上述取代嘧啶分子。单一氨基嘧啶分子修饰的金纳米颗粒包含2-巯基-4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT)，2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_APT)和2-巯基-4，6- 二羟基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_DHPT);混合氨基嘧啶分子修饰的金纳米颗粒包含2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶和2-巯基-4-氨基嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT/APT)，2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶和2-巯基-4，6- 二羟基嘧啶嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT/DHPT)，2-巯基-4-氨基嘧啶和2-巯基-4，6- 二羟基嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_APT/DHPT)和上述三种氨基嘧啶分子共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT/APT/DHAPT)。优选地，所述修饰金纳米颗粒的取代嘧啶分子为2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶(简称Au_DAPT)。
[0008]所述取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒中，取代嘧啶部分没有抗凝活性，未取代的金纳米颗粒也没有抗凝活性，然而当取代嘧啶部分中的巯基与金元素通过S-Au键相连时，所得的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒取得了出乎意料的抗凝效果。
[0009]所述金纳米颗粒中金元素与取代喃唳分子的摩尔含量比为1:0.5~1:2。例如1:
0.5，1:0.75，1:1，1:1.5或1:2。对其中摩尔含量比不同的金纳米颗粒进行电镜图片扫描，经分析可知当Au和取代嘧啶的摩尔含量比过大时，所得的金纳米颗粒粒径较大，较易发生团聚现象。当Au和取代嘧啶的摩尔含量比为1:0.5到1:2时，金纳米颗粒分散性较好，同时当Au和取代嘧啶的摩尔含量比为1:1时，其表面分子密度最高，具有更好的抗凝效果。优选地，所述金纳米颗粒中金元素与取代嘧啶分子的摩尔含量比为1:1，粒径为3nm左右。
[0010]所述金纳米颗粒平均粒径的范围为I~10nm。当所述金纳米颗粒中金元素与取代嘧啶分子的摩尔含量比为1:1时，所述金纳米颗粒平均粒径的范围为2.8~3.8nm。
[0011]本发明所述的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤:将氯金酸与取代嘧啶溶解混合形成混合溶液；还原剂例如硼氢化钠或抗坏血酸钠还原上述混合溶液中的氯金酸形成取代喃唳修饰的金纳米颗粒；纯化氨基喃唳修饰的金纳米颗粒。
[0012]本发明所述的金纳米颗粒可采用静脉注射、腹腔注射的给药方式。在本发明的一个实施方案中，所述金纳米颗粒在小鼠中采用尾静脉注射的给药方式。所述金纳米颗粒用于治疗和/或预防血栓，在本发明的一个实施方案中，所述金纳米颗粒用于预防小鼠尾部血栓，在本发明的另一个实施方案中，所述金纳米颗粒用于预防小鼠肺栓。所述金纳米颗粒单独使用或与其它抗凝血剂或抗血小板剂联合用药，所述抗凝血剂或抗血小板剂为预防性抗凝血剂或抗血小板剂。
[0013]与现有技术相比，本发明至少具备以下优点:
[0014](I)本发明将没有抗凝活性的取代嘧啶部分，没有抗凝活性的未取代的金纳米颗粒通过S-Au键相连，并首次应用于抗凝领域，所得的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒取得了出乎意料的抗凝效果。
[0015](2)较已知文献报道的金纳米颗粒，本发明所述的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒，制备方法简单，纳米颗粒粒径分布小，颗粒在水中分散性好，能在4°C或-20°C保存至少一年，冻干颗粒仍可溶于水。
[0016](3)在正常剂量下，本发明所述的金纳米颗粒不会引起出血副作用，克服了传统抗凝药物的一大缺点，是一种新型高效副作用小的抗凝血剂或抗血小板剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明所述的Au_DAPT的结构。
[0018]图2为本发明所述的Au_DAPT的透射电镜图片。
[0019]图3为具有不同Au与DAPT摩尔含量比的金纳米颗粒的电镜图片。
[0020]图4为具有不同Au与DAPT摩尔质量比的金纳米颗粒连同对照DAPT、肝素、柠檬酸金的凝血时间测试图。
[0021]图5为金纳米颗粒延长动物凝血时间图。
[0022]图6为金纳米颗粒对小鼠APTT和PT的影响。
[0023]图7为金纳米颗粒对小鼠尾部血栓的影响。
[0024]图8为金纳米颗粒对小鼠肺栓塞的影响，其中(a)为不同组别的小鼠存活率，(b)为对照组和金纳米颗粒组的肺部组织图。
[0025]图9为金纳米颗粒是否导致动物出血图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0027]实施例1取代嘧啶修饰的金纳米颗粒Au_DAPT的制备
[0028](I)配置反应溶液
[0029]配置5mM氯金酸甲醇溶液:将4Img氯金酸溶于20mL无水甲醇；
[0030]配置IOmM的2_巯基_4，6_ 二氨基嘧啶溶液:将14mg的2_巯基-4，6- 二氨基嘧啶(DAPT)加入IOmL无水甲醇中，并加入200 μ L无水乙酸和50 μ L吐温80，超声溶解；
[0031] 配置60mM硼氢化钠甲醇溶液:将12mg硼氢化钠溶于3mL甲醇，即配即用；
[0032](2)还原反应制得纳米金颗粒
[0033]在冰浴下，将20mL氯金酸甲醇溶液和IOmL的2_巯基_4，6_ 二氨基嘧啶溶液混合放入50mL圆底烧瓶中，使用磁子搅拌IOmin ；
[0034]加快搅拌速度，滴加硼氢化钠甲醇溶液，在2min之内滴完，之后降低搅拌速度继续在冰浴下搅拌lh，得到深红色溶液；
[0035](3)纯化 Au_DAPT
[0036]将得到的深红色溶液通过旋蒸法除去甲醇，加入5mL纯水，用截留分子量为14KDa的透析袋在纯水中透析48h(每3-4h换一次水)；透析后的金纳米溶液经0.22m微孔滤器过滤除菌，得到的Au_DAPT水溶液可在4°C保存或冻干后_20°C保存。Au_DAPT的结构和TEM图见图1和图2。
[0037]实施例2取代嘧啶修饰的金纳米颗粒Au_APT和Au_DHPT的制备
[0038]Au_APT (APT为2_巯基_4_氨基嘧啶)和Au_DHPT (DHPT为2巯基-4，6- 二羟基嘧啶)的合成方法与Au_DAPT相似，将DAPT换成等摩尔的APT和DHPT即可。
[0039]实施例3对具有不同金元素与取代嘧啶分子摩尔含量比的金纳米颗粒的考察
[0040]分别制备Au和DAPT的摩尔含量比分别为1:0.125,1:0.25,1:0.5、1:1、1:2，分别对其进行透射电镜表征，如图3所示。，当Au和DAPT的配比为1:0.125到1:0.25的时候，部分金纳米颗粒粒径较大，较易发生团聚现象。当Au和DAPT配比为1:0.5到1:2的时候，金纳米颗粒分散性较好，粒径为3nm左右。
[0041]表1不同金纳米颗粒的表面分子密度
【权利要求】
1.一种由取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述修饰金纳米颗粒的取代嘧啶分子为2-巯基_4，6- 二氨基嘧啶、2-巯基-4-氨基嘧啶或2-巯基4，6- 二羟基嘧啶之中的一种或至少两种的混合。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述修饰金纳米颗粒的取代嘧啶分子为2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述金纳米颗粒中金元素与取代嘧啶分子的摩尔含量比为1:0.5~1:2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述金纳米颗粒中金元素与取代嘧啶分子的摩尔含量比为1:1。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述金纳米颗粒平均粒径的范围为I~IOnm0
7.根据权利要求1-6任一项所 述的用途，其特征在于，所述金纳米颗粒平均粒径的范围为2.8~3.8nm。
8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述金纳米颗粒可采用静脉注射或腹腔注射的给药方式。
9.根据权利要求1-8任一项所述的用途，其特征在于，所述金纳米颗粒单独使用或与其它抗凝血剂或抗血小板剂联合用药。
10.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其特征在于，所述抗凝血剂或抗血小板剂为预防性抗凝血剂或抗血小板剂。
【文档编号】A61P7/02GK103976958SQ201410231394
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】蒋兴宇, 田月, 赵玉云, 张伟 申请人:国家纳米科学中心