一种抗前列腺癌贻贝糖蛋白及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种贻贝糖蛋白及其制备方法和用途，本发明所述贻贝糖蛋白是贻贝软组织通过组织匀浆、缓冲液提取、离子交换柱层析、凝胶柱层析和蛋白快速纯化系统纯化、浓缩、再经冷冻干燥步骤得到。本发明的贻贝糖蛋白的分子量约为16.9kDa，糖和蛋白含量分别为23.54%和76.46%，含有O-糖苷键和N-糖苷键，单糖的组成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相应比例为1.00：2.01：6.93：7.27：4.05。蛋白质由15中氨基酸组成。该贻贝糖蛋白活性显著，临床上可以作为一种新生血管抑制剂使用，可用于前列腺癌等肿瘤疾病的治疗。
【专利说明】一种抗前列腺癌贻贝糖蛋白及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于化学工程【技术领域】，尤其涉及一种抗前列腺癌贻贝糖蛋白及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]贻贝是双壳类软体动物，也是我国重要的养殖贝类。在我国北方贻贝俗称海红，在南方俗称青口，其干制品俗称淡菜，是药食两用的著名海产之一。中国出产的贻贝有紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝等几种。近年来，部分研究人员对贻贝活性物质进行了研究，如利用贻贝制备功能肽、活性多糖，利用贻贝脂溶性成分制备抗炎药物等，为贻贝的高值化利用提供了理论和技术支持。近年来，糖蛋白类成分显著的生物活性受到持续关注，同时该类物质也显示出在创新药物及保健食品开发方面具有广阔的应用前景。
[0003] 申请人:在检索过程发现以贻贝为原料，利用水提、离子交换树脂柱层析、凝胶柱层析和蛋白快速纯化系统制备糖蛋白的研究处于空白阶段，对于其在抗前列腺癌领域的应用也尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于公开一种贻贝糖蛋白，本发明的目的还在于公开该贻贝糖蛋白的制备方法，本发明的目的还在于公开该贻贝糖蛋白在制备抑制血管生成、防治前列腺癌的药物中的应用。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种抗前列腺癌贻贝糖蛋白及其制备方法和应用，其特征在于包括以下步骤:
(I)匀衆:新鲜贻贝洗净、去壳，软组织匀衆2~4 min,按lg: 10~15mL比例加入Tris-HCl 缓冲液(pH6.8，0.05 mol/L)，O ~4°C搅拌提取 36 ~48 h，于 10000 ~12000 r/min、0~4°C离心10~20 min,收集上清液、浓缩,蒸懼水透析48 h,冷冻干燥,得粗糖蛋白。
[0006](2)阴离子交换层析:粗糖蛋白用Tris-HCl缓冲液(ρΗ6.8,0.05 mol/L)配成浓度30~50mg/mL溶液,经0.45 μ m微孔滤膜过滤,加入到阴离子交换树脂柱(1.6 cmX 80 cm),依次用含0、0.3和0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，用考马斯亮兰法和苯酚-硫酸法示踪检测蛋白质含量和糖含量，根据洗脱曲线收集糖蛋白组分，将洗脱液浓缩，用15~20倍蒸馏水透析36~48 h (蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，检测其前列腺癌细胞增值抑制活性，活性最强组分为离子交换糖蛋白。
[0007](3)凝胶柱层析:将离子交换糖蛋白用Tris-HCl缓冲液(ρΗ6.8,0.05 mol/L)配成浓度20~30mg/mL溶液，经0.45 μ m微孔滤膜过滤,加入到凝胶柱(1.0 cmX 50 cm),用Tris-HCl缓冲液(pH6.8,0.05 mol/L)洗脱，考马斯亮兰法和苯酚-硫酸法示踪检测蛋白质含量和糖含量，根据洗脱曲线收集糖蛋白组分，将洗脱液浓缩，用15~20倍蒸馏水透析36~48 h (蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，检测其前列腺癌细胞增值抑制活性，活性最强组分为凝胶层析糖蛋白。
[0008](4)精制:将凝胶层析糖蛋白用Tris-HCl缓冲液(ρΗ6.8,0.05 mol/L)配成浓度10~15mg/mL溶液，经0.45 μ m微孔滤膜过滤，利用蛋白快速纯化系统(AKTA purifier 100)制备，收集洗脱峰，冷冻干燥得糖蛋白。
[0009]作为优选，所述的步骤(1)中的贻贝为厚壳贻贝iMytiIus coruscus )。
[0010]作为优选，所述的步骤(2)中的阴离子交换树脂为DEAE Sepharose F F。
[0011]作为优选,所述的步骤(3)中的凝胶为Sepharose 4B。
[0012]作为优选,所述的步骤(4)中的蛋白快速纯化系统的条件:色谱柱为SuperdexTM75制备柱(瑞典安玛西亚公司)，洗脱剂为双蒸水，进样量20 μ L，流速0.5 mL/min，检测波长 280 nm。
[0013]本发明所得的贻贝糖蛋白的糖和蛋白含量分别为23.54%和76.46% ;经GC/MS测定，糖蛋白中单糖的组成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相应比例为1.00:2.01:6.93:7.27:4.05 ;经氨基酸分析仪分析，糖蛋白中的蛋白由15中氨基酸组成；SDS-PAGE电泳分析分子量为16.9 kDa ;经碱处理、PNGase F酶解、β -降解反应和红外光谱分析该贻贝糖蛋白含有O-糖苷键和N-糖苷键；HPLC分析其半数降解温度为63.5 ° C。
[0014]本发明所得的贻贝糖蛋白在I μ g/只、10 μ g/只、和100 Ug/只的浓度下，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制率分别为52.8%,75.6%和94.1% ;对前列腺癌细胞DU-145和PC-3细胞的半数抑制浓度(IC5tl)分别为0.12 mg/mL和0.08 mg/mL，该贻贝糖蛋白活性显著，可用于制备抗前列腺癌药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1粗糖蛋白提取物在DEAE Sepharose F F层析柱上的洗脱曲线；
图2离子交换层析活性组分在S^harose 4B层析柱上的洗脱曲线；
图3凝胶层析活性组分在蛋白快速纯化系统(AKTA purifier 100)上的洗脱曲线；
图4贻贝糖蛋白的SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
[0016]下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。
[0017]实施例1:
本发明所用的仪器设备:
AKTA purifier 100 (瑞典安玛西亚公司)；
Agilent 1200高效液相色谱(美国Agilent公司)；
Mill1-Q system (美国 Millipore 公司)；
DEAE Sepharose F.F 和 Sepharose 4B 柱层析设备(瑞典 Pharmacia 公司)；
FDU-1200小型冷冻干燥机(日本EYELA公司)；
DS-21高速组织捣碎机(上海标本模型厂)；
UV-22000型紫外分光光度计(尤尼柯仪器(上海)有限公司)；
DYY-22C电泳仪(北京六一仪器厂)；
He1-VAP旋转蒸发器(德国Heidolph公司)；BSZ-1OO型自动部分收集器(上海琪特分析仪器有限公司)
LXB型离心机(上海医用分析仪器厂)；
SuperdexTM 75制备柱(瑞典安玛西亚公司)
本发明所使用的试剂及原料:
PNGase F (美国 Sigma 公司)；
蛋白质标准品(上海源聚生物技术有限公司)；
牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)(上海源聚生物技术有限公司)；
其它试剂均为分析纯，均由国药集团化学试剂有限公司提供。
[0018]一种贻贝糖蛋白及其制备方法和应用，制备工艺流程如下:贻贝一软组织一组织匀浆一缓冲液提取一阴离子交换层析一葡聚糖凝胶层析一蛋白快速纯化系统精制一理化性质、活性分析。
[0019]具体步骤为:
(I)匀衆:新鲜厚壳贻贝diiAas Corw1SCU1S)洗净、去壳,软组织匀衆3 min,按Ig:15mL 比例加入 Tris-HCl 缓冲液(pH6.8，0.05 mol/L)，4°C搅拌提取 48 h，于 12000 r/min、4°C离心10 min，收集上清液、浓缩，于15倍蒸馏水透析48 h (蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，得粗糖蛋白。
[0020](2)阴离子交换层析:粗糖蛋白用Tris-HCl缓冲液(pH6.8,0.05 mol/L)配成浓度30 mg/mL溶液,经0.45 μ m微孔滤膜过滤,加入到DEAE Sepharose F F柱(1.6 cm X 80cm)，依次用含0,0.3和0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，用考马斯亮兰法和苯酚-硫酸法示踪检测蛋白质含量和糖含量，根据洗脱曲线收糖蛋白组分，将洗脱液浓缩，于15倍蒸馏水透析48 h (蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，检测其前列腺癌细胞增值抑制活性，活性最强组分(MGP-1II)为离子交换糖蛋白(图1)。
[0021](3)凝胶柱层析:将离子交换糖蛋白(MGP-1II)用Tris-HCl缓冲液(ρΗ6.8,0.05mol/L)配成浓度25 mg/mL溶液,经0.45 μ m微孔滤膜过滤,加入到Sepharose 4B (1.0cmX 50 cm)，用Tris-HCl缓冲液(pH 6.8,0.05 mol/L)洗脱，考马斯亮兰法和苯酚-硫酸法示踪检测蛋白质含量和糖含量，根据洗脱曲线收集糖蛋白组分，将洗脱液浓缩，于15倍蒸馏水透析48 h (蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，检测其前列腺癌细胞增值抑制活性，活性最强组分(MGP-1I1-B)为凝胶层析糖蛋白(图2)。
[0022](4)精制:将凝胶层析糖蛋白(MGP-1I1-B)用 Tris-HCl 缓冲液(pH 6.8,0.05 mol/L)配成浓度为10 mg/mL溶液，经0.45μπι微孔滤膜过滤，利用蛋白快速纯化系统(AKTApurifier 100)制备(色谱柱SuperdexTM 75制备柱，洗脱剂为双蒸水，进样量20 yL，流速
0.5 mL/min，检测波长280 nm)，收集洗脱峰，冷冻干燥，检测其前列腺癌细胞增值抑制活性，活性最强组分(MGP-1I1-B-2)为贻贝糖蛋白(图3和图4)。
[0023]本发明所得的贻贝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)是指在280 nm处有蛋白质特征吸收值，同时用苯酚-硫酸法检测时，在490 nm又有糖特征吸光值的组分；
本发明所得的贻贝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)经碱处理、PNGase F酶解、β -降解反应和红外光谱分析，该贻贝糖蛋白含有O-糖苷键和N-糖苷键；
本发明所得的贻贝糖蛋白(MGP-1I1-B-2M5SDS-PAGE电泳分析分子量约为16.9 kDa ； 本发明所得的贻贝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)经HPLC分析其半数降解温度为63.5 ° C。
[0024]本发明所得的贻贝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)中糖和蛋白含量分别为23.54%和76.46% ;经GC/MS测定，糖蛋白中单糖的组成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相应比例为1.00:2.01:6.93:7.27:4.05。
[0025]本发明所得的贻贝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)经氨基酸分析仪分析，糖蛋白中蛋白由15种氨基酸组成,详见表1。
[0026]表1.贻贝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)中氨基酸组成及含量
【权利要求】
1.一种贻贝糖蛋白其特征在于该贻贝糖蛋白的分子量约为16.9 kDa;所述的贻贝糖蛋白含有O-糖苷键和N-糖苷键；所述的贻贝糖蛋白组分在280 nm处有蛋白质特征吸收值，用苯酚-硫酸法检测时，在490 nm又有多糖特征吸光值。
2.如权利要求1所述的一种贻贝糖蛋白，其特征在于所述的贻贝糖蛋白中糖和蛋白含量分别为23.54%和76.46%ο
3.如权利要求1所述的一种贻贝糖蛋白，其特征在于该贻贝糖蛋白组分的半数降解温度为63.5 ° C。
4.如权利要求1所述的一种贻贝糖蛋白，其特征在于该贻贝糖蛋白组分经GC/MS测定，糖蛋白中单糖的组成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相应比例为 1.00:2.01:6.93:7.27:4.05。
5.如权利要求1所述的一种贻贝糖蛋白，其特征在于该贻贝糖蛋白组分经氨基酸分析仪分析，糖蛋白中的蛋白由15中氨基酸组成，其中每1000个氨基酸残基中，丙氨酸113残基/1000残基、精氨酸65残基/1000残基、天冬氨酸87残基/1000残基、谷氨酸91残基/1000残基、甘氨酸165残基/1000残基、组氨酸4残基/1000残基、异亮氨酸11残基/1000残基、亮氨酸31残基/1000残基、赖氨酸20残基/1000残基、蛋氨酸11残基/1000残基、苯丙氨酸27残基/1000残基、脯氨酸101残基/1000残基、丝氨酸143残基/1000残基、苏氨酸78残基/1000残基、缬氨酸53残基/1000残基。
6.如权利要求1至5任一所述的贻贝糖蛋白，其特征在于该糖蛋白由如下方法制备而得到: (1)匀衆:新鲜贻贝洗净、去壳，软组织匀衆2~4min,按lg: 10~15mL比例加入Tris-HCl 缓冲液(pH 6.8,0.05 mol/L)，O ~4°C搅拌提取 36 ~48 h，于 10000 ~12000 r/min、0~4°C离心10~20 min,收集上清液、浓缩,用15~20倍蒸懼水透析36~48 h(蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，得粗糖蛋白； (2)阴离子交换层析:粗糖蛋白用Tris-HCl缓冲液(pH6.8，0.05 mol/L)配成浓度30~50mg/mL溶液,经0.45 μ m微孔滤膜过滤,加入到阴离子交换树脂柱(1.6 cmX 80 cm),依次用含0、0.3和0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，用考马斯亮兰法和苯酚-硫酸法示踪检测蛋白质含量和糖含量，根据洗脱曲线收集糖蛋白组分，将洗脱液浓缩，用15~20倍蒸馏水透析36~48 h (蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，检测其细胞毒活性，活性最强组分为离子交换糖蛋白； (3)凝胶柱层析:将离子交换糖蛋白用Tris-HCl缓冲液(pH6.8,0.05 mol/L)配成浓度20~30mg/mL溶液,经0.45 μ m微孔滤膜过滤,加入到凝胶色谱柱(1.0 cm X 30 cm),用Tris-HCl缓冲液(pH 6.8,0.05 mol/L)洗脱，考马斯亮兰法和苯酚-硫酸法示踪检测蛋白质含量和糖含量，根据洗脱曲线收糖蛋白组分，将洗脱液浓缩，用15~20倍蒸馏水透析36~48 h (蒸馏水每12 h更换一次)，冷冻干燥，检测其细胞毒活性，活性最强组分为凝胶层析糖蛋白； (4)精制:将凝胶层析糖蛋白用Tris-HCl缓冲液(pH6.8,0.05 mol/L)配成浓度10~15mg/mL溶液，经0.45 μ m微孔滤膜过滤，利用蛋白快速纯化系统(AKTA purifier 100)制备，收集洗脱峰，冷冻干燥得糖蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中的贻贝为厚壳贻贝iMytilus Cora1SCW1S);所述的步骤(2)中的阴离子交换树脂为DEAE Sepharose F F ;所述的步骤(3)中的凝胶为Sepharose 4B ;所述的步骤(4)中的蛋白快速纯化系统(AKTA purifier100)的条件为:色谱柱SuperdexTM 75制备柱，洗脱剂为双蒸水，进样量20 μ L，流速0.5mL/min,检测波长 280 nm。
8.如权利要求1至5任一所述的贻贝糖蛋白在抗肿瘤药物，特别是在制备抗前列腺癌药物中的应 用。
【文档编号】A61P35/00GK104177484SQ201410233476
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】迟长凤, 王斌, 陈荫, 李涛 申请人:浙江海洋学院