一种含丝裂霉素c的微泡超声造影剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丝裂霉素C超声微泡造影剂的制备方法。本发明采用磷脂与丝裂霉素C制备成磷脂复合物，大大改善了丝裂霉素的脂溶性，用磷脂复合物制备脂质体，提高了丝裂霉素C脂质体的包封率与载药量。将得到的脂质体加入冻干保护剂冷冻干燥，充填气体，得到丝裂霉素C脂质超声微泡。临用前按需要量加注射用生理盐水，经振荡水合后应用。得到的载药超声微泡可以通过超声成像对肿瘤的发生、发展及疗效进行实时检测和诊断，也可通过微泡的被动靶向和超声击碎微泡释放药物，达到可控地靶向释放药物的目的。从而对肿瘤的预防、诊断及治疗均有着重要的意义。
【专利说明】一种含丝裂霉素 C的微泡超声造影剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种载药微泡超声造影剂。
【背景技术】
[0002] 超声医学不但在传统的诊断领域发展迅速，而且逐渐延伸到治疗领域。微泡超声 造影剂在作为诊断工具的同时也可以作为一种新型的药物的载体，不仅可以增强超声显 像，还可作为靶向给药的载体。微泡超声造影剂，是一种用外壳固定气体的微泡，它大大增 强超声的背向散射，从而增强血流的同波信号和血流在血管中的多普勒信号，超声造影剂 已经普遍应用于超声诊断。构成微泡超声造影剂膜材料是药物的良好载体，可将药物吸附、 整合或包裹。经静脉注射后，携带药物的微泡到达特定器官，在超声辐照下微泡破裂，使周 围靶细胞间隙增宽，微泡空化产生的冲击波可提高细胞的渗透性；利于微泡所携带药物进 入靶组织，增加靶组织药物浓度，可降低药物的毒副作用，达到提高治疗效果的目的。超声 诱导微泡破裂产生的生物效应还可对病变组织产生破坏作用，有利于病变细胞凋亡。随着 对超声造影剂研究的深入，靶向超声造影剂在疾病诊断及治疗中的潜在作用越来越受到重 视。
[0003] 丝裂霉素 C (Mitomycin C，MMC，以下简称丝裂霉素，结构如式（I )所示）是一种 细胞周期非特异性抗肿瘤药，抗瘤谱广。丝裂霉素主要作用为使互补的DNA双键之间形成 交联，从而抑制DNA而不直接影响RNA的蛋白质合成。临床用于治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、消 化道癌、膀胱癌、前列腺癌等。普通制剂中，药物通过分布和被动扩散分布至全身，而在肿瘤 部位药量不大，且消失也快，导致肿瘤部位药物有效浓度持续时间短，全身不良反应大，如 产生白细胞减少、脱发、变态反应、恶心、组织坏死、肾衰、眼部伤害等。据报道，在接受丝裂 霉素治疗5?12个月后，约10%的腺癌患者发生溶血性尿毒综合征（HUS)，引起肾功能减 退，当累计剂量超过60mg后，更易发生HUS，且停药后症状持续加重。丝裂霉素对心脏等脏 器的毒性也有报道，这些毒副作用极大地限制了其应用。目前市场使用的丝裂霉素制剂有 粉针剂，临床上常常因毒副作用大，或患者不能耐受而被迫停药，因而急需对丝裂霉素进行 剂型设计，研制丝裂霉素新剂型和给药途径，以降低其毒性。
[0004] 脂质体包裹气体的微泡造影剂是目前常用的微泡超声造影剂。将丝裂霉素制成脂 质体，然后包裹气体制成脂质微泡造影剂，能更好地发挥丝裂霉素的抗肿瘤作用，而降低它 的毒性，然而丝裂霉素在水中溶解度大，脂质体包封率小。杨冬发等用复乳法制备丝裂霉素 C脂质体，得到的包封率为8.25% (杨冬发，覃健，侯之启。复乳法制备丝裂霉素 C脂质体 及包封率的测定中国医药指南2012,10 (34) 8?10)。张美侠等在处方中加入油酸，使丝裂 霉素 C包封率由原来的7%增长至15% (张美侠、胡晋.丝裂霉素 c脂质体的制备工艺研 究沈阳部队医药1994,7(5)454)。胡兰荣等制备丝裂霉素 C免疫脂质体的包封率为10? 15% (胡兰荣，齐晓峰，郑昌学，吴健，董志伟。丝裂霉素靶向免疫脂质体对胃癌细胞M85的 体外杀伤作用生物化学杂志1991，7 (3) 381?3)。这些方法制备的丝裂霉素 C脂质体的包 封率小，不能满足靶向给药的需要。有专利制备丝裂霉素多囊脂质体，包封率达45% (申 请号：CN200610025159. 4)，但不适合制备微泡造影剂。为了提高丝裂霉素 C脂质体的包封 率，很多研究者将丝裂霉素 C制成脂溶性的前体药物（吴道澄、徐梁、张学庸。油酸丝裂霉 素的合成及其脂质体制剂的研制第四军医大学学报1994,15 (2) 148，美国专利7, 303, 760、 7, 276, 248、6, 984, 396、6, 365, 179)，但是前体药物很难成为新药应用于临床。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是制备一种载有丝裂霉素的微泡超声造影剂，使它既是超声造影的 对比剂，又携带丝裂霉素到达靶部位起靶向治疗作用。本发明另一个特色是采用磷脂与丝 裂霉素 C制备成磷脂复合物，提高丝裂霉素 C脂质体的包封率与载药量。本发明得到丝裂霉 素 C脂质微泡超声造影剂可以通过超声成像对肿瘤的发生、发展及疗效进行实时检测和诊 断，也可通过微泡的被动靶向和超声击碎微泡释放药物，达到可控地靶向释放药物的目的。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0007] -种微泡超声造影剂，由脂质体和包裹于所述的脂质体内的微泡组成，所述脂质 体由如下重量份的组分制成：
[0008] 丝ΙΤ?丨/; +桌C 丨份 磷脂 0.8?30份 稳记剂 0?15份 抗铽剂 0?20份 粉末载体 20?90份
[0009] 本发明采用磷脂与丝裂霉素 c制备成磷脂复合物，改善丝裂霉素 c的脂溶性，用磷 脂复合物制备脂质体，提高丝裂霉素脂质体的包封率与载药量，继而制备丝裂霉素脂质微 泡超声造影剂，可提高丝裂霉素的靶向性。得到的载药微泡超声可以通过超声成像对肿瘤 的发生、发展及疗效进行实时检测和诊断，也可通过微泡的被动靶向和超声击碎微泡释放 药物，达到可控地靶向释放药物的目的。从而对肿瘤的预防、诊断及治疗均有着重要的意 义。
[0010] 作为优选，所述的磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、氢化磷脂和合成磷脂中的一种或几种 的混合物，其中，所述的合成磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
[0011] 作为优选，所述的稳定剂为胆酸钠、脱氧胆酸钠、油酸、油酸钠、胆固醇、单硬脂酸 甘油酯中的一种或几种的混合物；
[0012] 作为优选，所述的抗氧剂为维生素 E、维生素 C、金属络合剂等的一种或几种的混 合物。
[0013] 作为优选，所述的粉末载体为葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、右旋糖苷、甘露糖、山梨 醇、木糖醇等中的一种或几种的混合物。
[0014] 作为优选，所述的微泡中填充的气体选自空气、氧气、氮气、二氧化碳、六氟化硫、 氟碳气体中的一种或几种的混合物。
[0015] 作为优选，所述脂质体由如下重量份的组分制成：
[0016] 丝裂裕索C 1份 _脂 8?15 # 稳记剂 1?10份 _7] 抗氧剂 0?5份 粉末载体 40?80份。
[0018] 采用这些组分制成的微泡超声造影剂包封率高，能达到持久增强肝实质超声显像 效果，并且能够达到可控地靶向释放药物的目的。
[0019] 本发明还提供了一种所述的微泡超声造影剂的制备方法，它包含以下步骤：
[0020] (1)取丝裂霉素 C与磷脂加入到有机溶剂中，于25°C?60°C温度下搅拌或振荡2h 以上得到磷脂复合物；
[0021] 所述的有机溶剂优选为无水乙醇、氯仿、二氯甲烷或丙酮；
[0022] (2)在（1)所得到的磷脂复合物中加入稳定剂、抗氧剂搅拌或振荡溶解；
[0023] (3)在（2)得到的溶液中加入粉末载体，旋转蒸发挥干溶剂得到前体脂质体；
[0024] (4)在无菌条件下，取出（3)得到的前体脂质体分装于西林瓶中，然后注入惰性气 体以置换西林瓶头部的空气，密封即得。
[0025] 本发明还提供了一种所述的微泡超声造影剂在制备含丝裂霉素 C水溶性抗肿瘤 药物中的应用。
[0026] 本发明的实质性特点和显著的进步主要体现在：制备了一种载有丝裂霉素 C的微 泡超声造影剂，并采用磷脂复合物技术增加了微泡超声造影剂的载药量。
[0027] 丝裂霉素 C在临床可用于治疗肝癌等肿瘤，但因药物通过分布和被动扩散在全身 分布，而在肿瘤部位药量不大，全身不良反应大。本发明得到的载有丝裂霉素 C的微泡超声 造影剂可以通过超声成像对肿瘤的发生、发展及疗效进行实时检测和诊断，也可通过微泡 的被动靶向和超声击碎微泡释放药物，达到可控地靶向释放药物的目的。
[0028] 本发明采用磷脂与丝裂霉素 C制备成磷脂复合物，大大改善了丝裂霉素的脂溶 性，用磷脂复合物制备脂质体包裹气体，提高了丝裂霉素 C微泡超声造影剂的包封率与载 药量。
[0029] 本发明为肝癌的诊治提供了一种新的药物与疗法，具有较大的临床意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为制备得到的丝裂霉素 C微泡超声造影剂；
[0031] 图2为水化后的丝裂霉素 C微泡超声造影剂显微镜图；
[0032] 图3为丝裂霉素 C微泡超声造影剂家兔肝脏显影；
[0033] 图4为丝裂霉素 C微泡超声造影剂时间-强度曲线。
【具体实施方式】
[0034] 下面实施例用于进一步说明本发明，但并不以任何形式限制本发明涉及的内容。
[0035] 实施例1
[0036] 丝裂裕尜C 0.3g 卵i粦脂 3g 胆固醇 0.75g 油酸 0.6g 乳糖 19.5g
[0037] 取卵磷脂与丝裂霉素加二氯化碳适量（约100mL)溶解，密封，35°C恒温振荡4h，力口 入胆固醇和油酸溶解，移至旋转蒸发器中，加入乳糖，旋转蒸发干燥。在无菌条件下分装于 西林瓶中，每瓶0. 8g，然后注入六氟化硫气体以置换西林瓶头部的空气，密封即得，见图1。
[0038] 向丝裂霉素 C微泡超声造影剂小瓶内注入0. 9 %氯化钠注射液3mL然后振摇瓶子， 直至微泡均均匀分散，吸取少许，用水稀释100倍，在显微镜下观察微泡的形态特征，可见 微泡呈圆形，中间透亮，壁薄，大小均匀且稳定，见图2。采用激光粒度分析仪测定所得微泡 平均直径为2. 7 μ m，。
[0039] 实施例2
[0040] 丝裂裕索C 0.3g 卵磷脂 2g 维叱索E 0.7g ΙΓ?^糖 21g
[0041] 取卵磷脂与丝裂霉素加无水乙醇适量（约100mL)溶解，密封，50°C恒温振荡6h，力口 入维生素 E溶解，移至旋转蒸发器中，加入甘露糖，旋转蒸发干燥。在无菌条件下分装于西 林瓶中，每瓶〇.8g，然后注入六氟化硫气体以置换西林瓶头部的空气，密封即得。
[0042] 实施例3
[0043] 丝裂霉索C 0.3g -'·棕榈酸_断·胆碱 1.5g + :棕榈酰_断酰乙酢胺0.5g 油酸 〇.7g 山梨醇 21 g
[0044] 取二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺与丝裂霉素加氯仿适量（约 100mL)溶解，密封，40°C恒温振荡6h，加入油酸溶解，移至旋转蒸发器中，加入山梨醇，旋转 蒸发干燥。在无菌条件下分装于西林瓶中，每瓶〇.8g，然后注入全氟丙烷气体以置换西林瓶 头部的空气，密封即得。
[0045] 实施例4包封率的测定
[0046] 取实施例1制得的超声造影剂，隔塞注入3ml生理盐水，轻轻摇动形成微泡混悬 液。
[0047] 药物总量的测定：取微泡混悬液lmL加入500mL量瓶中，加入lmL7. 5 %吐温-80溶 液使微泡混悬液溶解，加 PH7. 2磷酸盐缓冲溶液至刻度，用0. 45um微孔滤膜过滤，于364nm 处测定紫外吸光度，用标准曲线计算浓度，并计算总药物量。
[0048] 游离药物量的测定：取微泡混悬液以300r/min离心3min，用帶0. 45um微孔滤膜 的注射器吸取下层溶液，精密移取0. 5mL加入250mL量瓶中，加 pH7. 2磷酸盐缓冲溶液至刻 度，于364nm处测定紫外吸光度，用标准曲线计算浓度，并计算游离药物量。
[0049] 包封率的计算：将上述测得的药物总量与游离药物量按下式计算丝裂霉素 C的包 封率。
[0050] 包封率=(1 -游离药物量/总药物量）X 100%。
[0051] 测得实施例1制得的丝裂霉素 C超声造影剂包封率为39. 26%
[0052] 实施例5丝裂霉素 C超声造影剂体内成像实验
[0053] 以家兔为模拟动物，经耳缘静脉注射苯巴比妥钠（100mg/kg)麻醉后，仰卧位固 定，腹部去毛。使用Philips IU22彩色多普勒超声诊断仪，线阵探头频率7-12MHZ，机械指 数0. 64,常规扫查获得家兔肝声像图。取实施例1制得的超声造影剂，隔塞注入3ml生理 盐水，轻轻摇动形成微泡混悬液，按lml/kg剂量经耳缘静脉注射，随后推注5ml生理盐水冲 洗，动态观察肝造影后的显像时间和显像效果。结果注射造影剂即刻，肝实质未见有明显增 强，于注射后15秒，肝实质开始出现增强，并于注射后26秒左右达到高峰，然后逐渐衰退。 存储图像后（见图3)，应用随机所带的Qlab软件对图像进行分析，先勾画出感兴趣区，然 后将自动绘制的时间-强度曲线进行分析，获取定量指标即：峰值强度、达峰时间、曲线尖 度、曲线下面积等。本发明超声造影剂在造影过程中可形成明显的完整增强-衰退的曲线 图（见图4)，上升时间13. 59sec，达峰时间25. 80sec，峰值强度16. 95dB，结果表明本发明 超声造影剂能达到持久增强肝实质超声显像效果。
[0054] 实施例6丝裂霉素 C超声造影剂肝内药物量测定
[0055] 家兔经耳缘静脉注射3%苯巴比妥钠（100mg/kg)麻醉后，仰臥位固定，腹部脱毛。 向实施例1制得的丝裂霉素 C微泡超声造影剂（剂量10mg)小瓶内注入0. 9%氯化钠注射 液3mL，然后用力振摇瓶子，直至微泡均均匀分散。将微泡混悬液抽吸至注射器后按lml/kg 剂量经耳缘静脉注射，随后推注5ml生理盐水冲注。如实施例5,用超声波处理。5min后摘 取肝脏，于-60°C保存。采用丝裂霉素 C注射剂（剂量10mg)作对照。
[0056] 采用Agilent6460三重串联四级杆高效液相色谱质谱联用仪测定肝脏中丝裂霉 素 C含量。样品处理方法：称取约lg肝脏，精密称定，按lml/g的比例加水，匀浆，取匀浆 1〇〇μ 1，加入内标溶液1〇〇μ 1(克拉霉素），加入lml甲醇沉淀蛋白，离心，取上清LC-MS 测定。色谱条件：Zorbax XDB C18(2. l*150mm，3· 5μπι)，柱温：35°C，流动相：甲醇-0· 1% 甲酸，梯度洗脱.流速：〇. 3mL/min，质谱条件：ESI离子源，毛细管电压3. 5kV，多反应监 测（MRM)扫描模式检测。测定结果是：丝裂霉素 C微泡超声造影剂组肝中丝裂霉素 C含量 为0. 262 μ g/g，而对照组为0. 099 μ g/g，二组有显著差异，微泡造影剂组是注射剂组的2. 6 倍。
【权利要求】
1. 一种微泡超声造影剂，由脂质体和包裹于所述的脂质体内的微泡组成，其特征在于， 所述脂质体由如下重量份的组分制成： 丝裂霉素C 1份 磷脂 0.8?30份 稳定剂 0?15份 抗氣剂 0?20份 粉末载体 20?90份。
2. 根据权利要求1所述的微泡超声造影剂，其特征在于，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷 月旨、氢化磷脂和合成磷脂中的一种或几种的混合物。
3. 根据权利要求1所述的微泡超声造影剂，其特征在于，所述稳定剂为胆酸钠、脱氧胆 酸钠、油酸、油酸钠、胆固醇、单硬脂酸甘油酯中的一种或几种的混合物。
4. 根据权利要求1所述的微泡超声造影剂，其特征在于，所述抗氧剂为维生素 E、维生 素 C、金属络合剂中的一种或几种的混合物。
5. 根据权利要求1所述的微泡超声造影剂，其特征在于，所述粉末载体为葡萄糖、蔗 糖、乳糖、海藻糖、右旋糖苷、甘露糖、山梨醇、木糖醇中的一种或几种的混合物。
6. 根据权利要求1所述的微泡超声造影剂，其特征在于，所述微泡中填充的气体选自 空气、氧气、氮气、二氧化碳、六氟化硫、氟碳气体中的一种或几种。
7. -种如权利要求1?6任一项所述的微泡超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤： (1) 将丝裂霉素 C与磷脂加入到有机溶剂中，于25°C?60°C温度下搅拌或振荡2h以上 得到磷脂复合物； (2) 在步骤（1)得到的磷脂复合物中加入稳定剂、抗氧剂搅拌或振荡溶解形成溶液； (3) 在步骤（2)得到的溶液中加入粉末载体，旋转蒸发挥干有机溶剂得到前体脂质体； (4) 在无菌条件下，取出步骤（3)得到的前体脂质体分装于西林瓶中，然后注入惰性气 体以置换西林瓶头部的空气，密封后得到所述的微泡超声造影剂。
8. 根据权利要求7所述的微泡超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂 为无水乙醇、氯仿、二氯甲烷或丙酮。
9. 一种如权利要求1?6任一项所述的微泡超声造影剂在制备含丝裂霉素 C水溶性抗 肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61K47/48GK104043139SQ201410277814
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】梁哲浩, 孙华琴, 孙泉, 袁帅, 郭家宝, 董蓓莉, 王 华, 俞振伟, 梁漪, 梁文权 申请人:浙江省中医院