一种疫苗佐剂、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水包油型疫苗佐剂、其制备及应用。所述的水包油型纳米乳疫苗佐剂，按照质量百分比包括0.1％～10％的油相、0.1％～10％的乳化剂、0.1％～3％的稳定剂、0.1％～3％的络合剂以及0.01％～10％的免疫增强剂。其制备方法包括以下步骤：(1)将免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中，获得水相；(2)将油相和乳化剂混合，获得油相；(3)将油相缓慢加入到水相中并持续搅拌，形成稳定的乳液；(4)调节乳液的pH值并定容得到初乳；(5)将初乳进行高速剪切和高压均质。本发明提供的疫苗佐剂，制备简单，使用方便，副反应小，用于稀释疫苗，尤其是猪瘟活疫苗，稳定性高，免疫效果好。
【专利说明】一种疫苗佐剂、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种疫苗佐剂、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 佐剂是指加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物 质。佐剂也是一种抗原辅助剂，与疫苗共同使用可以明显提高疫苗的免疫效果。佐剂被 用来增强疫苗免疫作用已有80多年的历史。免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较 强、持久的免疫应答，理想的免疫佐剂应该能满足以下条件：在有效剂量内无毒或毒性极 小；能刺激机体产生强大的体液免疫和/或细胞免疫应答；具有持久的免疫力；不诱导自身 免疫；无致突变、致癌、致畸形作用等。
[0003] 虽然现在已有许多佐剂应用于动物，但还没有哪一种佐剂能完全满足以上要求。 猪瘟是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种死亡率极高的急性 败血性、接触性传染病，具有流行广泛、发病率高等特点，对养猪业危害极大。世界动物卫生 组织将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，我国也将猪瘟定为一类烈性传染病，属于危害 严重、需要采取紧急严厉的强制预防、控制和扑灭的动物疫病之一。
[0004] 预防猪瘟最有效的方法就是接种猪瘟疫苗。尽管猪瘟兔化弱毒苗的广泛应用及其 它综合防治措施的实施，已控制了猪瘟的大规模流行，但近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美 洲等地区呈现复发的趋势。目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种：乳兔苗、细胞苗和淋脾 苗，这三种均为活疫苗，在临床使用上有一定的功效，但是，疫苗的免疫成功率不高，除了 疫苗质量、免疫程序、接种部位等因素以外，机体免疫功能低下以及免疫刺激不够是一个重 要因素，某些病原感染导致机体的免疫功能低下或者免疫抑制。而且部分疫苗，尤其是一些 油佐剂疫苗接种后免疫应激反应很大，使用一些低免疫应激反应佐剂是发展趋势。已有研 究发现，免疫增强剂在猪瘟疫苗使用中能提高猪免疫力，对猪瘟疫苗的抗体水平有不同程 度的影响。但是，目前尚无性能稳定的猪瘟活疫苗佐剂上市。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种疫苗佐剂、其制备方法 及应用，其目的在于通过添加免疫增强剂，使水包油型纳米乳疫苗佐剂增强疫苗本身的细 胞及体液免疫刺激能力，尤其是该疫苗佐剂还可能同时含有适用于提高猪瘟活疫苗效力的 其他水性佐剂成分，进一步提高活疫苗的攻毒保护效力，解决目前疫苗刺激不够的技术问 题。
[0006] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种疫苗佐剂，其特征在于，所 述疫苗佐剂为pH值在4. 0至9. 0之间的水包油型纳米乳，优选pH值在7. 5至9. 0之间的水 包油型纳米乳，按照质量百分比包括〇. 1%?10%的油相、〇. 1%?10%的乳化剂、〇. 1%? 3%的稳定剂、0. 1 %?3%的络合剂以及0.01 %?10%的免疫增强剂。
[0007] 优选地，所述疫苗佐剂，其所述水包油型纳米乳其平均粒径在10nm?2000nm之 间，优选在50nm?500nm之间。
[0008] 优选地，所述疫苗佐剂，其免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或 黄酮类；所述的多肽优选为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽；所述多糖优选为黄 芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多 糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和/或壳聚糖；所述黄酮类优选为淫羊藿黄酮、金橘黄 酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮和沙棘黄酮；
[0009] 所述免疫增强剂更优选为黄芪多糖。
[0010] 优选地，所述疫苗佐剂，其乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所 述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1之间，优选在1:1至 1. 5:1之间。
[0011] 优选地，所述疫苗佐剂，其亲油性表面活性剂其亲水亲油平衡值在3至8之间；
[0012] 所述亲油性表面活性剂优选为脱水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二缩 甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、单油酸甘油酯和单 油酸缩山梨醇酯中的一种或多种；所述脱水山梨醇脂肪酸酯优选为司盘20、司盘40、司盘 60、司盘80或司盘85 ;
[0013] 所述亲油性表面活性剂更优选为司盘80或二缩甘露醇单油酸酯。
[0014] 优选地，所述疫苗佐剂，其亲水性表面活性剂其亲水亲油平衡值在8至15之间；
[0015] 所述亲水性表面活性剂优选为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇 酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共 聚物中的一种或多种；所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯，优选为吐温20、吐温40、吐温60、吐温 80或吐温85 ;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，优选为泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛 沙姆407 ;
[0016] 所述亲水性表面活性剂更优选为吐温80、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙 姆 407。
[0017] 优选地，所述疫苗佐剂，其稳定剂为可溶性的二价无机盐，所述二价无机盐的阳离 子为锰离子、钙离子、锌离子或亚铁离子，所述二价无机盐的阴离子为葡萄糖酸根离子、磷 酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子或氯离子。
[0018] 优选地，所述疫苗佐剂，其络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸钠，优选乙二 胺四乙酸。
[0019] 优选地，所述疫苗佐剂，其油相为精加工烃类矿物油，优选为美孚白矿油 Marcol52、美半白矿油Marcol82、白矿油Drakeol5或白矿油Drakeol6 ;优选为美半白矿油 Marcol52 或白矿油 Drakeol5。
[0020] 优选地，所述的疫苗佐剂，还可以进一步包括一些添加剂，如抗氧化剂（二丁基羟 基甲苯、维生素 E、茶多酚等）、防腐剂（羟苯乙酯、苯甲酸钠等）。所述添加剂占纳米乳佐剂 总重量的0%?0.5%
[0021] 按照本发明的另一方面，提供了一种所述的疫苗佐剂的制备方法
[0022] 包括以下步骤：
[0023] (1)将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中，获得水相；
[0024] (2)将配方比例的油相和乳化剂混合，获得含乳化剂的油相；
[0025] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌，使得形成稳定的乳液；
[0026] (4)调节步骤⑶中获得的乳液的pH值并定容得到初乳；
[0027] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。
[0028] 优选地，所述的制备方法，其步骤（3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中持续 搅拌为磁力搅拌l〇min?40min。
[0029] 优选地，所述的制备方法，其步骤（5)所述高速剪切速率为8000?15000rpm，剪切 时间为1?7min ;所述高压均质压力为600?2000bar，循环次数为1?9次，优选800? 1600bar压力条件下勻质3?5个循环。
[0030] 本发明提供的疫苗佐剂应用于猪瘟活疫苗的稀释，有助于发挥免疫作用。
[0031] 在5至6周的SPF级的Balb/c小鼠上对所述的纳米疫苗佐剂进行了安全性评价， 结果发现，免疫之后无一只死亡，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明本发明 的纳米疫苗佐剂是安全、可靠的。所述的纳米疫苗佐剂跟猪瘟活疫苗混合后免疫小鼠后，检 测到CSFV抗体，并能诱导小鼠的明显的细胞和体液免疫反应。
[0032] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于采用含有免 疫增强剂的水包油型纳米乳，可与疫苗的混合使用，与现有的生理盐水稀释疫苗技术相比， 能够取得以下有益效果：
[0033] 1.本发明的纳米疫苗佐剂，可以显著增强疫苗的细胞及体液免疫刺激能力，提高 活疫苗的攻毒保护效力。以猪瘟疫苗为例，目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种：乳兔 苗、细胞苗和淋脾苗，并且这三种均为活疫苗，在临床使用上也显示出明显的功效。然而，仍 不能达到令人满意的完全保护的效果。采用本发明提供的疫苗佐剂，能明显提高免疫应答 效果。
[0034] 2.本发明提供的纳米疫苗佐剂稀释猪瘟活疫苗疫苗的效果，相较于单独使用生理 盐水等稀释猪瘟活疫苗对小鼠的免疫作用更明显，增强了疫苗的效价，节约了成本。
[0035] 3.本发明的纳米疫苗佐剂制备方法，工艺简单，成本低，得到的剂型稳定。制备的 水包油型纳米乳剂，稳定期长，易储存，免疫效果好，保护期延长，易于注射，副反应很小。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1是实施例10皮下注射该佐剂稀释剂后小鼠的体重变化；
[0037] 图2是实施例11免疫后血清中ELISA抗体动态变化；
[0038] 图3是实施例11的IL-4标准曲线；
[0039] 图4是实施例11接种疫苗后小鼠血清中IL_4水平；
[0040] 图5是实施例11的IL-6标准曲线；
[0041] 图6是实施例11接种疫苗后小鼠血清中IL_6水平；
[0042] 图7是实施例11的IFN-r标准曲线；
[0043] 图8是实施例11接种疫苗后小鼠血清中IFN-r水平。
【具体实施方式】
[0044] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0045] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH至在4. 0至9. 0之间的水包油型纳米乳，优选pH值 在7. 5至9. 0之间的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质量百分比包括0. 1%?10% 的油相、〇. 1%?10%的乳化剂、〇. 1%?3%的稳定剂、0. 1%?3%的络合剂以及0.01%? 10%的免疫增强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径在l〇nm?2000nm之间，优 选在50nm?500nm之间；多分散指数Η)Ι彡0· 50。
[0046] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类；所述的多肽优 选为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽；所述多糖优选为黄芪多糖、人参多糖、香菇 多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多 糖、大枣多糖和/或壳聚糖；所述黄酮类优选为淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大 豆黄酮和沙棘黄酮；所述免疫增强剂更优选为黄芪多糖。
[0047] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1之间，优选在1:1至1. 5:1之间。所述亲油性 表面活性剂其亲水亲油平衡值在3至8之间，优选为脱水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇 油酸酯、二缩甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、单油 酸甘油酯和单油酸缩山梨醇酯中的一种或多种；所述脱水山梨醇脂肪酸酯优选为司盘20、 司盘40、司盘60、司盘80或司盘85。所述亲油性表面活性剂更优选为司盘80或二缩甘露 醇单油酸酯。所述亲水性表面活性剂其亲水亲油平衡值在8至15之间，优选为聚氧丙烯甘 露醇二油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯 月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或多种；所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯， 优选为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85 ;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，优选 为泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。所述亲水性表面活性剂更优选为吐温80、 吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙姆407。
[0048] 所述稳定剂为可溶性的二价无机盐，所述二价无机盐的阳离子为锰离子、钙离子、 锌离子或亚铁离子，所述二价无机盐的阴离子为葡萄糖酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离 子、磷酸二氢根离子或氯离子。所述稳定剂优选为葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、磷 酸钙、葡萄糖酸铁和氯化钙，优选葡萄糖酸锰或葡萄糖酸钙。
[0049] 所述络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸钠，优选乙二胺四乙酸。
[0050] 所述油相为精加工烃类矿物油，通过蒸馏油以及通过实施后续加工步骤而获得的 烃类矿物油，后续加工步骤例如脱硫作用、脱浙青作用、芳香化合物提取以及蜡提取步骤以 及其他精加工步骤，优选为美孚白矿油Marc 〇152、美孚白矿油Marc〇182、白矿油Drake〇15 或白矿油Drakeol6 ;优选为美孚白矿油Marcol52或白矿油Drakeol5。
[0051] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0052] (1)将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中，获得水相。
[0053] (2)将油相和乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0054] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌，优选磁力搅拌lOmin? 40min，使得形成稳定的乳液。
[0055] (4)调节步骤⑶中获得的乳液的pH值并定容得到初乳。优选使用0· lmol/L的 氢氧化钠溶液调节pH值。
[0056] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为8000?15000rpm，剪切时间为1? 7min ;高压均质压力为600?2000bar，循环次数为1?9次，优选800?1600bar压力条 件下匀质3?5个循环。微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0057] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0058] 本发明提供的疫苗佐剂应用于猪瘟活疫苗稀释。目前市场上预防猪瘟的疫苗主要 有三种：乳兔苗、细胞苗和淋脾苗，并且这三种均为活疫苗，在临床使用上也显示出明显的 功效。然而，仍不能达到令人满意的完全保护的效果。用本发明的佐剂稀释所述三种，可以 显著增强疫苗的细胞及体液免疫刺激能力，提高活疫苗的攻毒保护效力，减少疫苗用量，从 而降低成本。
[0059] 以下为实施例：
[0060] 实施例1
[0061] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为8. 0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质 量百分比包括5 %的油相、5%的乳化剂、1 %的稳定剂、3 %的络合剂以及0. 5 %的免疫增 强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为108. 4± 17. 6nm;多分散指数PDI为 0·174。
[0062] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶。
[0063] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为1. 5:1。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇油酸酯，其 亲水亲油平衡值为4. 3。所述亲水性表面活性剂为吐温80,其亲水亲油平衡值为15。
[0064] 所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
[0065] 所述络合剂为乙二胺四乙酸。
[0066] 所述油相为美孚白矿油Marcol52。
[0067] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0068] (1)将0. 5%的免疫增强剂、1 %的稳定剂和3%的络合剂均匀分散于30ml水中，获 得水相。
[0069] (2)将5%的油相和5%的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0070] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min，使得形成稳定 的乳液。
[0071] (4)调节步骤（3)中获得的乳液用0· lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8. 0并 定容得到初乳。
[0072] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为l〇〇〇〇rpm，剪切时间为3min ;高压均 质压力为lOOObar，循环次数为3次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0073] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0074] 实施例2
[0075] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为8. 5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质 量百分比包括10 %的油相、10 %的乳化剂、2 %的稳定剂、2 %的络合剂以及1 %的免疫增 强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为745. 2±20. 8nm ;多分散指数PDI为 0·207。
[0076] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的香菇多糖。
[0077] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为2:1。所述亲油性表面活性剂为聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍 生物。其亲水亲油平衡值为3. 0。所述亲水性表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油，其亲水亲油平 衡值为13. 3。
[0078] 所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
[0079] 所述络合剂为乙二胺四乙酸。
[0080] 所述油相为美孚白矿油Marco 152。
[0081] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0082] (1)将1%的免疫增强剂、2%的稳定剂以及2%的络合剂均匀分散于30ml水中，获 得水相。
[0083] (2)将10%的油相、10%的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0084] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌30min，使得形成稳定 的乳液。
[0085] (4)调节步骤（3)中获得的乳液用0· lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8. 5之 间并定容得到初乳。
[0086] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为15000rpm，剪切时间为3min ;高压均 质压力为1200bar，循环次数为3次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0087] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0088] 实施例3
[0089] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为4. 0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质 量百分比包括〇. 5%的油相、1 %的乳化剂、0. 5%的稳定剂、2 %的络合剂以及0. 01 %的免 疫增强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为55. 9± 13. lnm ;多分散指数PDI为 0·108。
[0090] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的大豆黄酮。
[0091] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为1:1。所述亲油性表面活性剂为聚氧丙烯甘露醇二油酸 酯，其亲水亲油平衡值为8. 0。所述亲水性表面活性剂为聚氧乙烯月桂醇醚，其亲水亲油平 衡值为9. 5。
[0092] 所述稳定剂为葡萄糖酸钙。
[0093] 所述络合剂为乙二胺四乙酸。
[0094] 所述油相为美孚白矿油Marco 152。
[0095] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0096] (1)将0. 01 %的免疫增强剂、0. 5%的稳定剂以及2%的络合剂均匀分散于30ml水 中，获得水相。
[0097] (2)将0. 5%的油相和1 %的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0098] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌40min，使得形成稳定 的乳液。
[0099] (4)调节步骤⑶中获得的乳液用0. lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至4. 0并 定容得到初乳。
[0100] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为8000rpm，剪切时间为7min ;高压均质 压力为1600bar，循环次数为5次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0101] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0102] 实施例4
[0103] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为7. 5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质 量百分比包括〇. 1 %的油相、〇. 1 %的乳化剂、〇. 1 %的稳定剂、0.2%的络合剂以及0.05% 的免疫增强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为108. 3±27. 5nm ;多分散指数 PDI 为 0· 133。
[0104] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的淫羊藿黄酮。
[0105] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为1. 5:1。所述亲油性表面活性剂为单硬脂酸甘油酯，其亲 水亲油平衡值为5. 5。所述亲水性表面活性剂为吐温85,其亲水亲油平衡值为11。
[0106] 所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
[0107] 所述络合剂为聚丙烯酸钠。
[0108] 所述油相为白矿油Drakeol5。
[0109] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0110] ⑴将〇. 1%的稳定剂、0.2%的络合剂以及0.05%的免疫增强剂均匀分散于30ml 水中，获得水相。
[0111] ⑵将0. 1 %的油相和0. 1 %的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0112] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌lOmin，使得形成稳定 的乳液。
[0113] (4)调节步骤（3)中获得的乳液用0· lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7. 5并 定容得到初乳。
[0114] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为l〇〇〇〇rpm，剪切时间为3min ;高压均 质压力为2000bar，循环次数为9次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0115] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0116] 实施例5
[0117] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为8. 0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质量 百分比包括5%的油相、5%的乳化剂、1%的稳定剂、3%的络合剂以及1%的免疫增强剂， 余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为200. 4± 17. 7nm ;多分散指数PDI为0. 104。
[0118] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的黄芪多糖。
[0119] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为1.5:1。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇单油酸酯， 其亲水亲油平衡值为4. 3。所述亲水性表面活性剂为吐温80,其亲水亲油平衡值为15。 [0120] 所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
[0121] 所述络合剂为乙二胺四乙酸。
[0122] 所述油相为美孚白矿油Marc〇152。
[0123] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0124] (1)将1%的稳定剂、3%的络合剂以及1%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中，获 得水相。
[0125] (2)将5%的油相和5%的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0126] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min，使得形成稳定 的乳液。
[0127] (4)调节步骤（3)中获得的乳液用0. lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8. 0并 定容得到初乳。
[0128] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为12000rpm，剪切时间为5min ;高压均 质压力为lOOObar，循环次数为4次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0129] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0130] 实施例6
[0131] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为9.0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质 量百分比包括2 %的油相、7. 5 %的乳化剂、1 %的稳定剂、3 %的络合剂以及10 %的免疫增 强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为502. 3±20. lnm ;多分散指数PDI为 0· 237。
[0132] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的枸杞多糖。
[0133] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为1.25:1。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇单油酸 酯，其亲水亲油平衡值为4. 3。所述亲水性表面活性剂为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，其亲水 亲油平衡值为8.0。
[0134] 所述稳定剂为葡萄糖酸钙。
[0135] 所述络合剂为乙二胺四乙酸。
[0136] 所述油相为白矿油Drakeol5。
[0137] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0138] (1)将1%的稳定剂、3%的络合剂以及10%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中， 获得水相。
[0139] (2)将2%的油相和7. 5%的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0140] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min，使得形成稳定 的乳液。
[0141] (4)调节步骤（3)中获得的乳液用0. lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至9. 0并 定容得到初乳。
[0142] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为lOOOOrpm，剪切时间为3min ;高压均 质压力为800bar，循环次数为7次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0143] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0144] 实施例7
[0145] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为7. 5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质 量百分比包括3%的油相、2 %的乳化剂、0. 5 %的稳定剂、0. 1 %的络合剂以及0. 1 %的免疫 增强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为1069. 7±53. 2nm ;多分散指数PDI为 0· 324。
[0146] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的沙棘黄酮。
[0147] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为1:1。所述亲油性表面活性剂为司盘80,其亲水亲油平 衡值为4. 3。所述亲水性表面活性剂为泊洛沙姆407,其亲水亲油平衡值为15。
[0148] 所述稳定剂为葡萄糖酸锌。
[0149] 所述络合剂为聚丙烯酸钠。
[0150] 所述油相为美孚白矿油Marcol52。
[0151] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0152] (1)将0. 5 %的稳定剂、0. 1 %的络合剂以及0. 1 %的免疫增强剂均匀分散于30ml 水中，获得水相。
[0153] (2)将3%的油相和2%的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0154] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min，使得形成稳定 的乳液。
[0155] (4)调节步骤（3)中获得的乳液用0· lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7. 5并 定容得到初乳。
[0156] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为8000rpm，剪切时间为lmin ;高压均质 压力为600bar，循环次数为1次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0157] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0158] 实施例8
[0159] 本发明提供的疫苗佐剂，为pH为8. 5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂，按照质 量百分比包括7. 5 %的油相、3 %的乳化剂、3 %的稳定剂、3 %的络合剂以及0. 1 %的免疫增 强剂，余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为1832. 2±40. 4nm ;多分散指数PDI为 0. 250。
[0160] 所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的赛弗诺多肽，购于武汉光谷世傲生物科技 有限公司。
[0161] 所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂 与亲油性表面活性剂的质量比例为1: 2。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇单油酸酯，其 亲水亲油平衡值为4. 3。所述亲水性表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油，其亲水亲油平衡值 为15。
[0162] 所述稳定剂为氯化钙。
[0163] 所述络合剂为乙二胺四乙酸。
[0164] 所述油相为美孚白矿油Marcol52。
[0165] 本发明提供的疫苗佐剂，其制备方法，包括以下步骤：
[0166] (1)将3%的稳定剂、3%的络合剂以及0. 1%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中， 获得水相。
[0167] (2)将7. 5%的油相和3%的乳化剂混合，获得含乳化剂的油相。
[0168] (3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min，使得形成稳定 的乳液。
[0169] (4)调节步骤（3)中获得的乳液用0· lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8. 5并 定容得到初乳。
[0170] (5)将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌， 获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为l〇〇〇〇rpm，剪切时间为3min ;高压均 质压力为600bar，循环次数为3次；微孔滤膜为0. 22 μ m的微孔滤膜。
[0171] 按照本方法制得的疫苗佐剂，宜充氮灌装，可室温下放置。
[0172] 实施例9
[0173] 纳米疫苗佐剂稳定性参数Ke的测定
[0174] 稳定性常数的计算公式如下：Ke = (AfAVA，100% (0 < Ke < 1)。式中A。为乳 剂的稀释液在设定波长处测得的吸光度；A为经离心后离心管底部乳剂的稀释液在同一波 长处测得的吸光度。稳定性常数Ke越小，说明乳剂在离心前后变化越小，乳剂越稳定。
[0175] 取乳剂5mL置于10mL离心试管中，4000r ?mirT1，离心15min，用微量进样器精密量 取试管底部样品50yL置10mL刻度试管中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，以超纯水为空白， 在可见区波长500nm处测定吸光度。同法将未离心的乳剂用微量进样器精密量取试管底部 样品50 μ L置10mL刻度试管中，同法测定，计算Ke。
[0176]
【权利要求】
1. 一种疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂为pH值在4. 0至9. 0之间的水包油型纳 米乳，优选pH值在7. 5至9. 0之间的水包油型纳米乳，按照质量百分比包括0. 1 %?10% 的油相、〇. 1%?10%的乳化剂、〇. 1%?3%的稳定剂、0. 1%?3%的络合剂以及0.01%? 10 %的免疫增强剂。
2. 如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述水包油型纳米乳，平均粒径在 10nm?2000nm之间，优选在50nm?500nm之间。
3. 如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述免疫增强剂为具有免疫增强作用 的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类；所述的多肽优选为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽； 所述多糖优选为黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多 糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和/或壳聚糖；所述黄酮类优选 为淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮和沙棘黄酮； 所述免疫增强剂更优选为黄芪多糖。
4. 如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和 亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1 之间，优选在1:1至1.5:1之间。
5. 如权利要求4所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述亲油性表面活性剂其亲水亲油平 衡值在3至8之间； 所述亲油性表面活性剂优选为脱水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二缩甘露 醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、单油酸甘油酯和单油酸 缩山梨醇酯中的一种或多种；所述脱水山梨醇脂肪酸酯优选为司盘20、司盘40、司盘60、司 盘80或司盘85 ; 所述亲油性表面活性剂更优选为司盘80或二缩甘露醇单油酸酯。
6. 如权利要求4所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述亲水性表面活性剂其亲水亲油平 衡值在8至15之间； 所述亲水性表面活性剂优选为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚 氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物 中的一种或多种；所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯，优选为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或 吐温85 ;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，优选为泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆 407 ； 所述亲水性表面活性剂更优选为吐温80、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙姆 407。
7. 如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述稳定剂为可溶性的二价无机盐，所 述二价无机盐的阳离子为锰离子、钙离子、锌离子或亚铁离子，所述二价无机盐的阴离子为 葡萄糖酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子或氯离子。
8. 如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙 烯酸钠，优选乙二胺四乙酸。
9. 如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述油相为精加工烃类矿物油，优选为 美半白矿油Marcol52、美半白矿油Marcol82、白矿油Drakeol5或白矿油Drakeol6 ;优选为 美半白矿油Marcol52或白矿油Drakeol5。
10. 如权利要求1至9任意一项所述的疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中，获得水相； (2) 将配方比例的油相和乳化剂混合，获得含乳化剂的油相； (3) 将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌，使得形成稳定的乳液； (4) 调节步骤（3)中获得的乳液的pH值并定容得到初乳； (5) 将步骤（4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌，获得 无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。
11. 如权利要求1至9所述的疫苗佐剂应用于猪瘟活疫苗稀释。
【文档编号】A61K9/107GK104147599SQ201410287027
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】刘卫, 梁孔贤, 许琦, 万江陵, 杨祥良 申请人:华中科技大学, 武汉百思凯瑞纳米科技有限公司