一种具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂及其制备方法和应用的制作方法

一种具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂及其制备方法。该方法是通过光接枝的方法将神经生长因子（NGF）固定在水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒（Fe3O4-OA-NAPI-AA）表面，再吸附能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA。将所述纳米材料转染试剂作用于MPP+诱导后的体外帕金森症模型PC12细胞，细胞的凋亡受到明显的抑制，其中神经生长因子受体（NGFR）表达上调，α-突触核蛋白表达下调，同时影响了经典的BAX，P53，Bcl-2凋亡通路，达到治疗帕金森症的目的。本发明纳米材料转染试剂无毒、副作用小，能顺利携载基因进入细胞、作用明显，值得推广应用于帕金森症的治疗。
【专利说明】一种具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转 染试剂及其制备方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米生物材料领域。更具体地，涉及一种具有基因治疗帕金森症效果 的多功能纳米生物材料转染试剂及其制备方法和应用。

【背景技术】
[0002] 帕金森症（Parkinson' s disease, H))，是一种常见的中老年神经系统变性疾病， 由英国医生詹姆士·帕金森（James Parkinson)于1817年首先描述,早期被称为"震颤麻 痹"，后将此病命名为帕金森症（Parkinson's disease)并沿用至今。"震颤麻痹"顾名思义 是因为患者患病后表现出动作迟缓，手或者脚及身体其他部分发生震颤，身体失去柔韧性， 肌肉僵硬。
[0003] 目前帕金森症的主要治疗手段以药物治疗为主，其中最重要的就是左旋多巴胺制 齐[J(L-dopa)，最早由Hornykiewicz提出左旋多巴胺制剂可以治疗帕金森症，并由Cotzias 成功将左旋多巴胺制剂作为治疗帕金森症的有效制剂。左旋多巴胺制剂在帕金森症的治 疗中起着关键性的作用，目前所有的帕金森症患者都选择左旋多巴胺试剂作为治疗手段。 但是服用左旋多巴胺制剂的同时会产生很多并发症，例如"异动症"、"开关效应"、"剂末效 应"。并且，使用左旋多巴胺治疗的同时还会产生神经精神症状，例如：幻觉、精神错乱、焦 虑、抑郁等，给病人带来了极大的痛苦和不便。
[0004] 基因治疗是现代科学家提出的一种全新的治疗手段，可以治疗多种复杂疾病，癌 症、遗传性疾病、心血管疾病、神经系统疾病等都是基因治疗的主要领域。基因治疗是指通 过外来遗传物质干预疾病基因层面的发生、恶化和进展，替代并纠正人自身基因结构和功 能上的错乱，消灭病变细胞或者提高机体清理病变细胞的能力。过去的几年里，基因治疗在 临床上取得了长足的进步。临床上，基因治疗也遇到了很多的困难。未来基因治疗的主要 目标是，研制安全高效的基因导入系统，可以将外源基因靶向输入到靶细胞。其中，RNAi是 基因治疗的一种有效手段，通过人为地引入与内源靶基因相配对的双链RNA，诱导内源靶基 因的mRNA降解，达到阻止基因表达的功能。目前科学家已经开始肿瘤、病毒感染、神经系统 疾病、显性遗传病等多种疾病的基因治疗研究。据英国广播公司（BBC)3月17日报道，美国 科学家在《柳叶刀一神经病学》杂志上表示，使用基因疗法治疗帕金森病首次在临床上取得 成功。帕金森病病患丘脑下核中一种化学物质氨基丁酸（GABA)的浓度会减少，英国帝 国理工学院的基因疗法专家尼克勒斯?马萨拉基斯领导的研究团队制造出了一种病毒，该 病毒能使用一个基因来"感染"细胞，增加患者体内GABA的浓度。但是接受基因疗法和未 接受基因疗法病人的运动能力改进之间差别仅为10. 4%，并不明显，加上许多人对基因疗法 的安全性存在质疑，该方法并未得到有效的推广应用。
[0005] 另外，通过靶向给药系统将药物运送到机体从而实现疾病的治疗早已成为了研究 热点。祀向给药系统（Targeting durg delivery system, TDDS)，诞生于20世纪70年代， 是一种新的技术和工艺，它是指药物通过局部或者全身血液循环浓缩并定位到靶组织、靶 器官以及靶细胞的给药系统。靶向给药系统是通过脂质体、微球、微囊、纳米粒等载体，经口 腔给药、直肠给药、鼻腔给药或皮肤给药的方式将药物靶向输送到患处。靶向给药系统具有 药量小，作用大，毒副作用小的优点，而且靶向制剂也从传统的单一抗癌制剂发展到成为一 切具有靶向性的试剂。靶向性的机制主要有：多重靶向给药系统，生物化学靶向系统，生物 免疫靶向系统。其中生物化学靶向系统和生物免疫靶向系统是现在药物靶向系统的研究 热点。近些年，科研工作者们试图构建高效的药物靶向运输系统，以提高药物对靶细胞的靶 向选择性，降低药物用量，减少药物的毒副作用；同时增强载体对药物的控释能力。靶向给 药系统根据其制剂源动力不同可分为被动靶向制剂和主动靶向制剂以及前提靶向制剂。在 靶向给药系统中，药物载体以及药物靶标的选择是至关重要的。近些年纳米材料的研究发 展提供了一种新型的药物载体。本发明人前期的研究制备出水凝胶包覆纳米四氧化三铁颗 粒，符合纳米药物载体的要求，但是针对特定的病症、特定的药物，水凝胶包覆纳米四氧化 三铁颗粒如何实现药物的携载、如何顺利进入机体、如何祀向定位等等问题，仍然是一项重 大的研究课题。
[0006] 同时，脂质体等传统转染试剂毒副作用大，而且一般都是亲脂性的溶剂，他们和细 胞膜的亲和性都比较大，容易透过细胞膜，这些转染试剂能够直接导致细胞死亡，如脂质体 可引起70%作用的细胞死亡。因此，制备一种低毒高效的能够进入机体的药物载体对ro的 治疗意义重大。目前，未见有相关的报道，也未见有将纳米生物材料靶向给药结合基因调控 并应用于帕金森症的治疗研究。


【发明内容】

[0007] 本发明要解决的技术问题是克服现有帕金森症治疗及传统药物转染试剂的缺陷 和技术不足，提供一种具有基因治疗帕金森症效果的纳米材料转染试剂。
[0008] 本发明的目的是提供上述具有基因治疗帕金森症效果的纳米材料转染试剂的制 备方法。
[0009] 本发明另一目的是提供上述具有基因治疗帕金森症效果的纳米材料转染试剂在 治疗帕金森症方面的应用。
[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明提供了一种具有基因治疗帕金森症效果的纳米材料转染试剂，是通过光接枝的 方法将神经生长因子（NGF)固定在水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒（Fe304-0A-NAPI-AA)表 面，再利用其中的水凝胶吸附能够干扰α -突触核蛋白合成的质粒DNA制备得到。
[0011] 所述能够干扰α -突触核蛋白合成的质粒DNA是指pDNA ;所述pDNA是携带有SEQ ID NO. 1所示序列的GV102载体。
[0012] 所述纳米材料转染试剂不仅克服了传统转染试剂高毒副作用的缺陷，还能够顺利 的将siRNA或pDNA转染到细胞内，干扰靶蛋白α -突触核蛋白的合成，进而阻止PC12细胞 模型的凋亡。
[0013] 本发明还提供了上述具有基因治疗帕金森症效果的纳米材料转染试剂的制备方 法，步骤如下： S1.制备光活性神经生长因子； S11.按照1 :4?1 :5的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶 液，pH=7. 4)，再加入800?90(^g N-琥珀酰亚胺酯； 512. 将60?lOOPg的NGF加入26?30mL步骤S11得到的含有N-琥珀酰亚胺酯和 二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7. 4)中，冰浴、避光条件下搅拌反应 50?72h ;离心纯化产物，即得到光活性神经生长因子，冷冻干燥备用； 513. 使用前，加入磷酸盐缓冲溶液溶解并调整浓度； 32.制备光接枝神经生长因子纳米材料（斤6304-(^-见?4^4-如?)）； 521. 按照比例，称取1?5mg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒，溶于5?30mL磷酸盐 缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 将光活性神经生长因子加入磁性水凝胶溶液中，使得磁性水凝胶与光活性神经生 长因子的摩尔质量比为50 :1?300 :1，在避光混合均匀，800?3000W超声分散10?30min 后转移至培养皿，150?200W的紫外灯下10cm处照射8?12s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂； 按照lmg的Fe304-0A-NIPA-AA-NGF溶于4mL磷酸盐缓冲溶液的比例，将二者混勻，再向 其中加入10?lOOPg pDNA，冰浴搅拌2?3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调 整浓度备用。
[0014] 优选地，S12所述离心是3500?5000rpm/min的转速下，离心20?40min ;更优选 地，S12所述离心是4000rpm/min的转速下，离心30min。
[0015] S13所述调整浓度至lng/^L。
[0016] S21所述水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒是本发明人课题组制备的，方法参照本 课题组申请号为201110183415. 3的专利所述。
[0017] 按照体积比，S22所述的磁性水凝胶与光活性神经生长因子的摩尔质量比为100 : 1〇
[0018] S22所述的超声的条件为使用超声波清洗机，1200?2500W超声分散10?20min。
[0019] S22所述紫外照射的条件为：150W的紫外灯下10cm处照射10s。
[0020] S3所述冰浴搅拌3d。
[0021] 利用上述制备方法制备得到的多功能纳米生物材料转染试剂也在本发明的保护 范围之内。
[0022] 本发明还提供上述多功能纳米生物材料转染试剂或上述制备方法制备得到的多 功能纳米生物材料转染试剂在制备帕金森症治疗药物方面的应用。
[0023] 本发明人为了克服现有帕金森症治疗及传统药物转染试剂的缺陷和技术不足， 通过大量的研究和探索，制备出所述的具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物 材料转染试剂。将神经生长因子（NGF)光接枝固定于水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒 (Fe304-0A-NAPI-AA)表面，再利用水凝胶吸附能够干扰α -突触核蛋白表达的质粒后，将 干扰质粒运送到细胞内。在体内，PDNA能够干扰α-突触核蛋白的表达，抑制相关神经细 胞的凋亡；再加上NGF能够抑制细胞凋亡，并发挥其对神经细胞的营养作用，细胞凋亡情况 得到进一步的抑制，从而帕金森症逐步得到改善，进而达到治疗帕金森病的目的。
[0024] 研究指出，路易小体（Lewy Body)是一种嗜酸性的核心致密的包涵体，存在于细胞 浆中，周围有细丝状晕圈。帕金森病人中脑黑质区病变位置的多巴胺能神经元含有路易小 体，因此路易小体被认为是帕金森症的主要病理特征，也是帕金森症诊断的主要依据。而 α -突触核蛋白（a -synuclein)是路易小体的主要成分，是帕金森病的罪魁祸首。α -突 触核蛋白是一个全长140个氨基酸的蛋白质，α-突触核蛋白的致病性突变有可能是由于 他的磷酸化和硝化。本发明选择α-突触核蛋白作为靶标，成功的制备出携带有干扰其表 达的质粒的多功能纳米药物载体，并能够成功将干扰质粒运载到体内发挥作用。
[0025] 而神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF)是神经营养因子中最早被发现和研 究最为透彻的神经营养因子，具有神经元的营养和促进神经突触生长的双重生物学功能， NGF对神经中枢和周围神经元的分化、发育、再生和生长和功能性表达都有着重要的调控作 用。NGF与受体结合后，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、 并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇 钙、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或 功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。通过本发明的多功能纳米药物载体，可以 将NGF运载到体内，发挥其对神经细胞的营养作用和对细胞凋亡的抑制作用，进一步保证 对帕金森症的改善和治疗效果。
[0026] 在本发明制备所述具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂 的过程中，如何保证光接枝并成功制备复合要求的能够携载药物的纳米材料，其中有着复 杂的影响因素和控制工艺，每一步都是非常关键的。另外，即使成功制备出复合要求的能够 携载药物的纳米材料以后，对于该纳米材料是否能够进入细胞，并将其携载的药物运载到 目的地仍然是非常关键的一步，其粒径、表面电荷等等都是非常关键的影响因素。负载药物 的粒径、电荷以及负载量都有可能造成负载不成功、破坏载体的纳米凝胶(使其不能够形成 凝胶)、导致粒径变大等问题。另外，溶剂以及药物的pH值、电荷、载药量等因素之间是相互 影响相互制约的，细微的差别可能造成严重的后果，药物和载体相互作用可能会造成整体 粒径出现数量级的差异。
[0027] 本发明人通过长期的探索和大量的研究，克服了种种因素和技术难题， 终于成功制备出具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂 (Fe304-0A-NAPI-AA-NGF-pDNA)，并作用于PC12细胞模型，对PC12细胞的蛋白表达进行分 析发现，神经生长因子受体（NGFR)表达上调，α -突触核蛋白表达下调，经典凋亡通路中的 ΒΑΧ，Ρ53下调，Bcl-2上调，即影响了经典的ΒΑΧ，Ρ53, Bcl-2凋亡通路，表面本发明的多功 能纳米生物材料转染试剂能够很好的改善和治疗帕金森症，在帕金森症的治疗应用和研究 中，具体很好的推广应用前景。
[0028] 本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂及其 制备方法，成功的将光活性NGF接枝到Fe304-0A -NIPA-AA磁性水凝胶上，再利用水凝胶吸 附能够干扰α-突触核蛋白表达的质粒后，将干扰质粒运送到细胞内。在体内，pDNA能够 干扰α-突触核蛋白的表达，抑制相关神经细胞的凋亡；再加上NGF能够抑制细胞凋亡，并 发挥其对神经细胞的营养作用，细胞凋亡情况得到进一步的抑制，从而帕金森症逐步得到 改善，进而达到治疗帕金森病的目的。
[0029] 将本发明的多功能纳米生物材料转染试剂作用于PC12细胞模型，对PC12细胞的 蛋白表达进行分析发现，神经生长因子受体（NGFR)表达上调，α-突触核蛋白表达下调，经 典凋亡通路中的ΒΑΧ，Ρ53下调，Bcl-2上调，即影响了经典的ΒΑΧ，Ρ53, Bcl-2凋亡通路，表 面本发明的多功能纳米生物材料转染试剂可以抑制帕金森症凋亡模型的凋亡现象，质粒的 加入导致α-突触核蛋白的表达下降，可以引起凋亡作用的抑制，达到很好的改善和治疗 帕金森症的目的，在帕金森症的治疗应用和研究中，具体很好的推广应用前景。
[0030] 本发明纳米材料转染试剂无毒、副作用小，粒径分布于220?270nm之间，各种性 能均符合药物载体及安全要求，能顺利携载药物进入细胞，对帕金森症有明显的改善和疗 效，值得推广应用于帕金森症的治疗。

【专利附图】

【附图说明】
[0031] 图1为不同生物材料的红外图谱。
[0032] 图2为本发明制备的纳米材料转染试剂的粒径与电镜扫描检测。
[0033] 图3为X射线光电子能谱仪检测三种不同药物（Fe304-0A，Fe 304-0A-NIPA-AA， Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)的电子能谱。
[0034] 图 4 为 MPP+浓度筛选（24h，72h，144h)。
[0035] 图5为不同生物材料作用于PC12细胞模型后的凋亡率。
[0036] 图6为不同生物材料作用于PC12细胞72h后经DAPI染色后于荧光显微镜下观察 的细胞形态图。
[0037] 图7为不同纳米生物材料诱导α -突触核蛋白表达情况。
[0038] 图8为不同纳米生物材料诱导BAX、Bcl_2、P53蛋白表达情况。
[0039] 图9为不同纳米生物材料诱导NGF受体蛋白表达情况。

【具体实施方式】
[0040] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试 齐IJ、方法和设备。
[0041] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0042] 以下实施例中所用交感神经细胞（PC12细胞系)由中山大学医学院动物中心提供， 经本实验室传代培养。
[0043] 神经生长因子（NGF)，购自广州新特药店；胰酶、低糖DMEM培养基均为GIBC0BRL 公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；24孔聚苯乙烯组织培养 基板为美国Corning康宁公司产品。
[0044] 干扰质粒pDNA购自上海基凯基因公司；所述pDNA是携带有SEQ ID NO. 1所示序列 的GV102载体。
[0045] SEQ ID NO. 1所示序列如下： gatcccACCAAAGAGCAAGTGACAAATctcgagATTTGTCACTTGCTCTTTGGTtttttggat。
[0046] 以下实施例中所用的水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒（Fe304-0A-NIPA-AA)由发明 人自己制备，制备方法参考本发明人申请号为201110183415. 3的专利所述。
[0047] 为了更清晰明确的理解本发明及实施例的内容，现将个物质的名称统一如下： Fe304-0A :油酸包裹的四氧化三铁纳米粒。
[0048] Fe304-0A-NIPA-AA :磁性水凝胶（即水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒，附图中标示 为 NP-NIPA-AA)。
[0049] Fe304-0A_NIPA-AA-NGF :光接枝神经生长因子纳米材料(光接枝NGF纳米材料，另 外附图中标示为NP-NIPA-AA-NGF)。
[0050] Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA :携载干扰质粒(药物）的新型多功能纳米生物材料转 染试剂（即本发明制备的纳米材料转染试剂，附图中标示为NP-NIPA-AA-NGF(pDNA))。
[0051] AzPhNGF :光活性 NGF。
[0052] 发明人经过大量的实验和验证，本发明所述的方法能够成功的将光活性NGF接枝 到Fe 304-0A -NIPA-AA磁性水凝胶上，再利用水凝胶吸附能够干扰α -突触核蛋白表达的质 粒后，将干扰质粒运送到细胞内，发挥作用。
[0053] 以下实施例呈现出部分实验数据来说明问题。
[0054] 实施例1本发明多功能纳米生物材料转染试剂的制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF 511. 按照1 :4的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， ρΗ=7. 4)，再加入80〇μ8 Ν-琥珀酰亚胺酯；将6〇μ8的NGF加入26mL上述含有Ν-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7.4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应50h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在4000rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0055] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取lmg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA-AA)，溶于 10mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取lmL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF (AzPhNGF)(其中 Fe304-0A_NIPA-AA与AzPhNGF的摩尔质量比为100 :1 )，在避光条件下混合均匀，并用超声波 清洗器，1200W超声清洗分散15min后转移至培养皿中，于150W紫外灯下10cm处照射10s， 真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入2(^g pDNA，冰浴搅拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0056] 实施例2本发明多功能纳米生物材料转染试剂的制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF S11.按照1 :5的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入80〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将6〇μ8的NGF加入27mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7.4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应55h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在3500rpm/min 的转速下，离心40min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0057] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取lmg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA-AA)，溶于 20mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取1. 5mL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA 与AzPhNGF的摩尔质量比为150 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器1500W超声 清洗分散l〇min后转移至培养皿中，于150W紫外灯下10cm处照射10s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入3(^g pDNA，冰浴搅拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0058] 实施例3本发明多功能纳米生物材料转染试剂的制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF 511. 按照1 :4. 5的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入85〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将6〇μ8的NGF加入30mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7. 4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应60h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，lOKNa)，在4500rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0059] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取3mg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA_AA)，溶于 10mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取2mL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA与 AzPhNGF的摩尔质量比为200 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器1800W超声清 洗分散20min后转移至培养皿中，于160W紫外灯下10cm处照射12s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入5(^g pDNA，冰浴搅拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0060] 实施例4本发明多功能纳米生物材料转染试剂的制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF S11.按照1 :4的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入90〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将10〇μ8的NGF加入30mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7. 4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应72h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在5000rpm/min 的转速下，离心20min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0061] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取5mg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA_AA)，溶于 30mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取0. 5mL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA 与AzPhNGF的摩尔质量比为50 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器2000W超声 清洗分散20min后转移至培养皿中，于170W紫外灯下11cm处照射10s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入8(^g pDNA，冰浴搅拌2d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0062] 实施例5本发明多功能纳米生物材料转染试剂的制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF 511. 按照1 :5的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入88〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将7〇μ8的NGF加入27mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7. 4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应50h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在4000rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0063] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取2mg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA_AA)，溶于 30mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取2. 5mL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA 与AzPhNGF的摩尔质量比为250 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器2200W超声 清洗分散15min后转移至培养皿中，于180W紫外灯下10cm处照射9s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入lOOPg pDNA，冰浴搅拌2. 5d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度 备用。
[0064] 实施例6本发明多功能纳米生物材料转染试剂的制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF 511. 按照1 :4的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入86〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将8〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7.4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应50h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在4000rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0065] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取2mg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA_AA)，溶于 15mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取3mL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA与 AzPhNGF的摩尔质量比为300 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器3000W超声清 洗分散18min后转移至培养皿中，于200W紫外灯下10cm处照射8s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入9(^g pDNA，冰浴搅拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0066] 本发明通过大量性能测定和研究实验验证，经过本发明所述方法制备的具有基因 治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂均可达到很好的效果，成功的将光活性 NGF接枝到Fe304-0A -NIPA-AA磁性水凝胶上，再利用水凝胶吸附能够干扰α -突触核蛋白 表达的质粒后，将干扰质粒运送到细胞内。在体内，pDNA能够干扰α-突触核蛋白的表达， 抑制相关神经细胞的凋亡；再加上NGF能够抑制细胞凋亡，并发挥其对神经细胞的营养作 用，细胞凋亡情况得到进一步的抑制，从而帕金森症逐步得到改善，进而达到治疗帕金森病 的目的。
[0067] 其中，以实施例1制备的多功能纳米生物材料转染试剂的各项性能和转染应用效 果最好。以下实施例7?10呈现出对实施例1制备的多功能纳米生物材料转染试剂进行 表征和应用研究结果。
[0068] 实施例7多功能纳米生物材料转染试剂的表征 本实施例对实施例1制备的多功能纳米生物材料转染试剂进行性能表征，具体方法和 结果如下。
[0069] 1、红外光谱检测 将Fe304-0A_NIPA-AA-NGF，AzPhNGF试样和KBr在干燥机中进行干燥处理，混合并研磨 均匀，并将混合物研磨到粒度小于2Mm，以免散射光影响。将混合物置于模具中，在油压机上 用5?lOMPa压力将混合物压成透明薄片，上机待定。结果如附图1所示。
[0070] 附图1显示的是傅里叶转换红外线光谱分析仪表征比较光活性NGF制备前后官能 团的红外图谱的变化，叠氮苯甲酸-N-琥珀亚酰胺酯的叠氮基的伸缩振动峰在2140CHT 1处， 合成AzPhNGF后振动吸收峰移至2382 cnT1处；NGF在16378CHT1处本身具有伯胺NH面的变 形振动吸收峰，光活性NGF在1640 cnT1处出现酰胺的振动吸收峰。NGF羧基伸缩振动峰在 948 cnT1处，合成AzPhNGF后振动吸收峰减弱，可以推断是由于引进叠氮苯甲酸-N-琥珀亚 酰胺酯时NGF上的羧基发生反映形成酰胺键。同时AzPhNGF中出现的叠氮基，可以进一步推 断是由于引进叠氮苯甲酸-N-琥珀亚酰胺酯内有叠氮基。在接枝NGF后Fe 304-0A-NIPA_AA 上的-CH2-和-CH3-消失，原因是叠氮基在紫外光的刺激下定向攻击-CH2-和-CH3-并与 其形成酰胺键将光活性NGF连接到Fe 304-0A-NIPA-AA，初步证明光活性NGF成功地接枝到 Fe304-0A -NIPA-AA磁性水凝胶上。
[0071] 2、粒径和扫描电镜观察 取部分样品，经马尔文粒度分析仪测量粒径。
[0072] 结果如附图2所示。图2显示的是Fe304-0A_NAPI-AA接枝NGF，并且 Fe304-0A_NAPI-AA-NGF吸附质粒DNA后，粒径分布于220?270nm之间，且分布较为狭窄， SEM结果显示粒子直径与粒径结果相符，可用于后续转染实验。电镜结果与粒径结果基本相 符，进一步验证了本发明制备的纳米生物材料合成成功。
[0073] 3、X射线光电子能谱仪检测 X射线光电子能谱仪分析其元素构成及化学键的形成情况。分别取适量油酸包裹的四 氧化三铁纳米粒、磁性水凝胶、接枝NGF的材料（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF)送样，用X射线光 电子能谱仪扫描各样品组成成分元素分析。结果见附图3。
[0074] 通过X射线光电子能谱仪（XPS，日本U1VAC-PHI公司)进一步验证多功能纳米生物 材料各步反应的合成成功，如附图3所示，I图表示油酸包裹的四氧化三铁纳米粒Fe 304-0A 的XPS图谱，II图表示磁性水凝胶（Fe304-0A-NIPA_AA)的XPS图谱，III图表示接枝神经生 长因子（NGF)的多功能纳米生物材料（Fe 304-0A_NIPA-AA-NGF)的XPS图谱。在I图中主要 由C-C键、C-H键、羰基C=0键组成，II图中由于水凝胶接枝到四氧化三铁纳米粒表面形成 了 C-N键，使得C-N键的比例增加到10. 09%，同时C=0键羰基的比例增加到8. 39% ;111图 中由于进一步光接枝了神经生长因子（NGF)，使得C-N键的比例增加到25. 64%，同时C=0键 羰基的比例下降到5. 67% ;因此，我们可以进一步认定，将水凝胶接枝于四氧化三铁纳米粒 表面、将神经生长因子（NGF)接枝到磁性水凝胶表面的光接枝反应是成功的。
[0075] 实施例8多功能纳米生物材料转染试剂转染PC12细胞模型实验 本实施例利用实施例1制备的多功能纳米生物材料转染试剂进行转染PC12细胞模型 实验，具体方法和结果如下。
[0076] 1、细胞培养 交感神经细胞（PC12细胞系）由中山大学医学院动物中心提供。细胞在培养瓶中融合 培养至80%后，以1. 75 X 104/孔的密度接种至24孔板上，培养3?6天，以进行后续实验。
[0077] 2、MPP+诱导细胞凋亡 分别取不同剂量MPP+ (1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子）加入正在培养的PC12细胞 中，24h，72h，144h后测量细胞存活率，设定后续建模MPP+浓度。
[0078] MPP+是1-甲基-4-苯基-1，2, 3, 6-四氢吡啶（MPTP)在体内由单胺氧化酶B催化 而来的神经毒性物质，MPP+进入细胞的细胞质后，就聚集在线粒体通过组织电子传递链的 complex I影响细胞的呼吸作用，产生类似于的病理状态。
[0079] 根据经验，我们选择细胞凋亡率为40%，即每孔MPP+浓度为250Mmol/L，作为我们 24h体外帕金森细胞模型的药物作用浓度，为72h模型筛选MPP+浓度提供了参考。同理，72h 与144h的MPP+浓度分别为5〇Mmol/L和5Mmol/L。（如附图4所示） 3、双染流式细胞术检测细胞凋亡 将处于对数生长期的PC12细胞，消化、收集后用有血清DMEM培养基接种到24孔培 养板中。待细胞生长4h (细胞已贴壁良好）后，将培养板中的有血清培养基弃掉，各加入 lmL无血清DMEM培养基，同时加入MPP+ (根据72h和144h的筛选剂量）5〇Mmol/L(72h)， 5Mmol/L(144h)，并分别加入 I、II、III 三种药物，其中 I 为 Fe304-0A-NIPA-AA ;II 为 Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;III 为 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA (药量以 pDNA 量为 0· lPg/ 孔 计)。37°C下培养72h和144h后，弃去培养基，用胰酶消化收集细胞，用冰冷的PBS缓冲液反 复洗涤3次，离心沉淀细胞，弃上清。再加0. 5mL PBS缓冲溶液重悬细胞，然后加入Annexin V/PI各5PL，37°C下避光孵育20min，用流式细胞仪上机检测荧光强度。
[0080] 结果如附图5所示，a组未加任何药物的正常细胞，生长72h后，1. 7%的细胞位 于Q2凋亡象限，2. 4%的细胞位于Q4坏死象限。b组经由MPP+诱导PC12细胞凋亡后加入 Fe304-0A_NAPI-AA，10. 9%的细胞位于Q2凋亡象限，26. 7%的细胞位于Q4坏死象限，59. 4%的 细胞位于Q3正常象限。c组经由MPP+诱导PC12细胞凋亡后加入Fe304-0A_NAPI-AA-NGF， 8. 4%的细胞位于Q2凋亡象限，12. 3%的细胞位于Q4坏死象限，71. 6%的细胞位于Q3正常 象限。d组经由MPP+诱导PC12细胞凋亡后加入Fe304-0A-NAPI-AA-NGF-pDNA，3. 1%的细胞 位于Q2凋亡象限，6. 3%的细胞位于Q4坏死象限，90. 2%的细胞位于Q3正常象限。可见多 功能纳米生物材料作用细胞72h后一定程度上抑制了 MPP+诱导的PC12细胞的凋亡。同理 144趋势与72h相同。
[0081] 4、细胞DAPI染色后的形态观察 将处于对数生长期的PC12细胞，消化、收集后用有血清DMEM培养基接种到24孔培 养板中。待细胞生长4h (细胞已贴壁良好）后，将培养板中的有血清培养基弃掉，各加入 lmL无血清DMEM培养基，同时加入MPP+ (根据72和144h的筛选剂量）5〇Mmol/L(72h)， 5Mmol/L(144h)，并分别加入 I、II、III 三种药物，其中 I 为 Fe304-0A-NIPA-AA ;II 为 Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;III 为 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA (药量以 pDNA 量为 0· lPg/ 孔 计)。37°C下培养72h和144h后，弃去上清液，用PBS洗2?3次。
[0082] 用DAPI染细胞核在荧光显微镜下观察细胞核形态：避光向每孔中加入4%多聚甲 醛，室温下固定30min ;避光用PBS洗三次；并向每孔中加入0. 2%TritonX-100,37°C下透化 30min ;再用PBS洗三次，5min/次；避光向每孔中加入DAPI，避光反应5min，再用PBS洗；用 荧光显微镜观察DAPI蓝色荧光区域。
[0083] 结果如附图6所示。图6显示了经MPP+作用建模后的PC12细胞经多功能纳 米生物材料作用72h后用DAPI染细胞核于荧光显微镜下观察的细胞核形态，图中三行 NP-NAPI-AA、NP-NAPI-AA-NGF、NP-NAPI-AA-NGF (pDNA)分别代表三种不同的纳米生物材料 组，即 Fe304-0A_NIPA-AA、Fe304-0A-NIPA-AA-NGF、Fe 304-0A-NIPA_AA-NGF-pDNA。MPP+ 作用 建模后的PC12细胞，经多功能纳米生物材料作用72h后，细胞用DAPI染细胞核于荧光显微 镜下观察细胞核的形态结果。三个组的细胞核都被DAPI染成蓝色，经MPP+作用后的PC12 细胞，加入NP-NAPI-AA后，由于MPP+对细胞的刺激，使PC12细胞发生凋亡，染色质皱缩， 高度凝集并且边缘化，出现凋亡小体，加入NP-NAPI-AA-NGF后，由于NGF对细胞凋亡的抑 制作用，细胞核变大，凋亡小体减少，凋亡细胞较NP-NAPI-AA组减少，加入NP-NAPI-AA-NGF (pDNA)后，由于α -突触核蛋白被干扰，加上NGF对神经细胞的营养作用，细胞凋亡情况得 到进一步的抑制，细胞核形态趋于正常，凋亡小体较前两组减少。对照同位置光镜可以分析 得出细胞形态的变化趋势。144h趋势对比72h趋势相似。
[0084] 5、α-突触核蛋白、P53、BAX、Bcl_2的变化趋势 将处于对数生长期的PC12细胞，消化、收集后，用有血清DMEM培养基接种到24孔培 养板中。待细胞生长4h (细胞已贴壁良好）后，将培养板中的有血清培养基弃掉，各加入 lmL无血清DMEM培养基，同时加入MPP+ (根据72和144h的筛选剂量）5〇Mmol/L(72h)， 5Mmol/L(144h)，并分别加入 I、II、III 三种药物，其中 I 为 Fe304-0A-NIPA-AA ;II 为 Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;III 为 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA (药量以 pDNA 量为 0· lPg/ 孔 计)。37°C下培养72h和144h后提取蛋白，进行免疫印记实验。
[0085] 附图7反映了免疫印迹检测α -突触核蛋白（a -syn)表达情况。如图7所示，I 组(油酸包裹的四氧化三铁纳米粒Fe304-0A)细胞内α -突触核蛋白（a -syn)表达量较高， II组(油酸包裹的四氧化三铁纳米粒Fe304-0A外光接枝神经生长因子NGF)和III组(吸附 pDNA的Fe304-0A -NIPA-AA-NGF)细胞内α -突触核蛋白（a -syn)表达量明显下调，尤其是 III组细胞内α -突触核蛋白（a -syn)表达量下调最明显，这说明多功能纳米生物材料传 递pDNA进入细胞，干扰了 α -突触核蛋白（a -syn)的合成，并且144h的干扰情况优于72h。
[0086] 其中，II组细胞内α-突触核蛋白（a-Syn)表达量下调的原因是神经生长因子也 可以引起α-突触核蛋白的表达下调，诱导细胞的增长和分化。
[0087] 附图8反映了免疫印迹检测Ρ53、BAX、Bcl-2的表达情况。如图所示，I组为油酸 包裹的四氧化三铁纳米粒Fe 304-0A)，II组为油酸包裹的四氧化三铁纳米粒Fe304-0A外光接 枝神经生长因子NGF，III组为吸附pDNA的Fe 304-0A -NIPA-AA-NGF。从图8可以看出，ΒΑΧ 和Ρ53表达发生下调，Bcl-2表达发生上调，说明吸附质粒的多功能纳米材料抑制了细胞内 的经典凋亡途径，促进了细胞生长。
[0088] 6、NGFR的蛋白表达 附图9反映了免疫印迹检测神经生长因子受体（NGFR)表达情况。如附图9所示，I组 (油酸包裹的四氧化三铁纳米粒Fe304_0A)细胞内肿瘤坏死因子-α受体（TNFR1)几乎没有 表达，II组(油酸包裹的四氧化三铁纳米粒Fe304-0A外光接枝神经生长因子NGF)和III组 (吸附pDNA的Fe304-0A -NIPA-AA-NGF)细胞内神经生长因子受体（NGFR)表达量明显上调， 这说明多功能纳米生物材料已成功将NGF运载到细胞内，其表面接枝的神经生长因子与细 胞表面的神经生长因子受体（NGFR)发生了相互作用并引发了细胞信号转导途径，并且介导 了胞吞作用。
[0089] 对比例1多功能纳米生物材料转染试剂制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF S11.按照1 :4的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入20〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7.4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应50h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在4000rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0090] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取lmg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA-AA)，溶于 10mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取lmL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA与 AzPhNGF的比例为100 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器，1200W超声清洗分散 15min后转移至培养皿中，于150W紫外灯下10cm处照射10s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入2(^g pDNA，冰浴搅拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0091] 对比例2多功能纳米生物材料转染试剂制备 本对比例同对比例1，唯一不同的是步骤S11中加入N-琥珀酰亚胺酯的量为lOOOPg。
[0092] 对比例3多功能纳米生物材料转染试剂制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF 511. 按照1 :4的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入80〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7. 4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应50h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在4000rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0093] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取lmg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA-AA)，溶于 10mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取lmL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA与 AzPhNGF的比例为100 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器，1200W超声清洗分散 15min后转移至培养皿中，于150W紫外灯下10cm处照射Is,真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入2(^g pDNA，冰浴搅拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0094] 对比例4多功能纳米生物材料转染试剂制备 本对比例同对比例3,唯一不同的是步骤S22所述150W紫外灯下10cm处照射5s。
[0095] 对比例5多功能纳米生物材料转染试剂制备 本对比例同对比例3,唯一不同的是步骤S22所述150W紫外灯下10cm处照射15s。
[0096] 对比例6多功能纳米生物材料转染试剂制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF 511. 按照1 :4的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入80〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7.4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应50h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，10KNa)，在4000rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0097] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF) 521. 称取lmg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA-AA)，溶于 10mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取lmL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF，其中Fe304-0A-NIPA-AA与 AzPhNGF的比例为100 :1，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器，1200W超声清洗分散 15min后转移至培养皿中，于150W紫外灯下10cm处照射10s，真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于4mL PBS缓冲液中，向其中 加入2(^g pDNA，冰浴搅拌7d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度备 用。
[0098] 对比例7多功能纳米生物材料转染试剂制备 本对比例同对比例6,唯一不同的是步骤S3所述冰浴搅拌的时间为5d。
[0099] 对比例8多功能纳米生物材料转染试剂制备 本对比例同对比例6,唯一不同的是步骤S3所述冰浴搅拌的时间为10h。
[0100] 对比例9多功能纳米生物材料转染试剂制备 步骤如下： S1.制备光活性NGF 511. 按照1 :4的体积比，将二甲基甲酰胺（DMF)加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液， pH=7. 4)，再加入80〇μ8 N-琥珀酰亚胺酯；将6〇μ8的NGF加入26mL上述含有N-琥珀酰亚 胺酯和二甲基甲酰胺（DMF)的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，pH=7.4)中，在4°C冰浴、避光条 件下搅拌反应50h ; 512. 合成结束后，分别用超滤离心管（MiliporeMolecut II，lOKNa)，在4000rpm/min 的转速下，离心30min以纯化生成的叠氮苯基衍生物，即为光活性NGF(AzPhNGF)，冷冻干燥 备用； 513. 使用前，加入50mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度lng/^L。
[0101] S2.制备光接枝NGF纳米材料(多功能纳米材料Fe304-0A-NIPA-AA-NGF) 521. 称取lmg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒(磁性水凝胶，Fe304-0A-NIPA-AA)，溶于 10mL PBS缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液； 522. 吸取lmL磁性水凝胶溶液，向其中加入lPg光活性NGF (AzPhNGF)(其中 Fe304-0A_NIPA-AA与AzPhNGF的摩尔质量比为100 :1 )，在避光条件下混合均匀，并用超声波 清洗器，1200W超声清洗分散15min后转移至培养皿中，于150W紫外灯下10cm处照射10s， 真空冻干备用； S3.制备多功能纳米生物材料转染试剂（Fe304-0A-NIPA-AA-NGF-pDNA): 称取lmg光接枝NGF纳米材料（Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于10mL PBS缓冲液中，向其 中加入2(^g pDNA，冰浴搅拌3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后，调整至合适浓度 备用。
[0102] 对比例10多功能纳米生物材料转染试剂制备 本对比例同对比例9,唯一不同的是步骤S3所述称取lmg光接枝NGF纳米材料 (Fe304-0A_NIPA-AA-NGF)溶于 lmL PBS 缓冲液。
[0103] 本发明对上述对比例1?10制备的多功能纳米生物材料转染试剂进行了性能检 测和应用研究实验，对结果进行如下描述，并对其可能原因进行了分析： 结果显示，对比例1和2由于步骤S11中N-琥珀亚胺脂的计量变低，导致光活性的NGF 量变少，进而使NGF接枝到纳米粒外的量变少，无法发挥出NGF介导纳米材料进入细胞的功 效。
[0104] 对比例3?5由于步骤S22所述照射时间过短或过长，引起纳米粒严重团聚，粒径 结果显示不适宜后续试验，因而无法成功制备多功能纳米生物材料转染试剂，不能将干扰 质粒运送到细胞内，从而无法实现治疗帕金森病的目的。
[0105] 对比例6和7由于步骤S3中冰浴搅拌时间过久，引起质粒DNA的裂解，影响纳米 材料的治疗效果。
[0106] 对比例8由于步骤S3中冰浴搅拌时间过短，Fe304-0A_NIPA-AA-NGF未能有效吸附 pDNA，从而达不到干扰α -突触核蛋白合成的作用，无法实现治疗帕金森病的目的。
[0107] 对比例9由于步骤S3中Fe304-0A-NIPA-AA-NGF溶于PBS缓冲液的浓度过低，未能 有效吸附PDNA，从而达不到干扰α -突触核蛋白合成的作用，无法实现治疗帕金森病的目 的。
[0108] 对比例10由于步骤S3中Fe304-0A_NIPA-AA-NGF溶于PBS缓冲液的浓度过高，反而 引起了 Fe304-0A-NIPA-AA-NGF的竞争吸附，造成未能有效吸附pDNA，从而达不到干扰α -突 触核蛋白合成的作用，无法实现治疗帕金森病的目的。 SEQUENCE LISTING 〈110>华南师范大学 〈120> -种具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂及其制备方 法和应用 <130> <160> 1 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 63 <212> DNA 〈213>干扰质粒pDNA携载序列 <400> 1 gatcccacca aagagcaagt gacaaatctc gagatttgtc acttgctctt tggttttttg 60 gat 63
【权利要求】
1. 一种具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂，其特征在于，是 通过光接枝的方法将神经生长因子固定在水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒表面，再利用水 凝胶吸附能够干扰α -突触核蛋白合成的质粒DNA制备得到； 所述能够干扰α -突触核蛋白合成的质粒DNA是指pDNA ;所述pDNA是携带有SEQ ID NO. 1所示序列的GV102载体。
2. -种权利要求1所述具有基因治疗帕金森症效果的多功能纳米生物材料转染试剂 的制备方法，其特征在于，步骤如下：
51. 制备光活性神经生长因子；
511. 按照1 :4?1 :5的体积比，将二甲基甲酰胺加入到磷酸盐缓冲液中，再加入800? 9〇〇μβ N-琥珀酰亚胺酯；
512. 将60?lOOPg的NGF加入26?30mL步骤SI 1得到的含有Ν-琥珀酰亚胺酯和二 甲基甲酰胺的磷酸盐缓冲液中，冰浴、避光条件下搅拌反应50?72h ;离心纯化产物，即得 到光活性神经生长因子，冷冻干燥备用；
513. 使用前，加入磷酸盐缓冲溶液溶解并调整浓度；
52. 制备光接枝神经生长因子纳米材料Fe304-0A_NIPA-AA-NGF ;
521. 按照比例，称取1?5mg水凝胶包裹的四氧化三铁纳米粒，溶于5?30mL磷酸盐 缓冲溶液中，得到磁性水凝胶溶液；
522. 将光活性神经生长因子加入磁性水凝胶溶液中，使得磁性水凝胶与光活性神经生 长因子的摩尔质量比为50 :1?300 :1，在避光混合均匀，800?3000W超声分散10?30min 后转移至培养皿，150?200W的紫外灯下10cm处照射8?12s，真空冻干备用；
53. 制备多功能纳米生物材料转染试剂； 按照lmg的Fe304-0A-NIPA-AA-NGF溶于4mL磷酸盐缓冲溶液中的比例，将二者混勻，再 向其中加入10?l〇〇Kg pDNA，冰浴搅拌2?3d ;Fe304-0A-NIPA-AA-NGF充分吸附pDNA后， 调整浓度备用。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH值均为7. 4 ; S12所述离心是3500?5000rpm/min的转速下，离心20?40min ; S13所述调整浓度至lng/^L。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S12所述离心是4000rpm/min的转速 下，离心30min。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，按照体积比，S22所述的磁性水凝胶 与光活性神经生长因子的摩尔质量比为100 :1。
6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S22所述超声的条件为使用超声波清 洗机，1200?2500W超声分散10?20min ; S22所述紫外照射的条件为：150W的紫外灯下10cm处照射10s。
7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S3所述冰浴搅拌3d。
8. 权利要求2?7任一所述制备方法制备得到的多功能纳米生物材料转染试剂。
9. 权利要求1或8所述多功能纳米生物材料转染试剂在制备帕金森症治疗药物方面的 应用。
【文档编号】A61K48/00GK104043132SQ201410289953
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】关燕清, 刘俊明, 武迪 申请人:华南师范大学