一种金-钛铌酸层状纳米复合物酶传感器及其制备、应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶传感器技术领域，尤其涉及一种金-钛铌酸层状纳米复合物酶传感 器及其制备、应用。
【背景技术】
[0002] 有机磷农药在工业和农业方面作为一种重要的杀虫剂，但是大部分有机磷农药具 有很强的毒性并长期的积累在生物体内，从而引起严重的生态问题。有机磷农药具有不可 逆的抑制乙酰胆碱酯酶作用，而乙酰胆碱酯酶能使神经递质产生乙酰胆碱，如果乙酰胆碱 酯酶被抑制则阻碍有关重要器官正常的生理反应，从而导致严重呼吸道和心肌衰竭甚至死 亡。由于有机磷农药难以降解并长期积累在生物体内，即使浓度很低也会造成持久的危害。 因此检测痕量有机磷农药是非常重要的。
[0003] 而甲基对硫磷俗称甲基1605,学名为0, O-二甲基-0-(4 -硝基苯基）硫代磷酸 酯，属于有机磷农药中的一种，其工业产品为带蒜臭的黄棕色油状液体，其纯品为白色结 晶，熔点为36-36. 5°C，难溶于水，易溶于有机溶剂，加热会异构化，高温或遇碱易分解。甲基 对硫磷的急性毒性LD50值如下：对大白鼠经口为14-24mg/kg，对兔经皮为300-400mg/kg， 属高毒级农药。
[0004] 目前，如高效液相色谱、气相色谱和气-质联用等方法已被用于上述提到的杀虫 剂的检测分析，但是这些方法仪器昂贵，分析时间长。酶电化学传感作为很好的能快速简便 的检测有机磷农药的技术。在电化学传感器发展中，关键的部分是固定电极，通常检测有机 磷农药所用的固定电极方法已被研宄，例如交联，溶胶凝胶，层层组装等。在酶传感器发展 中主要使用的体系需要具有很好的灵敏性、耗材少、无污染。
[0005] 目前，很多纳米材料已经被用于酶传感中，有的纳米材料通过与酶形成共价键结 合的，例如葡萄糖氧化酶、细胞色素C、核糖核酸酶与金纳米粒子能形成共价键，酶与金形成 的这种共价键常被使用于酶传感中。使用一些能够很好的分散和附着金的材料，为了防止 金粒子的团簇。层状材料已在生物催化和生物电化学中得到广泛的使用。目前，很多层状 材料由于它们具有很好的导电性、大的中孔体积和比表面积等优点被用于固定酶。例如石 墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管等已在乙酰胆碱酯酶传感器中作为固定材料使用。而层状钛铌 酸由于具有很好的生物相容性、无毒和优越的物理性能已被关注，但在酶传感器中的使用 至今没有相关的报道。
【发明内容】
[0006] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明提出了一种金-钛铌酸层状纳米复合物酶 传感器及其制备、应用，首次将合成的Au-HTiNbO 5纳米复合物作为电极材料，本发明作为一 个新的检测有机磷农药的电化学传感器，为以后的电化学检测提供一个很好的平台。
[0007] 本发明提出的一种金-钛铌酸层状纳米复合物酶传感器，包括工作电极、参比电 极和对电极，工作电极包括导电基体、金-钛铌酸纳米复合物层和壳聚糖-牛血清白蛋白 层，金-钛铌酸纳米复合物层涂覆在导电基体上并在其表面成膜，壳聚糖-牛血清白蛋白层 涂覆在金-钛铌酸纳米复合物层的外表面，金-钛铌酸纳米复合物层由金纳米颗粒和钛铌 酸纳米片构成，壳聚糖-牛血清白蛋白层由壳聚糖和牛血清白蛋白组成，乙酰胆碱酯酶通 过化学键作用固定于金纳米颗粒上，并包埋在壳聚糖-牛血清白蛋白层中。
[0008] 优选地，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极。
[0009] 优选地，导电基体为玻碳电极GCE、导电玻璃ITO或金电极。
[0010] 优选地，工作电极的直径为2-4mm。
[0011] 优选地，工作电极与参比电极的距离小于5mm，以最大限度降低参比电极与工作电 极之间的溶液电阻；工作电极与对电极的距离5-20mm，以保证工作电极与对电极之间的电 流密度均匀，从而确保本发明的工作电极表面电化学反应的一致性。
[0012] 本发明提出的上述金-钛铌酸层状纳米复合物酶传感器的制备方法，包括如下步 骤：
[0013] Sl、将氯金酸HAuCl4溶液、水和乙醇混合均匀得到混合溶液A，将HTiNbO 5纳米片 加入混合溶液A中，紫外灯下照射后，离心，干燥得到Au-HTiNbO5纳米复合物；
[0014] S2、将Au-HTiNbO5纳米复合物加入中性缓冲溶液中，进行超声处理得到混合溶液 B，将混合溶液B和1-丁基-3-甲基咪唑四氟磷酸的离子溶液混合后，再进行超声处理得到 悬浮液C ;
[0015] S3、将乙酰胆碱酯酶AChE溶液加入壳聚糖CS溶液中混合均匀得到AChE-CS溶液；
[0016] S4、将玻碳电极GCE研磨后，经超声清洗，接着在氮气流下干燥得到预处理工作电 极；
[0017] S5、将悬浮液C滴加在预处理工作电极表面，自然晾干后得到Au-HTiNbO5-ILs电 极；向Au-HTiNbO 5-ILs电极表面滴加AChE-CS溶液，低温静置后得到工作电极D ;用中性缓 冲溶液蘸洗工作电极D表面得到工作电极E，再将牛血清白蛋白BSA滴加在工作电极E表 面，静置后，再用中性缓冲溶液蘸洗工作电极E表面得到金-钛铌酸层状纳米复合物酶传感 器。
[0018] 优选地，Sl中，氯金酸HAuCl4溶液、水和乙醇的体积比为0. 1-0. 3 :25-35 :1-3,其 中氯金酸HAuCl4溶液的浓度为l-2g/L，HTiNb05纳米片与混合溶液A的摩尔体积比（mmol/ L)为 0· 5-2 :1〇
[0019] 优选地，Sl中，氯金酸HAuCl4溶液、水和乙醇的体积比为0. 2 :30 :2,其中氯金酸 HAuCl4溶液的浓度为I. 4g/L，HTiNb05纳米片与混合溶液A的摩尔体积比（mmol/L)为1 :1。
[0020] 优选地，Sl中，紫外灯为采灯。
[0021] 优选地，Sl中，紫外灯为功率为500W的汞灯。
[0022] 优选地，Sl中，紫外灯照射时间为l_4h，优选为2h。
[0023] 优选地，SI中，干燥温度为75-85°C，优选为80°C。
[0024] 优选地，Sl中，HTiNbO5纳米片的制备方法为：将HTiNbO 5均匀的分散在水中，加入 四丁基氢氧化铵溶液至pH = 9得到混合溶液，将混合溶液置于45-55°C中反应2-3天，离 心，干燥得到HTiNb05m米片。
[0025] 优选地，HTiNbO^米片的制备方法中，HTiNbO5和水的摩尔体积比（mmol/L)为 1-5:1，优选为 2. 25 :1。
[0026] 优选地，HTiNbO5纳米片的制备方法中，四丁基氢氧化铵溶液浓度为5_7wt%，优选 为 6wt % 〇
[0027] 优选地，HTiNbO5纳米片的制备方法中，离心速率为6000-9000rpm，离心时间为 10_15min，离心速率优选为9000rpm，离心时间优选为lOmin。
[0028] 优选地，HTiNbO5纳米片的制备方法为：将HTiNbO 5均匀的分散在水中，HTiNbO 5和 水的摩尔体积比（mm〇l/L)为2. 25:100,加入浓度为6wt %的四丁基氢氧化按溶液至pH = 9得到混合溶液，将混合溶液置于45°C中反应3天，离心，干燥得到HTiNbO5纳米片，其中离 心速率为9000rpm，离心时间为lOmin。
[0029] 优选地，S2中，Au-HTiNbO5纳米复合物和中性缓冲溶液的重量体积比（g/L)为 0· 8-1. 2 :0· 7-1. 3,优选为 1:1。
[0030] 优选地，S2中，混合溶液B和1- 丁基-3-甲基咪唑四氟磷酸的离子溶液的体积比 为 5-19 :0· 9-L 1，优选为 19 :1。
[0031] 优选地，S3中，乙酰胆碱酯酶AChE溶液和壳聚糖CS溶液的体积比为0. 8-1. 2 : 0. 7-1. 3,乙酰胆碱酯酶AChE溶液的浓度为50-250U/mL，壳聚糖CS溶液的浓度为 0. 5-1. 5g/L。其中，乙酰胆碱酯酶AChE溶液的浓度可以为50U/mL、60U