A型原花青素二聚物与丙酮缩合物的结构、制备及生物活性的制作方法
【专利摘要】本发明公开了原花青素丙酮缩合物的简单合成方法，并提供了新型的原花青素二聚体丙酮缩合物。新化合物的结构经多种核磁共振及质谱光谱解析定出。原花青素二聚体丙酮缩合物有较强的清除自由基活性及比原花青素本身显著增强的抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。可能作为食品、化妆品等产品的抗氧化剂,也可作为有抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性的抑制肥胖和II型糖尿病的药物或保健品添加剂。
【专利说明】A型原花青素二聚物与丙酮缩合物的结构、制备及生物活性
【技术领域】
[0001]本发明属于化学【技术领域】，涉及原花青素与丙酮缩合物的结构、制备及活性，特别是新的A型原花青素丙酮缩合物的制备、结构及抗氧化活性和抗阿拉法-葡萄糖苷酶活性。
【背景技术】
[0002]原花青素是一类具有很强生物活性的化合物，有保护心血管系统，降血糖，抗癌等活性(Nagao, T., Hase, T., Tokimitsu, 1.A green tea extract high incatechins reduces body fat and card1vascular risks in humans.0besity, 2007，15: 1473-1483; Yang, C.S., Wang, X.，Lu G., et al.C.Cancer prevent1nby tea: animal studies, molecular mechanisms and human relevance.Nat.Rev.Cancer, 2009，9: 429—439; Katiyarj S.K., Mukhtaj H.Tea ant1xidants in cancerchemoprevent1n.J.Cell B1chem Supplj 1997，27: 59-67.)。该类成分根据其聚合度的不同分为单倍体如儿荼素，或二聚体如原花青素Al。为了提高其生物活性和生物利用度，研究人员制备了多种低级性的儿荼素衍生物，其中儿荼素与丙酮缩合产生的具有平面结构的儿荼素丙酮缩合物(I)具有很强的抗氧化作用，可显著抑制游离基引起的DNA链断裂并显示出儿荼素本身没有的抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。另外，由于原花青素结构中含有多个酚羟基，极性过大导致其生物利用度不高，而儿荼素丙酮缩合物亲脂性好，在体内易通过生物膜，生物利用度提高，因此可提高体内作用(Jan H.，Van Der Westhuizenj JacobusA.，et al.An unus ual react1n of flavan-3-ols with acetone of relevance to theformat1n of the tetracyclic ring system in peltogynoids.Tetrahedron, 1990，46: 7849-7854; Hakamataj I，Nakanishij 1., Masudaj Y., et al.Planar catechinanalogues with alkyl side chains: a potent ant1xidant and an alpha-glucosidaseinhibitor.J Am Chem Soc, 2006，128: 6524-6525; Fukuharaj K., Nakanishij 1.,Kansuij H.，et al.Enhanced radical-scavenging activity of a planar catechinanalogue.J Am Chem Soc, 2002，124: 5952-5953)。但是，原花青素聚合物的结构易受反应条件的影响发生复杂变化，迄今原花青素聚合物包括二聚物的丙酮缩合物尚未见报道。另外，已报道的儿茶素丙酮缩合物的合成方法采用对甲苯磺酸、三氟化硼乙醚或三氟甲磺酸三甲基硅脂为催化剂，刺激性及毒性较大。本发明采用微量浓硫酸为催化剂，合成方法更为简单温和。本发明得到的原花青素A型二聚物的丙酮缩合物是尚未见报道的新化合物。本发明公开新的A型原花青素二聚物的丙酮缩合物(2)的结构、制备方法及抗氧化和抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。(见说明书附图8 A型原花青素二聚物的丙酮缩合物(2)的结构)
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于改进儿茶素丙酮缩合物的合成方法，并提供新型的原花青素二聚体丙酮缩合物。新化合物的结构经解析多种核磁共振及质谱光谱数据确定。原花青素二聚体丙酮缩合物有较强的清除自由基活性及比原花青素本身显著增强的抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。同时衍生物比原花青素本身亲脂性增加，有望更好地发挥体内活性，并且也可能作为低极性食品、化妆品等产品的抗氧化剂。
[0004]其具体技术方案为:
原花青素丙酮缩合物的制备及结构确定，包括以下步骤:
O原花青素丙酮缩合物的制备
将原花青素溶于3-10倍优选7倍的丙酮中(原花青素mmol:丙酮ml)。混合物在冰水中冷却，并滴加丙酮溶液体积0.3-1%，优选0.8%的浓硫酸，在室温下反应30-300分钟70分钟后加入所用硫酸量5倍以上(重量比，优选6倍)的碳酸钠中和至pH=5-6 ；
2)原花青素丙酮缩合物的纯化
上述反应液用15倍以上冰水(优选20倍)稀释后进行反相硅胶C18色谱分离，水-甲醇梯度洗脱，得到原花青素丙酮缩合物；
3)原花青素丙酮缩合物的结构确定测定分析生成物的核磁共振及质谱数据。丙酮缩合物的特征是与原花青素相比，1H NMR中在δ 1.3-2.0 ppm间出现两个甲基单峰信号(新缩合上的丙叉基)，质谱分子量比原花青素原料增加 40 单位。进一步通过 HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlat1n,异核多键相关)等二维核磁共振实验确定结构。
[0005]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
本发明所用反应条件温和，所用试剂刺激性及毒性小，得到的A型原花青素二聚物的丙酮缩合物是一类新化合物。这些原花青素丙酮缩合物均有较强的清除自由基活性并显著抑制阿拉法葡萄糖酶活性。同时由于丙叉基的引入，亲脂性增加，有望更好地发挥体内活性，并且也可能作为低极性食品、化妆品等产品的抗氧化剂，或作用于阿拉法葡萄糖酶的保健食品或药品用于肥胖或糖尿病。
【具体实施方式】
[0006]下面【具体实施方式】对本发明的制备方法和活性测定法作进一步详细说明。
[0007]—种原花青素丙酮缩合物的制备方法及结构，包括以下步骤:
O原花青素丙酮缩合物的制备
将原花青素溶于丙酮。混合物在冰水中冷却后滴加催化量浓硫酸，在室温下反应后加入碳酸钠中和.2)原花青素丙酮缩合物的纯化
上述反应液用冰水稀释后进行反相硅胶C18色谱分离，水-甲醇梯度洗脱，得到原花青素丙酮缩合物。
[0008]实施例1:儿茶素丙酮缩合物的制备
将儿茶素(60 mg, 0.2 mmol)溶于丙酮(1.4 ml)。混合物在冰水中冷却，并滴加浓硫酸(0.012 ml)。在室温下反应70 min。反应液加入碳酸钠(0.12 g)中和至pH=5_6。加入20倍冰水稀释，使用反相硅胶C18色谱柱分离，从30%甲醇洗脱部分得到43 mg化合物I (收率65%)。化合物I的核磁图谱数据与文献报道的儿茶素平面衍生物一致。
[0009]实施例2:原花青素Al丙酮缩合物的制备
将原花青素 Al (95 mg, 0.16 mmol) (Zhang H，Yeriguij Yang Y，Ma C.Structures and ant1xidant and intestinal disaccharidase inhibitory activitiesof A-typeproanthocyanidins from peanut skin.J Agric Food Chemj 2013， 61:8814-8820)溶于丙酮(1.75 ml)，混合物在冰水中冷却，并滴加浓硫酸(0.012 ml)。在室温下反应70 min。反应液加入碳酸钠(0.12 g)中和至pH=5_6。加入20倍冰水稀释，使用反相硅胶C18色谱柱分离，得到30.9 mg化合物2，收率33% (附图1)。该化合物是未见文献报道的新化合物，通过综合分析多种光谱数据(附图3-7)确定了结构。化合物2的1H及13CNMR数据如附图9所示；
化合物2:类白色粉末，ES1-MS负离子模式测得准分子离子峰[Μ-Η] m/z 615.3，分子式为C35H32O12，提示化合物2比原料Al多一个丙叉基。13C NMR图谱中δ 75.80 (C_2,丨)、30.70 (C-广')和27.01 (C-广')和1H NMR图谱中的两个单峰δ 1.509 (H-广')和1.570(Η-1/ ')为新结合的丙叉基信号。13C NMR图谱(附图9)碳信号δ 99.02 (C_2)，66.49 (C-3), 28.13 (C_4)，74.56 (C~2r )，66.32 (C-3/ )，26.84 (C-4,)，为黄酮中的杂环碳所产生的(C和I环)，提示其分子结构中有二个黄烷单元，同时在1H NMR图谱(附图 9)中有 H-4' (F环)[δ 2.537，dd (15.5, 10.5) ; 3.023，dd (15.5, 6.0)]及H-4 (C环)[δ 4.523，d (3.5)]信号，均与原料Al的杂环部分相对应。在低磁场δ 6.5-7.3之间的芳香质子信号区域，化合物2比Al少一个质子信号，说明Al的B环或E环中有一个碳上的质子被取代。丙叉基的连接位置根据HMBC中的δ 6.62的!1-15'与δ 75.80的02'，和有远程耦合(附图2)决定。并且和底物相比，C-16'的化学位移由120.68变为134.44，明确丙叉基是与E环上C-16'及F环上的3' -O连接。以上证据确定了化合物2的结构如附图2所示；
[0010]实施例3 =DPPH (I, 1- 二苯基苦基苯肼)自由基清除实验
DPPH自由基清除实验参考Ma等的方法(Ma J.N., WangS.L., Zhang K., etal.Chemical components and ant1xidant activity of the peels of commercialapple-shaped pear (fruit of pyrus pyrifolia cv.pingguoli).J Food Sci, 2012,10，1097 - 1102)。DPPH用甲醇溶解成浓度为0.1 mM的溶液，然后用DMSO稀释到2.5，5，10和20 μ g/ml四种不同浓度。将10 μ I待测样品溶液和190 μ I DPPH溶液混合于96孔板，对照组用10 μ I DMSO (二甲亚砜)代替样品溶液，颜色对照组用190 μ I甲醇代替DPPH溶液，其余操作和样品组相同。混匀后将三组样品同时置避光室温反应20 min，通过酶标仪于520 nm处测定反应物的吸光度(A)，样品清除能力百分率按如下公式计算，结果见附图10:
Effect %=100X[Acontrol - (Asample -Acolor)] /Acontrol上式中Effect %为DPPH自由基清除率，Acontrol为对照组的吸光度，Asample为样品组的吸光度，Acolor为颜色对照组的吸光度。
[0010]实施例4: a -葡萄糖苷酶抑制活性
a-葡萄糖苷酶抑制活性实验参考Ma等人的方法(Ma CM, Sato N, Li XY, et al.Flavan-3-ol contents, ant1-oxidative and a -glucosidase inhibitory activitiesof Cynomorium songaricum.Food Chem，2010, 118: 116-119)。将 2 mM对硝基苯胺溶于100 mM磷酸钾缓冲液中，制得pH 7.0底物溶液。取10 μ I样品溶液和80 μ I底物溶液混合于96孔板，对照组中使用10 μ I DMSO代替样品溶液。每孔加入10 // L酶溶液(0.4U/ml,用酶标仪测定 405 nm 处的吸光度；在 37° C 下培养20 min后，再次测定405 nm处的吸光度，每份样品测量3次，其抑制率公式如下: Inhibit1n%=100X[ (Δ Acontrol-Δ Asample) / Δ Acontrol]
上式中Inhibit1n。/。为百分抑制率，AAcontrol为对照组培养后的吸光度增值，AAsample为样品组培养后的吸光度增值；
首先测量样品浓度在100 μ g/ml时的抑制率，将抑制率超过50%的样品稀释4个浓度，分别为125、25、5和I u g/ml，分别测定抑制率，建立标准曲线，计算出IC5tl值，结果见附图10儿茶素、原花青素Al及其丙酮缩合物的生物活性: aEC50:受试化合物还原50% DPPH时的浓度。IC5tl:受试化合物抑制50%酶活性时的浓度
b阿卡波糖为临床用作用于α-葡萄糖苷酶的抗糖尿病药物，在这里作为阳性对照；儿茶素与原花青素Al本身没有表现出抑制α -葡萄糖苷酶的活性，而这两个化合物的丙酮缩合物显示出了明显的抑制α-葡萄糖苷酶活性，特别是新化合物-Al丙酮缩合物⑵比已知的儿茶素丙酮缩合物(I)活性更强2倍以上。食物中的碳水化合物经过唾液和十二指肠中α-淀粉酶的作用消化为麦芽糖糖等二糖，这些二糖在小肠α-葡萄糖苷酶作用下水解为葡萄糖进而被吸收入血，过高的α-葡萄糖苷酶活性会引起餐后血糖快速升高。服用α-葡苷酶抑制剂可以降低II型糖尿病患者餐后血糖，不增加胰岛β细胞负担，同时促进未消化的二糖从肠道排出，因此该类药物研发有很好的实用意义。本实验首次制备得到的原花青素二聚体丙酮缩合物具有抗氧化活性和显著的抑制α-葡萄糖苷酶活性，对发现新的α -葡苷酶抑制剂用于肥胖和II型糖尿病患者有重要意义。
[0011]本实验合成原花青素丙酮缩合物的操作简单，反应条件温和，可通过常规试剂反应得到，适用于大批量生产。
[0012]以上所述，为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不受限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，通过简单变化或等效替换得到的技术方案均落入本发明的保护范围内。
[0013]【专利附图】
【附图说明】:
附图1原花青素Al丙酮缩合物(2)的生成
附图2原花青素Al丙酮缩合物(2)在HMBC图谱中的主要相关峰
附图3 化合物2的1HNMR谱图
附图4 化合物2的13CNMR谱图
附图5 化合物2的H-H COSY谱图
附图6 化合物2的HSQC谱图
附图7 化合物2的HMBC谱图
附图8 A型原花青素二聚物的丙酮缩合物(2)的结构
附图9化合物2与原花青素Al的1H和13C NMR数据对比
附图10儿茶素、原花青素Al及其丙酮缩合物的生物活性。
【权利要求】
1.原花青素二聚体丙酮缩合物的结构。
2.原花青素二聚体丙酮缩合物的简易制备方法，特指用少量硫酸催化的丙酮溶液反应法。
3.权利要求1所述原花青素二聚体丙酮缩合物纯品或以其为组分的混合物作为抗氧化剂在食品、化妆品和药品中的应用。
4.权利要求1所述原花青素二聚体丙酮缩合物纯品或以其为组分的混合物作为阿拉法葡萄糖酶 抑制剂在防治肥胖或糖尿病的保健食品或药品中的应用。
【文档编号】A61P39/06GK104130268SQ201410394266
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】马超美, 张慧文, 张玉 申请人:内蒙古大学