党参多糖硫酸酯在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种党参多糖硫酸酯在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用及其制备方法。本发明采用氨基磺酸法对党参多糖进行硫酸酯化修饰，优化了修饰方法，并发现党参多糖硫酸酯对单纯疱疹病毒Ⅰ型具有较强的预防及治疗效果。同时还筛选出活性最好的党参多糖硫酸酯（取代度为0.763），无论是预防给药还是治疗给药，细胞存活率均高于病毒对照组（P<0.01），且其预防作用与阿昔洛韦相当（P>0.05），治疗效果优于阿昔洛韦（P<0.05）。表明其抗病毒活性最强，可以作为研制新型抗HSV-Ⅰ病毒药物的材料，为研制新型抗HSV-Ⅰ病毒药物提供了材料和理论依据。
【专利说明】党参多糖硫酸酯在制备抗I型单纯疱疹病毒药物中的应用 及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药学领域，尤其是一种党参多糖硫酸酯在制备抗I型单纯疱疹病 毒药物中的应用及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 单纯痛疫病毒I型（herpes simplex virus type I , HSV- I )属于痛疫病毒亚 科，主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜（口腔粘膜）和器官（脑）的感染，可引起人腰部以 上黏膜和神经系统感染，所致疾病主要有角膜炎、疱疹性脑炎、唇疱疹和龈口炎等，并可形 成潜伏感染。人是单纯疱疹病毒的唯一自然宿主。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破 损皮肤进入体内，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。原发性感染多为 隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现，仅有少数可出现临床症状。原发感染发生后，病毒 可长期潜伏于体内。正常人群中约有50%以上为该病毒的携带者。HSV在人体内不产生永 久免疫力，每当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改 变时，体内潜伏的HSV被激活而发病。研究证明，复发性单纯疱疹患者可有细胞免疫缺陷。 HSV- I是普遍存在的且接触传染的，当患者产生和释放病毒时，单纯疱疹病毒就会传播，危 害很大。HSV- I -般传播的非常快速和广泛，对人的潜伏感染的时间是非常长的。
[0003] 单纯疱疹病毒I型具有宿主变化范围大，在细胞培养中繁殖与传播速度快，易破 坏感染细胞和常在神经节中建立潜伏感染的特点。感染人体后可侵犯中枢神经系统引起单 纯疱疹病毒性脑炎，脑膜炎，导致病毒性脑损伤，能感染人体脏器组织导致器官病变（如 非嗜肝病毒性肝炎），危及生命。还能能引起口唇疱疹、角膜炎、内脏器官感染等。病毒由 包膜、被膜、核衣壳和含有病毒DNA的核心组成，由于HSV的基因为双链DNA，易与宿主DNA 发生整合作用，或形成潜伏状态，限制了病毒疫苗的发展和作用。因此，研制开发高效低 毒的新型抗病毒药物仍是当今抗病毒研究热点之一。
[0004] 目前国内外治疗单纯疱疫病毒的药物以阿昔洛韦及其衍生物为多，但该类药物存 在毒副作用大、易耐药等许多不足，在临床应用中受到限制。因此国内外众多学者都在不断 寻求安全有效的抗HSV- I的新型药物。
[0005] 多糖（Polysaccharide)是中药重要活性成分之一，由10个以上的单糖分子通 过糖苷键聚合而成，在生物体内作为能量物质，广泛存在于动植物体内和微生物细胞壁中， 参与细胞的各种生理活动。多糖作为生物活性物质能够抗各种病毒，如免疫缺陷病毒、肝炎 病毒、流感病毒、单纯疱疫病毒、巨细胞病毒等有抑制作用，具有无细胞毒性且质量通过化 学手段容易控制等优点，己引起医药界的高度重视，显示了广阔的药用前景。
[0006] 但天然药物的药效相对较低，多糖的活性直接或间接地受其分子结构的影响，与 其初级和高级结构特别是三维空间构象密切相关，而且与分子量、溶解度、粘度等物理化学 性质有关。采取一定的方法对多糖分子结构进行修饰，通过改变多糖的空间结构、分子量及 取代基种类、数目和位置，可以提高或赋予多糖新的生物活性、降低其毒副作用。目前最为 常见的修饰方法有：硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、羧甲基化等。无论天然或化学合成多 糖经不同程度的硫酸化修饰后其抗病毒活性会有明显的变化，尤其是一些无抗病毒作用的 多糖硫酸化修饰后具有了抗病毒活性。如香菇多糖本身虽无抗HIV活性，硫酸化修饰后却 可抑制人类免疫缺陷病毒HIV产生的细胞病变。多糖硫酸化的抗病毒活性研究成为多糖修 饰研究领域的热点，已成为多糖结构修饰中的一个重要方向。
[0007] 多糖硫酸酯（polysaccharides sulfate，PSS)，也称硫酸多糖（sulfated potysaccharides，SPS)，是多糖大分子链中单糖分子上的轻基被硫酸根所取代而形成的天 然及半合成的酸性多糖，为聚阴离子化合物糖。具有广泛的生物学性质，包括抗病毒、抗肿 瘤、对免疫系统作用和抗凝活性。有文献报道多种多糖硫酸酯具有抗病毒作用。有研究资 料表明，多糖硫酸酯显著的抗病毒活性可能是硫酸基团的负电荷与病毒上蛋白的正电荷通 过静电作用结合，进而阻止了病毒对细胞的吸附，封闭了包膜病毒与细胞受体结合的部 位，其硫酸聚阴离子对病毒感染细胞进行抑制作用发挥更强的抗病毒活性。此外多糖硫酸 酯的抗病毒作用机制也归功于对病毒向细胞吸附相关作用的抑制，即直接抑制病毒进入细 胞或进入细胞后复制的某一步骤。从已有的多糖硫酸酯研究来看，大多是通过病毒与宿主 细胞之间的分子亲和力来完成吸附过程，从而达到抗病毒的作用。此外引入硫酸基团后所 引起的多糖立体结构的变化也是硫酸化多糖产生生物学活性的重要原因。
[0008] 党参为桔梗科植物党参Cbt/orfFpsis (Franch. ) Nannf.、素花党参 Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta (Nannf. ) L. T. Shen 5? j 11 Codonopsi s Oliv.的干燥根，以肉质根食用或入药。党参具有健脾益肺，养血生津的作用。 常用于脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血不足等病症。党参主要成分有党参多糖、党参皂 苷、甾醇类、三廠类、生物碱、内酯类、香豆素类等。党参多糖（Oliv. polysaccharides)是从党参的干燥根中提取分离得到的水溶性杂多糖，药理试验证明党参 多糖具有明确的增强免疫力、抗肿瘤、抗应激、抗衰老等多个方面的药理作用。但党参抗病 毒研究的文献只见苟鹏报到了轮叶党参提取物对犬细小病毒有一定的抑制作用，和党参多 糖硫酸酯对鸡新城疫病毒（NDV)有抑制作用。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是：提供一种党参多糖硫酸酯的新用途。
[0010] 还提供了一种党参多糖硫酸酯的新制备方案。
[0011] 本发明是这样实现的：党参多糖硫酸酯在制备抗I型单纯疱疹病毒药物中的应 用。
[0012] 党参多糖硫酸酯的制备方法，先提取、纯化党参多糖，用氨基磺酸法对党参多糖进 行硫酸化修饰，修饰条件为党参多糖与氨基磺酸的摩尔质量比为1:0. 〇4g/mol，反应时间15 min〇
[0013] 获得取代度为0. 763的党参多糖硫酸酯。
[0014] 为了验证本发明的技术效果，发明人进行了如下实验： 1、党参多糖的提取 用水煎-醇沉法。取党参饮片1000 g，粉碎，至于索氏提取器中，用80%乙醇加热回流 3次脱脂，药渣加10倍量水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h ;抽滤药渣，合并 3次滤液后浓缩。浓缩液加入95%乙醇到乙醇含量为80%，于4 °C冰箱内静置12 h后，3000 r/min离心，收集沉淀部分，真空干燥后，复溶，加95%乙醇到乙醇含量为80%后，离心，收集 沉淀，冻干，干燥沉淀物，得到深棕色党参粗多糖。党参多糖的最佳提取工艺是温度l〇〇°C， 料液比为16倍，提取时间为3h，提取次数为2次，在此条件下，党参粗糖的提取率为26%左 右。
[0015] 2、党参多糖的纯化 (1)粗多糖中除去蛋白质：党参粗多糖按照1:100(g/mL)溶解于足量蒸馏水中后，另取 少量溶液，加蒸馏水稀释后，在紫外分光光度计下从800nm到200nm波长进行扫描。对溶 解有粗多糖的溶液中，每l〇〇〇mL中加入lg胃蛋白酶，并在37°C下进行恒温水浴12h后，将 200mL的氯仿与正丁醇混合物加入含有胃蛋白酶的粗多糖中，充分震荡，静置12h后分离收 集下层有机相，弃去中层变性蛋白层，收集上层含有党参多糖的水溶液，并在紫外分光光度 计下做全波长扫描，反复数次，直至水溶液无蛋白的特征吸收峰26(T280nm处无蛋白特征 吸收峰时，证明多糖中的蛋白已经清除干净。
[0016] (2)党参多糖脱色素处理 将去蛋白的党参多糖溶液浓缩后，加入5倍量95%乙醇醇沉，离心收集醇沉多糖，复溶 后，再次醇沉处理，经过数次后，醇沉上清液颜色变无色后，证明粗多糖中的色素已经被脱 去。收集多次醇沉的党参多糖冻干，得到灰白色党参多糖，证明多糖中的色素已经得到清 除，清除后的党参多糖收集保存于4°C备用。
[0017] (3)膜分离纯化党参多糖 将去蛋白、脱色素的党参粗多糖l〇g，溶解后将此溶液在3500r/min的速度下离心，弃 去不溶物后，上清液转移到容量瓶中定容至500ml，使得党参粗多糖溶液浓度为20mg/mL， 得到党参多糖C0P-1组分，在4°C条件下保存待透析。
[0018] 将离心后的C0P-1多糖装入不同截留量大小的透析袋中进行透析，分别收集浓缩 透析袋内透析液，冻干后得到C0P-2，C0P-3、C0P-4三份多糖样品。C0P-2组分糖分子量在 350(Tl0000之间；C0P-3多糖分子量大于10000 ;C0P-4多糖分子量在350(Γ7000之间，将透 析袋分离后多糖冻干物均在4°C条件下保存备用。
[0019] (4)DEAE-52阴离子交换柱层析分离党参多糖 湿法装DEAE-52阴离子交换层析柱，将用HC1、NaOH溶液中浸泡处理的DEAE-52粉末， 用大量去离子水反复冲洗至中性后，平衡，过夜，取膜分离纯化处理后的党参多糖C0P-2溶 液上样，开启恒流泵，用〇、. 3mol/L的NaCl洗脱，恒流泵流速设置为0. 2mL/min，收集洗脱 液，5 mL /管，各管取样后按照苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制多糖洗脱曲线，合并收集含 糖管洗脱液，进一步分离纯化。
[0020] 党参多糖经过DEAE-52纤维素凝胶对分离后，以管数为横坐标，吸光度为纵坐标， 取各管中洗脱液，采用苯酚-硫酸法做洗脱曲线见图1所示，洗脱曲线显示第25管-28管 中有较大吸收峰，收集25~28管合并。收集完组分1后，换用0. lmol/L的NaCl溶液洗脱 DEAE凝胶，后得到组分2。组分1含量较多，对收集合并后组分1反复过柱纯化后，合并浓 缩冻干后得到第一个分离组分，该组分程白色粉末状，无特殊气味. (5)葡聚糖G-25凝胶柱层析分离党参多糖 湿法装葡聚糖G-25凝胶层析柱，用0. 9% NaCl冲洗，平衡，过夜，取经DEAE-52阴离子 交换柱层析分离的党参多糖组分1溶液上样，开启恒流泵，用去离子水进行洗脱，恒流泵流 速设置为〇.2mL/min，收集洗脱液，5 mL /管，各管取样后按照苯酚-硫酸法检测多糖含量， 绘制多糖洗脱曲线，合并收集含糖管洗脱液，再进一步分离纯化。
[0021] 采用G-25葡聚糖凝胶，对DEAE-52凝胶分离后的党参多糖组分1进一步做脱盐处 理。DEAE凝胶分离的组分1部分经G-25凝胶分离结果见图2 :该凝胶下洗脱曲线做法与 DEAE-52下做法相同。由于在G-25凝胶中，最后洗脱组分为分子量较小的物质，不是实验分 离设定的目标多糖，因此对G-25凝胶分离后仅收集组分1部分。
[0022] (6)葡聚糖G-100凝胶柱层析分离党参多糖 湿法装葡聚糖G-100凝胶层析柱，用0. 15mol/L的NaCl冲洗，平衡，过夜，取经G-25凝 胶分离后的党参多糖溶液上样，开启恒流泵，洗脱液为(TO. 3mol/L的NaCl溶液，恒流泵流 速设置为〇.2mL/min，收集洗脱液，5 mL /管，各管取样后按照苯酚-硫酸法检测多糖含量， 绘制多糖洗脱曲线，将G-25凝胶分离合并的组分1部分，再经葡聚糖G-100凝胶多次分离 后进行纯化，对洗脱组分做洗脱曲线后，收集合并第21~27管组分，合并浓缩后冻干，分离 得到党参多糖C0P-5(见图3)组分，采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量，糖含量达到98. 61%， 糖醛酸含量为4. 72%。
[0023] (7)党参多糖的分子量测定 党参多糖分子量HPLC法测定条件：仪器：Agilent 1100型高效液相色谱系统；色谱 柱为：色谱柱：Ultrahydrogel?2000 和 Ultrahydrogel? 500 柱两根串联（25 cm X 0.75 cm ;流动相：0. 2mol/mL的NaCl溶液；流速：0. 8mL/min，进样体积40 μ 1，柱温40°C，检测器： 示差检测器，参比为液体流动相，在上述色谱条件下对党参多糖进行分子量测定。
[0024] 测定方法：精密称取已知相对分子量的普鲁兰多糖标准对照品，用蒸馏水溶解 后，配制lmg/ml的溶液，对照品相对分子量分别为为：2.0X 106,7.88X 105,4.04X 105， 2. 12 X105，1. 12 X 104,4. 73 X 103,按照3. 5. 1下方法测定分子量标准曲线。
[0025] 精密称取lmg的党参多糖C0P-5样品后，加入到lmL的流动相中，充分振荡溶解 后，离心lOmin除去不溶物后，取上清液，得到多糖供试品后，进样后对不同的多糖样品分 子量进行测定。
[0026] 取已知分子量的糖，采用SEC色谱法测定分子量标准曲线后以分子量作为纵坐 标，时间作为横坐标，采用最小二乘法对数据处理后，得到分子量-时间曲线先回归方程 Y=-0. 2291X+9. 453 (r=0. 998)，分子量在 4. 73X 103?2. 0X106 内线性关系良好。
[0027] 对不同条件下分离得到的几种党参多糖分子量，进行凝胶排阻法进行分子量、纯 度测定，具体的数据如表1所示，经过DEAE-52凝胶、G-25、G-100凝胶层析柱联合分离后的 多糖C0P-5组分，凝胶排阻色谱测定其纯度D值为1. 42,表明糖的均一性好，90%的分子量 与数均分子量、众均分子量，分布系数数据显示，C0P-5组分的党参多糖这4个指标接近，也 表明了凝胶分离多糖后，对于多糖的分子量得到了较好的控制。
【权利要求】
1. 一种党参多糖硫酸酯在制备抗I型单纯疱疹病毒药物中的应用。
2. -种党参多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：先提取、纯化党参多糖，再用氨基磺 酸法对党参多糖进行硫酸化修饰，修饰条件为党参多糖与氨基磺酸的摩尔质量比为1:0. 04 g/mol，反应时间15 min。
3. 权利要求2所述的党参多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：获得取代度为0. 763 的党参多糖硫酸酯。
【文档编号】A61K31/737GK104147042SQ201410441135
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】余兰, 王毅 申请人:遵义医学院