一种高三尖杉酯碱长循环脂质体及其冻干粉针的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种高三尖杉酯碱的长循环脂质体及其冻干粉针的制备方法，这种高三尖杉酯碱长循环脂质体含高三尖杉酯碱2～8重量份、磷脂10～100重量份、胆固醇1～10重量份、聚乙二醇化脂质2-100重量份。其制备方法为将上述组份溶于有机溶剂中，混合均匀，除去有机溶剂，加入适量冻干保护剂，冻干即得高三尖杉酯碱的长循环脂质体冻干粉针。这种高三尖杉酯碱的长循环脂质体冻干粉针既能显著提高贮存稳定性，又能使高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针能便于稀释给药，使脂质体中的药物持续释放，延长在血液中的循环时间，以提高药物有效成份的利用率，降低毒副作用。
【专利说明】一种高三尖杉酯碱长循环脂质体及其冻干粉针的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种长循环脂质体及其冻干粉针制备方法，具体涉及一种高三尖杉酯碱的长循环脂质体及其冻干粉针制备方法，属于医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]高三尖杉酯碱(HHT)是从我国特有植物海南粗榧中分离出来的一种有效抗白血病药物，在世界上也是我国首先用于急性髓细胞白血病(AML)的治疗，并获得显著疗效。三尖杉酯碱类可抑制真核细胞蛋白质合成的起始阶段，可使核糖核蛋白体分解，释放出新生肽链，干扰核糖核蛋白体功能。药理研究发现，三尖杉酯碱类主要杀伤S期细胞，对细胞从G1 — S、G2 — Μ期移行均有阻断作用，可抑制细胞的DNA及蛋白质的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。ΗΗΤ的作用机制涉及抑制蛋白合成、诱导细胞凋亡和细胞分化等，其中以诱导白血病细胞凋亡最为重要。
[0003]长循环脂质体(long circulating liposomes, LCL)递药系统,可逃避单核巨卩遼细胞系统的识别及捕获，长时间停留在循环系统，能提闻药物的疗效和减少不良应，而且能选择性地趋向肿瘤组织并保持较高的药物浓度。
[0004]循环的白血病细胞可以侵入至骨髓系统、淋巴系统、中枢神经系统中引起相应病变。
[0005]研究开发具有白血病治疗功效的闻二尖杉酷喊长循环脂质体，可以提闻其在血内循环时间、增加药物在侵袭病变区的滞留时间、提高靶区药物浓度，有利于提高白血病的治疗效果，降低毒副作用，改善病人生存状况。
【发明内容】
[0006]技术问题:本发明公开了一种临床适用的高三尖杉酯碱长循环脂质体及其冻干粉针的制备方法，既能显著提高贮存稳定性，又能使高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针能便于稀释给药，使脂质体中的药物持续释放，延长在血液中的循环时间，以提高药物有效成份的利用率，降低毒副作用。
[0007]技术方案:本发明提供了一种高三尖杉酯碱的长循环脂质体，该高三尖杉酯碱长循环脂质体的重量份组成为:高三尖杉酯碱2?8重量份、磷脂10?100重量份、胆固醇1?10重量份、聚乙二醇化脂质2-100重量份。
[0008]所述磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、合成磷脂或氢化磷脂的一种或几种。
[0009]所述聚乙二醇化脂质为聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、泊洛沙姆188、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪酸醚或聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的一种或几种。
[0010]本发明的高三尖杉酯碱长循环脂质体的冻干粉针的制备方法包括以下步骤:
[0011]1)分别称取高三尖杉酯碱2?8重量份、磷脂10?100重量份、胆固醇1?10重量份、聚乙二醇化脂质2-100重量份，溶于2-10重量份有机溶剂中；
[0012]2)减压蒸去步骤I)溶液中有机溶剂，加入2-10重量份纯化水形成混悬液，匀化，超声，即得高三尖杉酯碱长循环脂质体；
[0013]3)将冻干保护剂溶解在步骤2)得到的高三尖杉酯碱长循环脂质体中，冻干保护剂与高三尖杉酯碱长循环脂质体中磷脂重量比为0.2?4:1，无菌过滤；
[0014]4)将步骤3)溶液检验合格，装瓶，冻干，即得高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针。
[0015]所述步骤2)还可以为:直接将步骤I)所得到的最终溶液加入2-10重量份纯化水后，减压蒸去有机溶剂形成混悬液，匀化，超声，即得高三尖杉酯碱长循环脂质体。
[0016]所述有机溶剂为氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮或石油醚中的一种或几种。
[0017]所述冻干保护剂为葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一种或几种。
[0018]所述冻干保护剂与高三尖杉酯碱长循环脂质体中磷脂重量比为0.5?1:1。
[0019]有益效果:研究发现，高三尖杉酯碱与磷脂的用量比例不同，导致制备的脂质体的质量也不同，另外，胆固醇的添加使脂质体制剂包封率显著提高，超声使粒径显著降低，聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺的添加使脂质体制剂为长循环脂质体，能增加血液循环时间，选择性地趋向病变侵袭的组织，并延长释药时间，维持有效的药物浓度。
[0020]本发明高三尖杉酯碱长循环脂质体制剂配方与工艺可使脂质体达到较高的包封率，且有稳定的载药量。本发明的脂质体中药物持续释放，延长药物的在血液中的循环时间。本发明临床适用的高三尖杉酯碱长循环脂质体注射用冻干粉针，既能显著提高贮存稳定性，又能使高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉在加入注射用水重新分散后，能以适当比例与等渗输液稀释给药，保存及用药方便，且提高病人顺应性。
【具体实施方式】
[0021]以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0022]实施例1:高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针制备
[0023]称取高三尖杉酯碱8mg、磷脂40mg，胆固醇2.3mg，聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)8mg溶于乙醇中，混合均匀。将脂质溶液于40°C水浴中、减压旋转蒸发器上，减压除去有机溶剂。将形成的脂膜中加入纯化水，混匀，孵育，得脂质体混悬液。将所得脂质体混悬液进行探针超声减少粒径即得。将20mg甘露醇溶解在脂质体中，无菌过滤后(膜滤器孔径0.22 μ m)，将最终分散物分装在西林瓶中，封盖，冻干，即得成品。
[0024]实施例2:高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针包封率与释药测定
[0025]将冻干粉用灭菌注射用水溶解，然后按葡聚糖凝胶色谱法测定药物包封率，柱内径为1.5cm,柱高15cm。精密移取脂质体2mL上柱，以pH6.8PBS洗脱，收集前15mL的流份，精密移取ImL流份样品，至1mL容量瓶中，以甲醇定容，HPLC分析，计算其含量，按以下公式计算包封率:
[0026]包封率=Cm/Ct X 100%，其中Cm为包入脂质体中的高三尖杉酯碱的量，Ct为高三尖杉酯碱总量。实验结果表明，该制剂药物包封率为(90.84±2.23)%
[0027]取分离得到高三尖杉酯碱脂质体混悬液和等浓度的高三尖杉酯碱的标准溶液分别装入已经处理好的透析袋中，以透析袋夹夹紧，置于PH6.8的缓冲液20mL中恒温(37 ± I) °C，恒速 50rpm 搅拌，分别于 10、30、60、120min 和 4、6、8、12、24h 取释放液 0.5mL，同时补加等体积同温度的释药介质，将药液以0.22 μ m的微孔滤膜过滤，进样10 μ L，计算累积释药百分数。以累积释药百分率对时间(t，h)作图，结果，游离的高三尖杉酯碱在4h内释放的较快，大于80%，而高三尖杉酯碱脂质体则在12h内稳定释放，与前者相比，脂质体具有一定的缓释效果。
[0028]实施例3:高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针的贮存稳定性实验
[0029]以冻干前的高三尖杉酯碱长循环脂质体溶液为对照，以形态变化、粒径变化、包封率变化、药物含量变化为指标，比较冻干后放置3个月的稳定性。实验结果表明冻干后放置3个月粒径没有明显变化(p〈0.05)，粒径分布均匀，多分散系数为0.181 ;外观形态没有明显变化，均匀圆整，呈现球形或类球形；药物包封率和药物的含量差异均为没有明显变化(p〈0.05)，表现出高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉的贮存稳定性。
[0030]实施例4:高三尖杉酯碱长循环脂质体对肿瘤细胞的抑制作用
[0031]将处于对数生长期的人白血病细胞K562按每孔lOOyL(约lX104/mL)接种在96孔板中，置于37°C，含5% C02的细胞培养箱培养24h。样品分三组:①生理盐水对照组，②市售高三尖杉酯碱注射液组和③高三尖杉酯碱脂质体的冻干粉溶液组，每组分别用培养液稀释至低、中、高三种浓度，向每孔加100 μ L样品，使各组中药物浓度分别一致；将96孔板在37°C，含5% C02的细胞培养箱中孵育24h。向各孔中加入cck_8溶液10 μ L。37°C下孵育4h。用酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光度(0D)，计算细胞的存活率。
[0032]实验结果表明，细胞活力均随着制剂中药物浓度的增加明显降低，说明药物浓度越大，对K562细胞的毒性越大；当②和③中药物浓度相同时，③组的细胞活力最小，对肿瘤细胞的抑制作用最强。
[0033]实施例5:高三尖杉酯碱长循环脂质体对白血病小鼠模型的治疗作用
[0034]取对数生长期的K562细胞，以1500rpm的转速离心5min，去上清，用DMEM基础培养液洗涤细胞2次，充分去除胎牛血清，再用DMEM基础培养液将细胞配成1 X 106个/mL浓度的细胞悬液。随后向N0D/SCID小鼠尾静脉注射lmL的上述细胞悬液。接种后用流式技术检测外周血中⑶13表达，以鉴定造模成功。待模型建立成功后，将小鼠随机分为①生理盐水组、②市售第高三尖杉酯碱组和③高三尖杉酯碱长循环脂质体组，分别在0、3、6、9天尾静脉注射给药，②③组药物浓度一致。过程中观察小鼠体重变化、生存时间，14天后处死小鼠，检测外周血中白细胞数量和CD13的阳性表达率。
[0035]实验结果表明，相比较②组，第③小鼠体重变化较小，没有明显体重下降；生存率提高。外周血中白细胞数量和⑶13的阳性表达率，均为①最高，其次为②组，第③组最小。
【权利要求】
1.一种高三尖杉酯碱的长循环脂质体，其特征在于该高三尖杉酯碱长循环脂质体的重量份组成为:高三尖杉酯碱2?8重量份、磷脂10?100重量份、胆固醇I?10重量份、聚乙二醇化脂质2-100重量份。
2.根据权利要求1所述的一种高三尖杉酯碱长循环脂质体，其特征在于所述磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、合成磷脂或氢化磷脂的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种高三尖杉酯碱长循环脂质体，其特征在于所述聚乙二醇化脂质为聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、泊洛沙姆188、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪酸醚或聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的一种或几种。
4.一种如权利要求1所述的高三尖杉酯碱长循环脂质体的冻干粉针的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤: 1)分别称取高三尖杉酯碱2?8重量份、磷脂10?100重量份、胆固醇I?10重量份、聚乙二醇化脂质2-100重量份,溶于2-10重量份有机溶剂中； 2)减压蒸去步骤I)溶液中有机溶剂，加入2-10重量份纯化水形成混悬液，匀化，超声，即得高三尖杉酯碱长循环脂质体； 3)将冻干保护剂溶解在步骤2)得到的高三尖杉酯碱长循环脂质体中，冻干保护剂与高三尖杉酯碱长循环脂质体中磷脂重量比为0.2?4:1，无菌过滤； 4)将步骤3)溶液检验合格，装瓶，冻干，即得高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针。
5.根据权利要求4所述的一种高三尖杉酯碱长循环脂质体的冻干粉针的制备方法，其特征在于所述步骤2)为:直接将步骤I)所得到的最终溶液加入2-10重量份纯化水后，减压蒸去有机溶剂形成混悬液，匀化，超声，即得高三尖杉酯碱长循环脂质体。
6.根据权利要求4所述的一种高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮或石油醚中的一种或几种。
7.根据权利要求4所述的一种高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针的制备方法，其特征在于所述冻干保护剂为葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一种或几种。
8.根据权利要求4所述的一种高三尖杉酯碱长循环脂质体冻干粉针的制备方法，其特征在于所述冻干保护剂与高三尖杉酯碱长循环脂质体中磷脂重量比为0.5?1:1。
【文档编号】A61P35/02GK104257609SQ201410447264
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】熊非, 田吉来, 顾宁, 吉民 申请人:东南大学