一种免疫佐剂及含有该免疫佐剂的疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种免疫佐剂，所述免疫佐剂由阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵（DDA）、聚肌胞（PolyI：C）和胆固醇组成。本发明通过筛选可增强佐剂稳定性的试剂，并兼顾疫苗免疫活性及临床应用，发现胆固醇联合DDA、PolyI：C构建新型疫苗佐剂DDA+PolyI：C+胆固醇（简称DPC），增加了佐剂DDA和PolyI:C的稳定性，且粒径小于DDA+PolyI：C（简称DP），易于后期研发和生产的进行；将其与融合蛋白LT70进行联合构建结核亚单位疫苗LT70-DPC，发现整体保护效果强于BCG和LT70-DP。
【专利说明】一种免疫佐剂及含有该免疫佐剂的疫苗
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种免疫佐剂及含有该免疫佐剂的疫苗。
【背景技术】
[0002] 铝佐剂作为唯一一个注册佐剂在世界范围广泛应用，其主要介导体液免疫，对于 以细胞免疫为主的疾病却效果不佳。结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒的合并感染现已成 为世界公共卫生问题，两种疾病都是以细胞免疫为特点，目前缺乏理想的针对细胞免疫为 主的佐剂。近年来，尽管佐剂研究有了很大的进步，然而出于安全性方面的考虑，新型疫苗 佐剂获批品种寥寥无几。安全性好同时能有效引发体液免疫与细胞免疫的新型佐剂开发异 常迫切。
[0003] 阳离子脂质体作为疫苗佐剂被发现已经超过40年，不仅具有抗原提呈、保护抗原 防止其在体内降解的作用，而且能诱导树突状细胞成熟，增强免疫反应。其表面正电荷是延 长疫苗在注射部位停留、增加抗原提呈、延长刺激体内细胞免疫时间的重要因素。DDA是一 种阳离子脂质体季铵盐，其N原子上连有两个甲基和两个十八烷基，当温度高于其胶液相 变温度时，长碳氢链与具有离子性质的氨基可以使其自组装成脂质体。DDA主要通过静电作 用与细胞表面直接接触，将抗原递送给细胞，然后诱导活化细胞将抗原吸收，增加脾脏DC、 巨噬细胞和B细胞对抗原的吸收，从而显著增加效应细胞释放IFN- γ。
[0004] PolyI :c是合成的双链RNA，能诱导产生抗原特异性的⑶8+T细胞，可被内含体的 TLR3受体识别。本 申请人:在前期实验中，将DDA和PolyI: C联合应用作为结核亚单位疫苗 佐剂使用，在加强BCG免疫后，能有效诱导小鼠特异性的细胞免疫应答，且能有效的减轻结 核分枝杆菌感染造成的病理损伤（专利号：201110199072X)。然而，该佐剂稳定性较差，易 于发生絮凝现象，不利于最终投入生产和实际应用。为此，我们在前期佐剂DDA和PolyI: C 的基础上，研究更加稳定和有效的新型免疫佐剂，以增强疫苗的保护效果，适于后期的研发 和生产。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种免疫佐剂，能够有效诱导细 胞和体液免疫应答，从而作为细胞免疫佐剂和体液免疫佐剂使用；同时，具有良好的稳定性 和有效性，适用于后期的研发和生产。
[0006] 本发明提供的一种免疫佐剂，由阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵（DDA)、聚肌胞 (Polyl :C)和胆固醇组成。
[0007] 优选地，所述免疫佐剂中二甲基三十六烷基铵与胆固醇的摩尔比为2:1。
[0008] 本发明还提供阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵（DDA)、聚肌胞（Polyl :C)和胆 固醇在制备免疫佐剂中的应用。
[0009] 本发明的第三个目的是提供上述结核杆菌亚单位疫苗佐剂在制备免疫治疗药物 及免疫疫苗中的应用。
[0010] 本发明的第四个目的是提供免疫疫苗的制备方法，步骤如下：
[0011] (1)将抗原和Polyl: C分别用PBS缓冲液溶解；
[0012] (2)将DDA和胆固醇用无水乙醇溶解后蒸发，再用PBS缓冲液溶解，形成混悬液；
[0013] (3)将步骤⑴中的抗原溶液和Polyl:C溶液混勻，在混合液中逐滴加入步骤（2) 制备得到的混悬液，充分乳化呈均一的乳油状，得到亚单位疫苗。
[0014] 优选地，所述抗原为结核杆菌抗原。
[0015] 进一步地，步骤如下：
[0016] (1)将抗原用PBS缓冲液溶解至0· 2mg/ml ;
[0017] (2)将 Polyl: C 用 PBS 缓冲液溶解至 lmg/ml ;
[0018] (3)将DDA和胆固醇用无水乙醇溶解后蒸发，加 PBS缓冲液溶解，溶解后DDA的浓 度为2. 5mg/ml，胆固醇的浓度为0· 766mg/ml ;
[0019] (4)取Polyl: C溶液与等体积抗原溶液充分混匀；
[0020] (5)在混合溶液中逐滴加入DDA和胆固醇混悬液，加入体积为Polyl: C溶液与抗原 溶液体积之和；充分乳化，呈均一的乳油状即得到免疫疫苗。
[0021] 其中，因为DDA的分子量为630. 98,胆固醇的分子量为386. 67,所以两者的摩尔比 为 2:1。
[0022] 本发明的第五个目的是提高应用上述方法制备得到的免疫疫苗。
[0023] 本 申请人:研究发现：（I)DDA为阳离子脂质体，在温度加热到凝胶液体高于其相变 温度时自组装成脂质体，络合阳离子凝胶状态的脂质体与带相反电荷的寡核苷酸通常导致 高度不稳定，易产生絮凝现象。（2)胆固醇具有调节膜流动性的作用，被称为脂质体"流动 性缓冲剂"，在脂质体中加入可起到：①增加脂质体中药物的包封率，提高脂质体的抗原提 呈能力。②胆固醇可联合阳离子脂质体DDA的末端亲水基团，从而改善其稳定性。③胆固 醇中醇羟基可中和DDA中季铵基的毒性，从而增加阳离子脂质体的安全性。
[0024] 本发明通过筛选可增强佐剂稳定性的试剂，并兼顾疫苗免疫活性及临床应用，发 现胆固醇联合DDA、Polyl :C构建新型疫苗佐剂DDA+Polyl :C+胆固醇（简称DPC)，增加了 佐剂DDA和PolyI = C的稳定性，且粒径小于DDA+Polyl :C (简称DP)，易于后期研发和生产 的进行；利用乳化-溶剂挥发法，将DDA和胆固醇制成微米级阳离子脂质体，在电镜下显示 粒径大小均一，外形整圆，为单室脂质体。将其与抗原（融合蛋白LT70)进行联合构建形成 免疫疫苗LT70-DPC，通过C57BL/6小鼠模型分别进行免疫学评价及保护效率评价，检测新 型佐剂DPC联合抗原（融合蛋白LT70)的保护效果。实验结果显示新型佐剂DPC联合抗原 (融合蛋白LT70)可以有效诱导小鼠的结核抗原特异性的细胞和体液免疫应答；在动物保 护效率实验中，保护效果和LT70-DP相当，强于BCG ;在小鼠病理损伤面积统计中，相比于对 照组、BCG和没有改进的佐剂DDA+Polyl :C组，明显降低了小鼠肺组织病理损伤；整体保护 效果强于BCG和LT70-DP。综上，本专利申请的新型疫苗佐剂DPC能够有效诱导小鼠的细胞 和体液免疫应答，有望作为免疫佐剂使用，并有望成为具有临床应用价值的有效的结核亚 单位疫苗佐剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0026] 图1为佐剂DDA和PolyI = C添加不同辅料的Zeta电位结果；
[0027] 图2为抗原、DDA和胆固醇在脂质体中的排列方式；
[0028] 图3为透射电镜下观测佐剂DDA、PolyI :C和胆固醇脂质体结果；
[0029] 图4为结核亚单位疫苗LT70/DPC的细胞免疫原性检测结果；*p〈0. 05vs PBS， BCG ；
[0030] 图5为结核亚单位疫苗LT70/DPC的体液免疫原性检测结果；其中，a为小鼠血清 结核抗原特异性抗体IgGl水平，b为小鼠血清结核抗原特异性抗体IgG2c水平。*p〈0. 05vs PBS, BCG ；
[0031] 图6为结核亚单位疫苗LT70/DPC的保护效果评价；#ρ〈0· Olvs PBS ;
[0032] 图7为结核亚单位疫苗免疫和毒株攻击后小鼠肺组织病理反应；
[0033] 图8为结核亚单位疫苗免疫和毒株攻击后小鼠肺脏病理损伤程度。
【具体实施方式】
[0034] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0035] 试剂和材料：
[0036] PolyI = C购自开平牵牛生化制药有限公司；
[0037] 阳离子脂质体二甲基三十六烧基铵（dimo-thylidioctyl ammonium bromide, DDA)购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；
[0038] 胆固醇购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。
[0039] 抗原为结核杆菌抗原融合蛋白LT70,其全称为ESAT6-Ag85B-MPT6419Q_ 198-Mtb8. 4-Rv2626c，制备方法具体如下（也可参见专利申请号为201410390880. 8):
[0040] 1.融合蛋白的构建和纯化
[0041] I. 1构建融合蛋白LT70表达质粒pET30a (+) -LT70
[0042] (1)构建重组基因载体 PET3Oa (+) -LT69 (ESAT6-Ag85B-MPT6419Q_ 198-Mtb8· 4-Hsp X)。
[0043] A，pET30a(+)-EA(ESAT6_Ag85B)的构建：
[0044] 以临床分枝杆菌菌液为模板，PCR扩增ESAT6，Ag85B相应基因，并将其克隆构建至 质粒pET30a中。
[0045]
【权利要求】
1. 一种免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂由阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵 (DDA)、聚肌胞（Polyl :C)和胆固醇组成。
2. 根据权利要求1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂中二甲基三十六烷基 铵与胆固醇的摩尔比为2:1。
3. 阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵（DDA)、聚肌胞（Polyl :C)和胆固醇在制备免疫 佐剂中的应用。
4. 权利要求1或2所述的免疫佐剂在制备免疫治疗药物及免疫疫苗中的应用。
5. 权利要求4所述的免疫疫苗的制备方法，其特征在于：步骤如下： (1) 将抗原和Polyl: C分别用PBS缓冲液溶解； (2) 将DDA和胆固醇用无水乙醇溶解后蒸发，再用PBS缓冲液溶解，形成混悬液； (3) 将步骤（1)中的抗原溶液和Polyl: C溶液混匀，在混合液中逐滴加入步骤（2)制备 得到的混悬液，充分乳化呈均一的乳油状，得到亚单位疫苗。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述抗原为结核杆菌抗原。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤如下： (1) 将抗原用PBS缓冲液溶解至0. 2mg/ml ; (2) 将Polyl :C用PBS缓冲液溶解至lmg/ml ; (3) 将DDA和胆固醇用无水乙醇溶解后蒸发，加 PBS缓冲液溶解，溶解后DDA的浓度为 2. 5mg/ml，胆固醇的浓度为0· 766mg/ml ; (4) 取Polyl :C溶液与等体积抗原溶液充分混匀； (5) 在混合溶液中逐滴加入DDA和胆固醇混悬液，加入体积为Polyl: C溶液与抗原溶液 体积之和；充分乳化，呈均一的乳油状即得到免疫疫苗。
8. 应用权利要求5-7任一所述的方法制备得到的免疫疫苗。
【文档编号】A61K39/04GK104225591SQ201410470358
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】祝秉东, 刘勋, 汪月, 何珊珊, 牛红霞, 马澜, 何娟娟, 陆小铃, 于红娟 申请人:兰州大学