一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用。所述的递药系统由中性粒细胞以及以直接或间接地方式载到中性粒细胞内或表面的治疗性物质或者检测性物质组成。本发明将中性粒细胞作为药物的载体，能够将药物主动靶向到炎症部位，提高药物在炎症部位的浓度。到达炎症部位的中性粒细胞在细胞因子的刺激下，异常激活，快速解体以“天网”形式死亡，有利于将所荷载的药物快速释放到靶部位，提高治疗效果，降低毒副作用。
【专利说明】一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制剂领域，涉及一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用， 具体涉及一种以中性粒细胞为载体的靶向炎症部位的递送系统。
【背景技术】
[0002] 炎症指生物组织受到外伤、出血、或病原感染等刺激，激发的生理反应，其中包括 红肿、发热、疼痛等症状。炎症反应是先天免疫系统为移除有害刺激或病原体及促进修复的 一种重要防御机制，根据发病的原因分为感染性炎症、非特异性炎症及变态反应性炎症。感 染性炎症是由病毒、细菌或细菌产物造成的炎症，通常用抗生素或抗真菌药物来治疗；非特 异性炎症是用某种致炎因子于动物体内或体外引起炎症或其某个阶段的细胞组织反应，如 缺血再灌注性损伤、术后损伤等，需要系统性治疗；变态反应性炎症是多型变态反应的终末 表现如狼疮性皮炎，需要抗免疫治疗。
[0003] 目前，针对炎症组织全身给药后，由于其独特的病理特征，使得药物的靶向效率较 低，全身毒副作用较大。炎症的病理特征主要包括局部组织变质、渗出和增生。由于炎症血 管具有较高的通透性，血管内富含蛋白质的液体和白细胞渗出，导致炎症局部组织间质压 升高。可见，炎症部位血管的高渗透性为药物从血管溢出并滞留于炎症部位提供了可能，但 是由于较高的炎症组织间质压阻碍了药物进入炎症部位。由于抗炎药物较低的靶向性，使 得一些感染性炎症如细菌性肺炎，治疗不及时，从而产生耐药性导致较高的死亡率。而对于 一些炎症相关疾病的治疗，如缺血再灌注性脑损伤、术后肿瘤复发等，由于原发灶在周围被 非特异性炎症组织所包围，治疗药物靶向效率降低，药效下降，副作用增加。
[0004] 如何以最小的剂量达到最佳的诊断和治疗效果一直以来都是困扰药剂工作者们 的关键性问题，随着纳米【技术领域】的发展和人们对生物体的不断深入了解，靶向递送系统 应运而生。靶向递送系统主要分为三大类：被动靶向、主动靶向以及物理化学靶向。与以往 的传递系统相比，虽然这些新兴的靶向递送系统已经有了质的飞跃，但是仍然存在靶向性 差，毒副作用强，诊断治疗效果难以达到人们预期等的缺点，因此，极其需要寻找一种更为 1?效、低毒的革巴向递送系统。
[0005] 免疫细胞，包括单核吞噬细胞（树状突细胞，单核细胞和巨噬细胞），中性粒细胞 和淋巴细胞。炎症过程中免疫细胞的渗出是炎症反应最为重要的特征，而中性粒细胞作为 炎症发生时的"防御卫士"，被趋化因子吸引能够第一时间到达炎症部位。目前，仍未见中性 粒细胞作为载体用于炎症部位药物、探针和显影剂递送研究的相同或相近报导。药物或纳 米制剂荷载到中性粒细胞内存在一些有待解决的科学问题，如药物荷载的方式，细胞荷载 药物、探针和显影剂的量，所荷载药物在细胞内稳定性以及细胞载体固有生理活性的维持 等问题。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了靶向炎症组织的荷载药物的中性粒 细胞递药系统。
[0007] 本发明的另一目的是提供该递药系统的应用。
[0008] 本发明的又一目的是提供一种治疗炎症的药物。
[0009] -种炎症靶向的中性粒细胞递药系统，所述的递药系统由中性粒细胞以及以直接 或间接地方式载到中性粒细胞内或表面的治疗性物质或者检测性物质组成。
[0010] 其中，所述的治疗性物质包括但不限于药物（化学合成药物、天然药物或天然药 物提取物）、具有治疗作用的DNA、RNA、蛋白质或多肽中的一种或多种；所述的检测性物质 选自探针、显影剂中的一种或多种。
[0011] 所述的间接地方式是指将纳米载体作为工具，将治疗性物质或者检测性物质先装 载在纳米载体内，组成纳米制剂，再将纳米制剂荷载到中性粒细胞内或表面。
[0012] 所述的纳米载体优选自正电性、负电性或近中性的粒径为I-IOOOnm纳米制剂。
[0013] 所述的纳米载体包括但不限于金纳米粒/棒、磁性纳米粒、介孔二氧化娃纳米粒、 石墨烯、脂质体、胶束、纳米乳、纳米球、纳米囊、微球、微丸或树枝状聚合物。
[0014] 所述的药物选自传出神经系统药物、中枢神经系统药、心血管系统药、激素及呼吸 消化系统药、抗菌或抗病毒药物、抗肿瘤药物、维生素中的一种或多种。
[0015] 所述的药物优选自解热镇痛类药物、非留体抗炎药物、抗肿瘤类药物、抗生素类药 物、利尿药、降压药、降脂药、降血糖药、激素类药物或维生素类药物中的一种或多种。
[0016] 所述的药物进一步优选地西泮、苯妥英钠、氯丙嗪、氟西汀、美沙酮、甲氯芬酯、氯 贝胆碱、硫酸阿托品、异丙肾上腺素、马来酸氯苯那敏、盐酸普鲁卡因、盐酸普萘洛尔、盐酸 维拉帕米、盐酸胺碘酮、氯沙坦、硝酸甘油、多巴酚丁胺、辛伐他汀、氯吡格雷、哌唑嗪、西咪 替丁、地芬尼多、西沙比利、联苯双酯、阿司匹林、吲哚美辛、盐酸氮芥、氟尿嘧啶、紫杉醇、阿 莫西林、四环素、氨基糖苷、罗红霉素、氯霉素、左氟沙星、异烟肼、磺胺嘧啶、氟康唑、盐酸金 刚烷胺、磷酸氟喹、格列苯脲、氢氯噻嗪、前列腺素、胰岛素、雌二醇、维生素 A、维生素 C中的 一种或多种。
[0017] 本发明所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统在制备治疗或诊断炎症和/或炎 症相关疾病的药物或试剂中的应用。
[0018] 其中，所述的炎症包括感染性炎症、非特异性炎症、变态反应性炎症以及炎症相关 性疾病。
[0019] 所述的感染性炎症包括病毒、细菌或细菌产物造成的炎症；所述的非特异性炎症 包括即物理性炎症，包括手术或外伤引起的红肿、疼痛等；变态反应性炎症包括狼疮性皮 炎、过敏性哮喘、风湿性关节炎；炎症相关性疾病包括肿瘤术后复发的治疗、动脉粥样硬化、 缺血缺氧性脑病。
[0020] 本发明将治疗性物质或者检测性物质先包覆在不同电性的纳米载体中（正电性、 负电性、近中性，I-IOOOnm)，再将载药纳米载体（即纳米制剂）荷载到中性粒细胞内/表 面；或者直接将治疗性物质或者检测性物质荷载到中性粒细胞内/表面，成功制备了以中 性粒细胞为载体的递送系统。将所制备的中性粒细胞递药系统静脉注射到人体内，血液循 环过程中，受到炎症区域释放的趋化因子的刺激，穿过炎症部位血管，沿着趋化因子浓度梯 度，主动定位到炎症部位，提高了炎症部位药物浓度，保障了药效的发挥。研究表明，感染性 炎症、非特异性炎症、变态反应性炎症以及炎症相关性疾病如肿瘤手术所引起的急性炎症 都与中性粒细胞募集有关，因此利用中性粒细胞作为递药系统治疗炎症或炎症相关的疾病 如肿瘤手术后利用急性炎症治疗肿瘤的复发，可以有效提高药物在靶部位的蓄积，提高药 物的药效，降低其毒副作用。综上所述，荷载治疗性物质或者检测性物质的中性粒细胞，在 炎症因子的引诱下，可以将治疗性物质或者检测性物质成功递送到炎症相关疾病部位，进 行疾病的治疗和诊断，抑制疾病的发生和发展。
[0021] 一种治疗炎症和/或炎症相关疾病的药物，包含本发明所述的炎症靶向的中性粒 细胞递药系统。
[0022] 所述的中性粒细胞递药系统中的治疗性物质可以为常规给药途径中对炎症和/ 或炎症相关疾病有治疗作用的药物，包括但不限于神经系统类药物、心脑血管类药、血液、 呼吸、消化系统药、内分泌系统以及免疫调节药物如免疫增强药干扰素、免疫抑制剂环孢素 等。
[0023] -种诊断炎症和/或炎症相关疾病的试剂，包含本发明所述的炎症靶向的中性粒 细胞递药系统。
[0024] 所述的中性粒细胞递药系统中的诊断性物质包括但不限于探针如DNA探针、突光 探针，造影剂如X线观察常用的碘制剂、硫酸钡以及核磁成像造影剂如钆喷酸葡胺等。
[0025] 本发明中所涉及的某些概念定义如下：
[0026] 纳米载体：即纳米级药物载体，是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输 送系统。将药物包封于亚微粒（即纳米载体）中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过 性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。
[0027] 本发明所述的纳米制剂可按照现有技术中报道过的任何一种方法制备。
[0028] 脂质体制备：
[0029] (1)药物分散于有机相的脂质体制备方法
[0030] 适合制备脂溶性药物的脂质体，具体说来这一类方法包括薄膜分散法、注入法、前 体脂质体法、超声分散法等方法。
[0031] (2)药物分散于水相的脂质体制备方法
[0032] 适合制备水溶性药物的脂质体，但要求药物有比较好的稳定性，具体说来这一类 方法包括反相蒸发法、复乳法、熔融法、冻融法、冷冻干燥法、表面活性剂处理法、钙融合法、 离心法等方法。
[0033] 炎症：具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应为炎症。
[0034] 有益效果：
[0035] 中性粒细胞是数量最多的白细胞，占白细胞的50%?70%，容易从患者体内获 得，这为药物递送提供了丰富的后备军。
[0036] 本发明以中性粒细胞为递药载体，首先，中性粒细胞保护所载药物、探针或显影剂 等免受网状内皮系统清除，延长半衰期，有效控制释放，降低免疫原性和毒副作用。其次，中 性粒细胞作为载体可以穿过疏水屏障顺利到达发病区域，提高靶部位的浓度。第三，由于中 性粒细胞具有趋化性质，能够靶向到损伤、炎症和肿瘤部位释药。因此，中性粒细胞作为低 毒的转运体，可以起到靶向递送、延长循环时间，降低细胞和组织的毒性的作用。
[0037] 所以，鉴于中性粒细胞作为递药系统具有上述优点，将中性粒细胞作为药物的载 体，能够将药物主动靶向到炎症部位，提高药物在炎症部位的浓度。到达炎症部位的中性粒 细胞在细胞因子的刺激下，异常激活，快速解体以"天网"形式死亡，有利于将所荷载的药物 快速释放到靶部位，提高治疗效果，降低毒副作用。
[0038] 与现有技术相比，本发明具有的优点如下：
[0039] 1.本发明成功制备的中性粒细胞递药系统，顺趋化因子浓度梯度到达炎症组织， 成功解决了药物、探针或显影剂等的靶向性问题。
[0040] 2.本发明所制备的中性粒细胞递药系统，通过纳米载体的介导，保证了中性粒细 胞较高的载药量，并且避免了药物对中性粒细胞生理活性的影响。
[0041] 3.本发明所制备的中性粒细胞递送系统，由于中性粒细胞是机体的一种天然免疫 细胞，吞噬能力强，因此细胞所载药物、探针或显影剂的量很高。
[0042] 4.本发明所使用的药物载体中性粒细胞，是人体内数量最多的免疫细胞，容易从 患者体内获得，并且中性粒细胞在炎症部位异常激活后，会以独特的死亡方式裂解，能够将 所荷载的药物快速、彻底的释放到炎症组织，这使得本发明具备较高的临床开发应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1瑞氏-吉姆萨对65% /78% Percoll分离层形态学鉴定。
[0044] 图2不同表面电位载药脂质体的释放。
[0045] 图3中性粒细胞对不同电性脂质体的摄取量。
[0046] 图4三种电性紫杉醇脂质体在体外模拟不同生理病理条件下在中性粒细胞中的 滞留。
[0047] 图5术后脑胶质瘤模型小鼠给药后炎症部位荷载负电性、近中性、正电性纳米制 剂的中性粒细胞递药系统相对于市售制剂的相对摄取率。
[0048] 图6小鼠给药后市售制剂与荷载负电性、近中性、正电性纳米制剂的中性粒细胞 递药系统靶向效率。
[0049] 图7脑胶质瘤术后模型小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂泰素、荷载 负电性、近中性、正电性纳米制剂的中性粒细胞递药系统生存期曲线。
[0050] 图8三种电性左氧氟沙星脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的 滞留
[0051] 图9肺炎链球菌肺炎模型小鼠给药后炎症部位中性粒细胞递药系统相对于市售 制剂的相对摄取率。
[0052] 图10小鼠给药后市售制剂与中性粒细胞递药系统靶向效率。
[0053] 图11肺炎链球菌肺炎模型小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂左氧氟 沙星、载药中性粒细胞递药系统生存期曲线。
[0054] 图12三种电性布洛芬脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留
[0055] 图13耳肿胀模型小鼠给药后炎症部位中性粒细胞递药系统相对于市售制剂的相 对摄取率。
[0056] 图14小鼠给药后市售制剂与中性粒细胞递药系统靶向效率。
[0057] 图15耳肿胀模型小鼠小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂布洛芬、载 药中性粒细胞递药系统耳肿胀程度。
[0058] 图16三种电性布洛芬脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留
[0059] 图17佐剂性关节炎模型小鼠给药后炎症部位中性粒细胞递药系统相对于市售制 剂的相对摄取率。
[0060] 图18小鼠给药后市售制剂与中性粒细胞递药系统靶向效率。
[0061] 图19佐剂性关节炎模型小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂布洛芬、 载药中性粒细胞递药系统关节炎指数评分。
【具体实施方式】
[0062] 以下结合各实施例对本发明的技术方案做进一步说明，实施例仅是举例说明本发 明的技术方案及其效果，并不应作为对本发明保护范围的限制。
[0063] 实施例1荷载不同表面电位紫杉醇脂质体中性粒细胞递药系统对术后脑胶质瘤 小鼠模型的靶向性及药效学评价
[0064] 一、骨髓中性粒细胞的分离和纯化
[0065] 将 Percoll 母液与 10XPBS 按 9:1 (v/v)制备成 100% Percoll，以 IXPBS 稀释制 备成55%、65%、68% (v/v)Percoll分离液。按照分离液密度先重后轻的顺序，缓慢均匀 叠加制备55^^65%的两层Percoll分离液，将新鲜提取的小鼠胫骨骨髓细胞用IXPBS稀 释制备成单细胞悬液，1:1 (v/v)缓慢均匀加在之前制备55%、65% Percoll分离液顶部， IOOOg离心30min。提取55%、65%分离液夹层的骨髓细胞，加入一倍体积I XPBS洗涤并重 悬，再缓慢叠加到68 %的Percoll分离液上IOOOg离心30min，提取68 %分离液层的骨髓细 胞，加入一倍体积IXPBS洗涤，重复两次，RPMI1640培养基重悬制备小鼠骨髓中性粒细胞 悬液，备用。
[0066] 用红色荧光标记的细胞表面蛋白Gr-I抗体（北京达科为生物科技有限公司）对 提取细胞进行染色；37°C、5% C02孵育30min，流式细胞仪检验所提取细胞纯度。用台盼蓝 对提取细胞进行活力检测细胞活力为98%左右；用瑞氏-吉姆萨染色液对提取细胞进行形 态学纯度鉴定，结果如图1所示，分离得到的中性粒细胞细胞核大多呈成熟杆状或分叶状； 用红色荧光标记的细胞表面蛋白Gr-I抗体对提取细胞进行染色，结果发现所提取中性粒 细胞纯度高于90%。
[0067] 二、紫杉醇-脂质体-中性粒细胞（PTX-Liposome-NEs)递药系统的制备
[0068] 1.荷载紫杉醇的不同电性脂质体的制备
[0069] 利用薄膜分散法制备荷载紫杉醇的三种不同电性的脂质体，制备步骤具体为：
[0070] 精密称取处方量的下列各物质
[0071] 1)正电性脂质体：大豆磷脂90mg+阳离子脂质IOmg+胆固醇IOmg+紫杉醇5mg ;
[0072] 2)近中性脂质体：中性脂质IOOmg+胆固醇IOmg+紫杉醇5mg ;
[0073] 3)负电性脂质体：大豆磷脂IOOmg+胆固醇IOmg+紫杉醇5mg ;
[0074] 将处方量各物质溶于氯仿/甲醇（2:1，V:V)混合溶剂中，混匀后，40°C水浴抽真空 旋干成膜，并在真空干燥器中放置过夜以完全除去有机溶剂后，用超纯水37°C下水化脂膜， 得到的脂质混悬液用超声波细胞粉粹机冰浴分散，分别过〇. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜，制 得三种不同电性的荷载紫杉醇的脂质体（PTX-Liposome)。
[0075] 使用HPLC法测定PTX-Liposome的载药量和包封率，使用激光粒径分析仪测定粒 径和电位，如表1所示。
[0076] 表 I
[0077]
【权利要求】
1. 一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的递药系统由中性粒细胞以 及以直接或间接地方式载到中性粒细胞内或表面的治疗性物质或者检测性物质组成。
2. 根据权利要求1所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的治疗性 物质选自药物、DNA、RNA、蛋白质或多肽中的一种或多种；所述的检测性物质选自探针、显影 剂中的一种或多种。
3. 根据权利要求1或2所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的间 接地方式是指将纳米载体作为工具，将治疗性物质或者检测性物质先装载在纳米载体内， 制成纳米制剂，再将纳米制剂荷载到中性粒细胞内或表面。
4. 根据权利要求3所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的纳米载 体选自正电性、负电性或近中性的粒径为l-l〇〇〇nm的纳米制剂。
5. 根据权利要求3所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的纳米载 体为金纳米粒/棒、磁性纳米粒、介孔二氧化娃纳米粒、石墨烯、脂质体、胶束、纳米乳、纳米 球、纳米囊、微球、微丸或树枝状聚合物。
6. 根据权利要求2所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的药物选 自传出神经系统药物、中枢神经系统药、心血管系统药、激素及呼吸消化系统药、抗菌或抗 病毒药物、抗肿瘤药物、维生素中的一种或多种。
7. 根据权利要求6所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的药物选 自地西泮、苯妥英钠、氯丙嗪、氟西汀、美沙酮、甲氯芬酯、氯贝胆碱、硫酸阿托品、异丙肾上 腺素、马来酸氯苯那敏、盐酸普鲁卡因、盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸胺碘酮、氯沙坦、 硝酸甘油、多巴酚丁胺、辛伐他汀、氯吡格雷、哌唑嗪、西咪替丁、地芬尼多、西沙比利、联苯 双酯、阿司匹林、吲哚美辛、盐酸氮芥、氟尿嘧啶、紫杉醇、阿莫西林、四环素、氨基糖苷、罗红 霉素、氯霉素、左氟沙星、异烟肼、磺胺嘧啶、氟康唑、盐酸金刚烷胺、磷酸氟喹、格列苯脲、氢 氯噻嗪、前列腺素、胰岛素、雌二醇、维生素 A或维生素 C中的一种或多种。
8. 权利要求1所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统在制备治疗或诊断炎症和/或炎 症相关疾病的药物或试剂中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的炎症包括感染性炎症、非特异性炎 症、变态反应性炎症以及炎症相关性疾病。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的感染性炎症包括病毒、细菌或细菌 产物造成的炎症；所述的非特异性炎症为物理性炎症，包括手术或外伤引起的红肿、疼痛； 变态反应性炎症包括狼疮性皮炎、过敏性哮喘或风湿性关节炎；炎症相关性疾病包括肿瘤 术后复发的治疗、动脉粥样硬化或缺血缺氧性脑病。
11. 一种治疗炎症和/或炎症相关疾病的药物，其特征在于包含权利要求1所述的炎症 靶向的中性粒细胞递药系统。
12. -种诊断炎症和/或炎症相关疾病的试剂，其特征在于包含权利要求1所述的炎症 靶向的中性粒细胞递药系统。
【文档编号】A61K31/5383GK104225609SQ201410484577
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月20日 优先权日:2014年9月20日
【发明者】张灿, 薛敬伟, 赵泽恺, 张蕾, 温雅静 申请人:中国药科大学