具有免疫增强作用的多磷腈分子及其在制备疫苗组合物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于免疫佐剂【技术领域】，公开了一种免疫佐剂，其为多磷腈高分子聚合物，该高分子聚合物的侧链为对丙酸钠苯氧基，分子量为70-100万单位之间。本发明还公开了制备该免疫佐剂的方法，含有该免疫佐剂的疫苗组合物及其制备方法，以及该免疫佐剂在制备疫苗组合物中的应用。本发明通过对多磷腈高分子聚合物的侧链以及分子量进行选择和筛选，不仅有效调节了多磷腈高分子聚合物的水解速率，还有效提高了多磷腈高分子聚合物作为免疫佐剂的免疫刺激活性。此外，本发明还以四氢呋喃代替二甘醇二甲醚作为溶剂，进行多聚[二(对丙酸钠苯氧基)]磷腈的合成，具有材料廉价易得、合成工艺简单易行、产业化程度高、且成本较低等优势。
【专利说明】具有免疫增强作用的多磷腈分子及其在制备疫苗组合物中 的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫佐剂【技术领域】，具体涉及具有免疫增强作用的多磷腈分子及其在 制备疫苗组合物中的应用。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的偶蹄动物急性、热性、高度接触性传 染病，是危害畜牧业最严重的传染病之一，被国际兽医局（OIE)和联合国粮农组织（FAO)在 国际动物卫生法典中列为18种A类传染病之首，近年又被列为重大跨国动物疫病的全球消 灭计划及生物武器安全公约组织重点检查对象。目前针对口蹄疫的防治还是以免疫预防为 主，虽然各种新型疫苗的研制为口蹄疫的预防带来新的契机。但是由于各种新型疫苗在免 疫保护效力上的不足，导致其还不能完全取代传统灭活疫苗。在国际上，南美的一些国家已 通过口蹄疫灭活疫苗接种免疫获得了"无口蹄疫国家地位"。在我国的口蹄疫防控中，其灭 活疫苗仍是主流免疫疫苗，其市场份额依然很大，在我国及周边国家和地区的口蹄疫控制 中发挥了重要作用。
[0003] 在口蹄疫灭活疫苗研发之初，一般都是使用水佐剂来配伍口蹄疫灭活抗原，但在 1997年英国动物卫生研究所的Pirbright实验室用两种新的油佐剂Mnotnadie ISA25和 206制备口蹄疫苗免疫猪和牛羊。后续的研究发现，油佐剂相比于水佐剂配伍灭活抗原所制 备的疫苗，在猪和牛羊上都能产生更强的抗体反应，致使后来的灭活疫苗都采用油佐剂配 制。但是油佐剂的使用却大大地提高了疫苗的成本，而且其副作用较大，通常会造成注射部 位的红肿、疼痛、发烧甚至过敏死亡等问题。因此，如果能够找到一种与油佐剂效力相当的 水佐剂来配制灭活抗原疫苗，那么这种安全高效疫苗的市场前景将会更为广阔。
[0004] 多磷腈成分是一种新型的潜在具有免疫佐剂效应的高分子化合物，目前的研究已 证明其具有免疫增强作用，其与呼吸系统疫病病原抗原相配伍免疫小鼠后，证明多磷腈不 仅提高代表天然免疫的IgA抗体的水平，而且在获得性免疫方面不仅能够增强代表Thl型 的IFN γ水平，还能增强代表Th2型的IL-4的分泌水平。
[0005] 多磷腈分子是由一个有机主链和拥有多个不同有机取代基的侧链组成的高分子 聚合物，使其兼有有机和无机聚合物的性能，引入不同的侧链，可以制备具有不同功能的聚 磷腈高分子。因此它可以是亲水的或是亲油的，可以是导体、半导体或是绝缘体，还可以是 耐腐蚀材料、耐溶剂和化学药品，也可以是生物活性物质。
[0006] 最初作为免疫佐剂成分的多磷腈分子，是一种被称为PCPP的多磷腈高聚物，但是 后来发现另外一种侧链取代基与PCPP不同的被称为PCEP的多磷腈成分，在细胞免疫和体 液方面具有更强的免疫增强优势。这说明不同取代基的多磷腈分子的免疫活性也各不相 同。由此可知，虽然多磷腈成分可以作为一种较好的免疫佐剂，但是并不是所有的多磷腈都 具备可以成为良好的生物佐剂成分的可能。此外，即便是取代基相同的多磷腈分子，由于 其合成工艺的不同，导致其分子量大小有所差异，而这些不同分子量的多磷腈分子免疫活 性也各不相同。并且在实际应用中还要考虑到分子量过大的多磷腈成分其溶解度也相应变 小。因此，如何建立一种成熟的合成工艺，筛选免疫增强作用强并且溶解度高的多磷腈分 子，是目前多磷腈作为免疫佐剂应用中亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种免疫佐剂，其为多磷 腈高分子聚合物，该多磷腈高分子聚合物的侧链为对丙酸钠苯氧基，分子量为70-100万单 位之间。
[0008] 在本发明优选的实施方案中，该免疫佐剂是通过以下步骤制备而来的：
[0009] 1、聚二氯磷腈的合成
[0010] 将氯化铵和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸钙以及三氯苯作为溶剂，合成聚 二氯磷腈；
[0011] 2、对丙酸甲酯苯丙酸钠的合成
[0012] 将对羟基苯丙酸甲酯与氢化钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合成对丙酸甲酯苯丙酸 钠；
[0013] 3、聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成
[0014] 将前两步合成的聚二氯磷腈和对丙酸甲酯苯丙酸钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合 成聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈；
[0015] 4、聚[二（对丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成
[0016] 在合成的聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氢氧化钾溶液，合成聚[二 (对丙酸甲苯氧基）]磷腈；
[0017] 5、聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈的合成
[0018] 将沉淀用去离子水溶解,然后再用无水乙醇从去离子水中沉淀,再次将沉淀用去 离子水溶解，加入盐酸溶液滴定调节最终溶液pH = 6. 3,最后用饱和盐水沉淀，获得聚[二 (对丙酸苯氧基）]磷腈；
[0019] 6、聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的合成
[0020] 将得到的聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈溶于去离子水中，用氢氧化钠调节溶液pH =7. 4,用无水乙醇沉淀，获得聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈；
[0021] 7、对多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的分子量进行筛选，获得分子量为70-100 万单位之间的多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈。
[0022] 本发明另一方面提供了一种制备免疫佐剂的方法，该免疫佐剂为多磷腈高分子聚 合物，该多磷腈高分子聚合物的侧链为对丙酸钠苯氧基，分子量为70-100万单位之间，该 制备方法包括如下步骤：
[0023] 1、聚二氯磷腈的合成
[0024] 将氯化铵和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸钙以及三氯苯作为溶剂，合成聚 二氯磷腈；
[0025] 2、对丙酸甲酯苯丙酸钠的合成
[0026] 将对羟基苯丙酸甲酯与氢化钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合成对丙酸甲酯苯丙酸 钠；
[0027] 3、聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成
[0028] 将前两步合成的聚二氯磷腈和对丙酸甲酯苯丙酸钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合 成聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈；
[0029] 4、聚[二（对丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成
[0030] 在合成的聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氢氧化钾溶液，合成聚[二 (对丙酸甲苯氧基）]磷腈；
[0031] 5、聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈的合成
[0032] 将沉淀用去离子水溶解，然后再用无水乙醇从去离子水中沉淀，再次将沉淀用去 离子水溶解，加入盐酸溶液滴定调节最终溶液pH = 6. 3,最后用饱和盐水沉淀，获得聚[二 (对丙酸苯氧基）]磷腈；
[0033] 6、聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的合成
[0034] 将得到的聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈溶于去离子水中，用氢氧化钠调节溶液pH =7. 4,用无水乙醇沉淀，获得聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈；
[0035] 7、对多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的分子量进行筛选，获得分子量为70-100 万单位之间的多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈。
[0036] 本发明另一方面提供了一种疫苗组合物，其含有有效量的本发明所述的免疫佐剂 以及免疫原。
[0037] 在本发明优选的实施方案中，该疫苗组合物中免疫原为口蹄疫灭活抗原，更加优 选为亚洲I型口蹄疫灭活疫苗抗原。
[0038] 本发明另一方面提供了制备本发明所述的疫苗组合物的方法，其包括混合本发明 所述的免疫佐剂与免疫原的步骤。
[0039] 本发明再一方面还提供了本发明所述的免疫佐剂在制备疫苗组合物中的应用。
[0040] 在本发明的上述应用中，免疫原优选为口蹄疫灭活抗原，更加优选为亚洲I型口 蹄疫灭活疫苗抗原。
[0041] 与现有技术相比，本发明具有如下的特点和优势：
[0042] 首先，本发明不仅首次提出了并非所有的多磷腈高分子聚合物都具有良好的免疫 佐剂效应，还进一步通过对多磷腈高分子聚合物的侧链以及分子量进行选择和筛选，不仅 有效调节了多磷腈高分子聚合物的水解速率，同时还有效提高了多磷腈高分子聚合物作为 免疫佐剂的免疫刺激活性，具有如下现有技术中其它多磷腈高分子聚合物作为免疫佐剂所 无法比拟的特性。
[0043] 1、多磷腈高分子聚合物多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的磷氮碳结构骨架能 够被生物完全降解，以保证免疫佐剂和抗原的同步释放。
[0044] 2、多磷腈高分子聚合物多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的骨架结构具有很好 的柔顺性，与抗原蛋白结合能够促进对蛋白抗原的有效呈递。
[0045] 3、多磷腈高分子聚合物多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈与抗原蛋白之间通过 相对温和的非共价键络合，能够最大限度地保证抗原的完整性，也不影响其分子的天然结 构。
[0046] 4、多磷腈高分子聚合物多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的分子量较大，离子密 度高，装载抗原量大（抗原载体），与抗原蛋白形成的络合物稳定性强。
[0047] 其次，在多磷腈高分子聚合物的合成方面，传统的多聚[二（对丙酸钠苯氧基）] 磷腈合成方法中，均使用二甘醇二甲醚作溶剂，存在后处理过程损失大、产率较低、且价格 昂贵等缺点。本发明以价格低廉的四氢呋喃代替二甘醇二甲醚作为溶剂，进行多聚[二（对 丙酸钠苯氧基）]磷腈的合成，具有材料廉价易得、合成工艺简单易行、产业化程度高、且成 本较低等优势，为多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的工业化生产打下了良好的基础。 [0048] 最后，本发明不仅确定了多磷腈高分子聚合物多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈 的最佳分子量范围，还通过相应的实验确定了其最佳剂量为IOOug/只。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1为多磷腈佐剂成分合成工艺流程图。
[0050] 图2为不同分子量多磷腈疫苗的免疫效果评价图。
[0051 ] 1(相对分子量<30万） 2 (相对分子量30万-70万）
[0052] 3 (相对分子量> 70万） 一抗原对照
[0053] +空白对照
[0054] 图3为不同剂量多磷腈疫苗的免疫效果评价图。
[0055] -*-： 500ug IOOug 50ug -?#-； 20ug 抗原对照 空白对照
【具体实施方式】
[0056] 以下结合附图对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
[0057] 实施例1 :多磷腈佐剂成分的合成工艺
[0058] 1、聚二氯磷腈的合成
[0059] 将氯化铵和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸钙以及三氯苯作为溶剂，在 190-195?条件下反应4h。合成聚二氯磷腈。
[0060] 2、对丙酸甲酯苯丙酸钠的合成
[0061] 将对羟基苯丙酸甲酯与氢化钠混合以四氢呋喃作为溶剂室温反应4h，合成对丙酸 甲酯苯丙酸钠。
[0062] 3、聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成
[0063] 将前两步合成的聚二氯磷腈和对丙酸甲酯苯丙酸钠混合以四氢呋喃作为溶剂 65°C反应58h，生成聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈。
[0064] 4、聚[二（对丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成
[0065] 在生成的聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氢氧化钾溶液，60°C下反应 2h，生成聚[二（对丙酸甲苯氧基）]磷腈。
[0066] 5、聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈的合成
[0067] 倾倒出液体，将沉淀用去离子水溶解，然后再用无水乙醇从去离子水中沉淀，再次 将沉淀用去离子水溶解，加入盐酸溶液滴定调节最终溶液pH = 6. 3,最后用饱和盐水沉淀， 得到聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈。
[0068] 6、多磷腈分子：聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的合成
[0069] 将得到的聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈溶于去离子水中，用氢氧化钠调节溶液pH =7. 4,用无水乙醇沉淀，最终得到多磷腈分子：聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈。
[0070] 实施例2 :根据分子量大小对多磷腈分段
[0071] 对多磷腈分子聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈进行分子量分段，即采用不同截留 分子量的透析袋，对聚磷腈分子聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈进行透析，以精确控制聚 磷腈的分子量。
[0072] 分别使用30万和70万的透析袋对聚磷腈分子聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈 进行透析，得到分子量分别为30万以下、30万-70万以及70万以上的聚磷腈分子。
[0073] 实施例3 :不同分子量的多磷腈分子与亚洲I型口蹄疫抗原配伍免疫小鼠的免疫 佐剂效应评价实验
[0074] 将制备好的不同分子量的多磷腈分子（剂量为IOOug/只）与亚洲I型口蹄疫灭 活抗原按照规定剂量配伍（亚洲I型口蹄疫灭活抗原由中农威特公司生产，剂量为标准剂 量）制备试验疫苗。
[0075] 将本发明配伍的不同分子量的多磷腈疫苗、单独抗原疫苗（抗原对照，即亚洲I型 口蹄疫灭活抗原）、PBS (空白对照）分别免疫接种试验鼠，用液相阻断ELISA试剂盒（由中 国农业科学院兰州兽医研究所生产）检测各组抗体滴度，评价不同分子量多磷腈的免疫佐 剂作用。
[0076] 抗体滴度结果表明，相对分子量大于70万的多磷腈疫苗，其抗体滴度明显高于其 他分子量大小的多磷腈疫苗，具体实验结果参见图2。同时考虑到实际应用中，分子量过大 的多磷腈成分其溶解度相应变小，因此本发明最终选定分子量为70-100万单位之间的多 磷腈分子聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈作为免疫佐剂。
[0077] 实施例4 :不同剂量的多磷腈分子与亚洲I型口蹄疫抗原配伍免疫小鼠的免疫佐 剂效应评价实验
[0078] 将分子量为70-100万单位之间的多磷腈分子聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈按 照不同剂量（20ug/只、50ug/只、IOOug/只和500ug/只）分别与亚洲I型口蹄疫灭活抗原 配伍（亚洲I型口蹄疫灭活抗原由中农威特公司生产，剂量为标准剂量）制备试验疫苗。
[0079] 将上述不同剂量的多磷腈疫苗、单独抗原疫苗（抗原对照，即亚洲I型口蹄疫灭活 抗原）、PBS (空白对照）分别免疫接种试验鼠，用液相阻断ELISA试剂盒（由中国农业科学 院兰州兽医研究所生产）检测各组抗体滴度，评价不同剂量的多磷腈的免疫佐剂作用，并 观察毒副作用。
[0080] 抗体滴度结果表明，剂量分别为IOOug/只和500ug/只的多磷腈疫苗，其抗体滴度 明显高于其他剂量的多磷腈疫苗，具体结果参见图3。同时，考虑到实际生产过程中的成本 问题，本发明最终选定剂量为IOOug/只的多磷腈分子聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈作 为免疫佐剂的最佳剂量。
[0081] 由本发明的【具体实施方式】部分可知，本发明中最优选的作为免疫佐剂的多磷腈成 分，其侧链为对丙酸钠苯氧基，且其最佳分子量范围为70-100万单位之间。
【权利要求】
1. 一种免疫佐剂，其为多磷腈高分子聚合物，所述多磷腈高分子聚合物的侧链为对丙 酸钠苯氧基，分子量为70-100万单位之间。
2. 根据权利要求1所述的免疫佐剂，其通过以下步骤制备而来： (1) 聚二氯磷腈的合成 将氯化铵和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸钙以及三氯苯作为溶剂，合成聚二氯 磷腈； (2) 对丙酸甲酯苯丙酸钠的合成 将对羟基苯丙酸甲酯与氢化钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合成对丙酸甲酯苯丙酸钠； (3) 聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成 将前两步合成的聚二氯磷腈和对丙酸甲酯苯丙酸钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合成聚 [二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈； (4) 聚[二（对丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成 在合成的聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氢氧化钾溶液，合成聚[二（对 丙酸甲苯氧基）]磷腈； (5) 聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈的合成 将沉淀用去离子水溶解，然后再用无水乙醇从去离子水中沉淀，再次将沉淀用去离子 水溶解，加入盐酸溶液滴定调节最终溶液pH = 6. 3,最后用饱和盐水沉淀，获得聚[二（对 丙酸苯氧基）]磷腈； (6) 聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的合成 将得到的聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈溶于去离子水中，用氢氧化钠调节溶液PH = 7. 4,用无水乙醇沉淀，获得聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈； (7) 对多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的分子量进行筛选，获得分子量为70-100万 单位之间的多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈。
3. -种制备免疫佐剂的方法，所述免疫佐剂为多磷腈高分子聚合物，所述多磷腈高分 子聚合物的侧链为对丙酸钠苯氧基，分子量为70-100万单位之间，所述制备方法包括如下 步骤： (1) 聚二氯磷腈的合成 将氯化铵和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸钙以及三氯苯作为溶剂，合成聚二氯 磷腈； (2) 对丙酸甲酯苯丙酸钠的合成 将对羟基苯丙酸甲酯与氢化钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合成对丙酸甲酯苯丙酸钠； (3) 聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成 将前两步合成的聚二氯磷腈和对丙酸甲酯苯丙酸钠混合以四氢呋喃作为溶剂，合成聚 [二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈； (4) 聚[二（对丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成 在合成的聚[二（对丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氢氧化钾溶液，合成聚[二（对 丙酸甲苯氧基）]磷腈； (5) 聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈的合成 将沉淀用去离子水溶解，然后再用无水乙醇从去离子水中沉淀，再次将沉淀用去离子 水溶解，加入盐酸溶液滴定调节最终溶液pH = 6. 3,最后用饱和盐水沉淀，获得聚[二（对 丙酸苯氧基）]磷腈； (6) 聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的合成 将得到的聚[二（对丙酸苯氧基）]磷腈溶于去离子水中，用氢氧化钠调节溶液PH = 7. 4,用无水乙醇沉淀，获得聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈； (7) 对多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈的分子量进行筛选，获得分子量为70-100万 单位之间的多聚[二（对丙酸钠苯氧基）]磷腈。
4. 一种疫苗组合物，其含有有效量的权利要求1或2所述的免疫佐剂以及免疫原。
5. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中免疫原为口蹄疫灭活抗原，优选为亚洲I型 口蹄疫灭活疫苗抗原。
6. -种制备权利要求4或5中任一项的疫苗组合物的方法，包括混合权利要求1或2 所述的免疫佐剂与免疫原的步骤。
7. 权利要求1或2所述的免疫佐剂在制备疫苗组合物中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其中免疫原为口蹄疫灭活抗原，优选为亚洲I型口蹄疫 灭活疫苗抗原。
【文档编号】A61K39/135GK104324374SQ201410509654
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】景志忠, 曾爽, 陈国华, 房永祥, 宋林华, 贾怀杰, 何小兵 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所