壳-核纳米复合材料的合成方法
【专利摘要】LDHSiO2壳-核纳米复合材料的合成方法，它涉及LDHSiO2壳-核纳米复合材料的合成方法。方法：一、将无水乙醇、去离子水、氨水磁力搅拌混合均匀，再加入正硅酸乙酯，继续搅拌，静置，离心收集沉淀并洗至中性，干燥；二、将NaOH和NaNO3溶于去CO2的去离子水中，并将SiO2纳米粒子分散于其中，得A液；三、取15-20g Mg(NO3)2·6H2O、10-12g Al(NO3)3·9H2O溶于去除CO2的去离子水中，得B液；四、搅拌下将B液滴加到A液中，恒温搅拌，用去除CO2的去离子水洗涤沉淀，真空干燥，即得。本发明的材料，粒径分布均匀且容易控制，制备工艺简单，生产成本较低，易于规模化生产。
【专利说明】LDH@Si〇2壳-核纳米复合材料的合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及LDH@Si化壳-核纳米复合材料合成及其载新城疫病毒La Sota株F基 因质粒DNA纳米粒制备的方法。
【背景技术】
[0002] 新型纳米复合材料作为一种新型的基因输送和控释体系，受到越来越多的关注。 纳米载体具有很多优点，如保护DNA免受核酸酶降解；很好的渗透效应，可直接通过生物膜 屏障进入细胞，释放质粒DNA，表达相应蛋白；经抗原提呈细胞有效摄取，加工处理后提呈 给T细胞，产生免疫应答等。
[0003] 层状双氨氧化物（LDH)是一类具有阴离子可交换性质的阴离子型粘±，已被广泛 用于插层反应前体，并被视为一类新型的药物分子的输运载体。研究表明，其作为新型可调 控的药物载体，在体内具有很好的分散性，可通过调节抑来控制其释放速率，在抑3-5环境 中，其释放药物的速率较快，该对于在树突状细胞值C)或巨瞻细胞内体或溶酶体的酸性环 境中充分释放DNA疫苗很有帮助。此外LDH还具有较高的Zeta电位，该使得其更易于接触 细胞表面，从而进入细胞内部，提高对细胞的转染效率。此外，LDH纳米载体对于DC有着很 好的刺激效应。
[0004] 然而，LDH作为基因递送载体也存在一些不足，如层间距离较小，大分子的质粒 DNA很难插入其中；若将质粒DNA吸附在LDH表面就会减弱对质粒的保护效应，且DNA搭载 量也非常有限，该使得LDH作为基因递送载体在体内虽有很好的保护效应，但治疗效应不 理想。因此，在研究如何利用LDH纳米材料作为基因递送载体优点的同时，又可W突破LDH 较难搭载大分子DNA该一瓶颈，进一步提高DNA疫苗的免疫效果和治疗效应，具有深远的意 义。
[0005] 壳-核结构的纳米材料是近年来发展起来的新型纳米复合材料，它将两种纳米材 料合二为一，从而发挥各自材料的特点。W无机材料制备的二氧化娃纳米粒具有可重复合 成、稳定性好、可抵抗体内各种酶的消化、耐高压灭菌等优点，在基因递送研究中受到了极 为广泛的关注。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了 LDH@Si〇2壳-核纳米复合材料的合成方法，具体涉及LDH@Si〇2 壳-核纳米复合材料的载新城疫病毒La Sota株F基因质粒DNA纳米粒的合成；本发明合 成了 W LDH为壳，Si化为核的壳一核结构的纳米材料，此材料若作为基因载体则可解决单纯 LDH作为基因载体所面临的问题，必将具有重要的科学意义和潜在的应用前景。
[0007] 本发明LDH@Si〇2壳-核纳米复合材料的合成按W下步骤实现：
[0008] -、室温下，依次加入90血无水己醇、10血去离子水和2?4mL的氨水，磁力揽拌 均匀；在磁力揽拌条件下一次性加入10血的正娃酸己醋，继续室温下揽拌2. 0?2.化；之 后，静置10?12h ;然后在转速为10000?120(K)r/min条件下离也3?5min，收集沉淀，用 去离子水和无水己醇反复离也洗涂沉淀，直至洗涂后的液体pH为中性，收集洗涂后的沉淀 置于50?65C烘箱内干燥，即得Si〇2纳米粒；
[000引二、取0. 5g步骤一中制备的Si化纳米粒分散到10血去除C02的去离子水中，超声 分散5?lOmin，得Si化息浮液；准确称取6. 3g化0H、9. IgNaNOs溶于62血去除C02的去离 子水中，将其与上述的Si02息浮液混合，置于H 口瓶中，获得溶液A ;
[0010] S、将 16g Mg(N〇3)2 ? 6&0、11. 7g Al (N03)3 ? 9&0 混合溶于 63血去除 C〇2 的去离 子水中，获得溶液B ;
[0011] 四、在馬保护和揽拌条件下，将B液逐滴滴加到A液中，滴加完毕后，继续室温揽拌 1?化；之后，逐渐升温至70?75C，恒温恒速揽拌20?2化后，过滤，收集沉淀，用去C〇2 的去离子水洗涂沉淀至上清为中性，60?65°C真空干燥20?2化，即完成LDH@Si〇2壳-核 纳米复合材料的合成。
[0012] 本发明包含W下有益效果：
[001引本发明LDH@Si02壳-核纳米复合材料既具有LDH体内分散性化对抑敏感，具有 较高Zeta电位和祀向性，又具有能有效延长抗原滞留时间，利于DC识别，促进DC成熟和向 淋己结趋化的优势；同时，LDH@Si化壳-核纳米复合材料又具备了 Si化易于多量搭载质粒 DNA的特性。因此，本合成的发明LDH@Si02壳-核纳米复合材料有望成为质粒DNA的优良 递送载体。本发明为DNA疫苗在临床上应用提供了一个免疫效果好和安全性能高的递送系 统，将促进DNA疫苗的实际应用。
[0014] 本发明合成的LDH@Si化壳-核纳米复合材料粒径分布均匀（371. 93nm)且容易控 巧IJ，Zeta电位为（+31. 63mV)，该使得其更易于接触细胞表面并进入到细胞内部，提高机体 对抗原的摄取率，从而提高对细胞的转染效率。
[0015] 本发明LDH@Si化壳-核纳米复合材料具有操作简单、成本低等特点，可大规模生 产，作为DNA疫苗载体具有巨大的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是实施例中LDH@Si〇2壳-核纳米复合材料的透射电子显微镜观察图；
[0017] 图2是实施例中LDH@Si化壳-核纳米复合材料的粒径分布图；
[001引 图3是实施例中P抑NA-LDMSi化-NPs体外释放曲线；
[0019] 图4是实施例中P抑NA-LD鹏Si化-NPs肌注组鸡十二指肠病理组织学变化图；
[0020] 图5是实施例中P抑NA-LD鹏Si化-NPs滴鼻组鸡十二指肠病理组织学变化图；
[0021] 图6是实施例中PBS对照组鸡十二指肠病理组织学变化图；
[0022] 图7是实施例中攻毒后P抑NA-LD鹏Si化-NPs滴鼻免疫组鸡也肌组织病理组织学 变化图；
[0023] 图8是实施例中攻毒后P抑NA-LD鹏Si〇2-NPs滴鼻免疫组鸡十二指肠病理组织学 变化图；
[0024] 图9是实施例中攻毒后PBS对照组鸡也肌组织病理组织学变化图；
[00巧]图10是实施例中攻毒后PBS对照组鸡十二指肠病理组织学变化图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明技术方案不局限于W下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0027] 一；本实施方式LDH@Si化壳-核纳米复合材料的合成按W下步骤实 现：
[002引一、室温下，依次加入90血无水己醇、10血去离子水和2?4mL的氨水，磁力揽拌 均匀；在磁力揽拌条件下一次性加入10血的正娃酸己醋，继续室温下揽拌2. 0?2. 5h，之 后，静置10?12h ;然后在转速为10000?120(K)r/min的条件下离也3?5min，收集沉淀， 分别用去离子水和无水己醇反复离也洗涂沉淀，直至洗涂后的液体抑为中性，收集洗涂后 的沉淀置于50?65C烘箱内干燥，即得Si化纳米粒；
[0029] 二、取0. 5g步骤一中制备的Si化纳米粒分散到10血去除(?的去离子水中，超声 分散5?lOmin，得Si化息浮液；准确称取6. 3g化0H、9. Ig NaN〇3溶于62血去除C〇2的去 离子水中，将其与上述的Si〇2息浮液混合，置于H 口瓶中，获得溶液A ;
[0030] H、将 16g Mg(N〇3)2 ? 6&0、11. 7g Al (N03)3 ? 9&0 混合溶于 63血去除 C〇2 的去离 子水中，获得溶液B ;
[0031] 四、在馬保护和揽拌条件下，将B液逐滴滴加到A液中，滴加完毕后，继续室温揽拌 1?化；之后，逐渐升温至70?75C，恒温恒速揽拌20?2化后，过滤，收集沉淀，用去C〇2 的去离子水洗涂沉淀至上清为中性，60?65°C真空干燥20?2化，即完成LDH@Si化壳-核 纳米复合材料的合成。
【具体实施方式】 [0032] 二；本实施方式与一的不同是；步骤一中氨水的用量 为2mL。其它步骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0033] H ;本实施方式与一或二的不同是：步骤一中氨水体 积百分含量为20?30%。其它步骤及参数与一或二相同。
【具体实施方式】 [0034] 四；本实施方式与一至H之一的不同是：步骤四中溶 液B逐滴滴加到溶液A中的速度是0. 02mL/s。其它步骤及参数与一至H之一 相同。
[00巧]【具体实施方式】五；本实施方式与【具体实施方式】一至四之一的不同是：步骤四中滴 加完毕后继续室温揽拌1?化，之后，用去(?的去离子水洗涂沉淀至上清为中性，将滤饼 密封在玻璃容器中，溶胶20?2化，所得溶胶60?65C真空干燥20?2化，即完成LDH@ Si〇2壳-核纳米复合材料的合成。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0036] 通过W下实施例验证本发明的有益效果：
[0037] 实施例1 ;
[0038] 本实施例LDH@Si〇2壳-核纳米复合材料的合成方法，按W下步骤实现：
[0039] -、室温下，在干净的烧杯中依次加入90血无水己醇、10血去离子水和2血的氨 水（体积百分含量为25% )，磁力揽拌均匀；在磁力揽拌下一次性加入IOmL的正娃酸己醋 (TEOS)，继续室温下揽拌化，之后静置12h ; 100(K)r/min离也5min，收集沉淀，用去离子水和 无水己醇反复离也洗涂沉淀，直至离也上层清液抑接近中性，所得白色沉淀置于6(TC烘箱 内干燥，即得Si化纳米粒子；
[0040] 二、取0. 4g步骤一中制备的Si化纳米粒子分散到10血去C〇2的去离子水中，超声 分散5min ;称取6. 3g化0H，9. Ig NaN〇3溶于62血去(?的去离子水中，将其与上述的Si化 息浮液混合，置于H 口瓶中，获得溶液A ;
[00川 H、称取 16g Mg(N03)2 ? 6&0、11. 7g Al (N03)3 ? 9&0 混合溶于 63血去 C02 的去离 子水中，获得溶液B ;
[004引四、在馬保护和揽拌下，将B液逐滴滴加到A液中，滴加过程不超过Ih ;滴加完毕 后继续室温揽拌1.化，之后逐渐升温至7(TC，恒温恒速揽拌2化；之后过滤、用去(?的去离 子水洗涂沉淀至上清为中性，65C真空干燥2化，即完成LDH@Si02壳-核纳米复合材料的合 成。
[004引本实施例合成的LDH@Si02壳-核纳米复合材料的透射电镜图如图1所示。
[0044] 本实施例合成的LDH@Si化壳-核纳米复合材料的粒径分布图如图2所示。
[004引本实施例合成的LDH@Si化壳-核纳米复合材料既具有LDH体内分散性好，对抑敏 感，具有较高Zeta电位和祀向性，又具有能有效延长抗原滞留时间，利于DC识别，促进DC 成熟和向淋己结趋化的优势；同时，LDH@Si化壳-核纳米复合材料又具备了 Si化易于多量 搭载质粒DNA的特性。因此，制备的LDH@Si02壳-核纳米复合材料有望成为质粒DNA的优 良递送载体。本实施例为DNA疫苗在临床上应用提供了一个免疫效果好和安全性能高的递 送系统，将促进DNA疫苗的实际应用。
[0046] 本实施例合成的LDH@Si化壳-核纳米复合材料粒径分布均匀（371. 93nm)且容易 控制，Zeta电位为（+31. 63mV)，该使得其更易于接触细胞表面并进入到细胞内部，提高机 体对抗原的摄取率，从而提高对细胞的转染效率。
[0047] 本实施例合成的LDH@Si化壳-核纳米复合材料具有操作简单、成本低等特点，可 大规模生产，作为DNA疫苗载体具有巨大的应用潜力。
[0048] 实施例2 :
[0049] 本实施例载新城疫DNA疫苗LDH@Si化壳-核纳米粒的制备及其免疫效果，按W下 步骤实现：
[0050] -、用共沉淀法制备载新城疫病毒La Sota株F基因质粒DNA LDH@Si〇2壳-核纳 米粒（P抑NA-LD鹏Si〇2-NPs);
[0051] 二、检测P抑NA-LD鹏Si〇2-NPs体外释放情况：将P抑NA-LD鹏Si〇2-NPs (含质粒 DNA500U g)息液摇床振荡，在不同时间段取出部分混息液离也测定上清中DNA含量，确定 P抑NA-LDH@Si〇2-NPs中质粒DNA释放程度；
[0052] H、检测P抑NA-LD鹏Si化-NPs体外表达；分别用293T细胞进行转染实验，并用间 接免疫英光法检测转染细胞中F蛋白的表达情况；
[0053] 四、P抑NA-LD鹏Si〇2-NPs安全性评价：用CCK-S试剂盒测定P抑NA-LD鹏SiO厂NPs 对鸡胚细胞的毒性；W 10倍免疫剂量分别W肌注和滴鼻的方式对SPF维鸡进行安全性试 验，持续观察并设置对照组；
[0054] 五、P抑NA-LDMSi化-NPs免疫效果评价：将SPF鸡随机分为PBS (肌注）、空白LDH@ Si〇2 纳米粒（肌注）、pDNA-LDH@Si〇2-NPs (肌注）和 pDNA-LDH@Si〇2-NPs (滴鼻）5 组；免疫 后每周采血检测血清中IgG抗体滴度及血清、气管、胆汁、哈德氏腺中IgA水平；同时，各免 疫组SPF鸡血清抗体水平升高到6. 01og2 W上时，用新城疫强毒株F48E9进行滴鼻攻毒，连 续观察35d，计算鸡的发病率、死亡率；
[00对六、实验结果
[0056] 本实施例制备的pDNA-LDH@Si化-NPs体外释放情况如图3所示，表明pDNA-LDH@ Si化-NPs具有很好的体外释放特性，能够延缓基因在体内的表达时间，从而增强免疫效果。
[0057] 体外表达试验结果表明，新城疫病毒F基因的质粒DNA(pVAX I -OPti巧能够W LDH@Si化作为基因递送载体进入细胞表达。
[0058] 细胞毒性试验检测细胞存活率为巧4. 12 + 1. 26) %，表明P抑NA-LDMSi化-NPs对 细胞的毒性小，具有较高的安全性。
[0059] 安全性试验结果表明，肌注（i. m.)和滴鼻（i. n.)接种P抑NA-LDH@Si〇2-NPs SPF 维鸡临床症状均正常，表明大剂量肌注和滴鼻接种P抑NA-LDMSi化-NPs是安全的，病理组 织学变化如图4至图6所示。
[0060] 血清IgG抗体检测结果表明，PBS和空白LDH@Si化纳米复合材料对照组在8周内 没有明显变化，P抑NA-LDH@Si〇2-NPs滴鼻免疫组和P抑NA-LDH@Si〇2-NPs肌肉注射组加强免 疫后一周，抗体效价升高，P抑NA-LDH@Si〇2-NPs滴鼻免疫组在免疫后第5周血清IgG抗体含 量达到最高值并持续至第8周，其他组血清IgG抗体含量均小于P抑NA-LD鹏Si化-NPs滴鼻 免疫组。表明W LDH@Si化为载体制备的疫苗能在鸡体内获得较强的体液免疫并达到了缓 释的效果。
[0061] 检测黏膜提取液IgA抗体结果显示，免疫血清、气管、胆汁及哈德氏腺中 P抑NA-LD鹏Si化-NPs滴鼻免疫组血清中IgA含量在免疫后第4至5周均达到最高峰，显著 高于其他组，并可持续数周较高IgA含量，激发机体的黏膜免疫，从而起到有效的免疫保护 作用。
[0062] 鸡脾淋己增殖实验结果显示，免疫后第4周P抑NA-LD鹏Si化-NPs滴鼻免疫组脾淋 己细胞增殖活性明显增强；免疫后6周P抑NA-LDMSi化-NPs滴鼻免疫组刺激指数仍显著高 于其他组且差异显著，表明P抑NA-U)H@Si〇2-NPs滴鼻免疫组更能明显的提高淋己转化率， 促进机体的细胞免疫。
[0063] 攻毒后各组鸡的死亡情况统计结果见表1。P抑NA-LD鹏Si化-NPs滴鼻免疫组鸡在 攻毒后无一死亡，达到完全保护作用，且临床症状正常。剖检对照组死亡的鸡和P抑NA-LDM Si化-NPs滴鼻免疫组未死亡的鸡，取病变器官制作病理切片，各器官病理组织切片结果 如图7至图10所示。表明对照组鸡的也肌实质变性，肠壁、肠绒毛排列凌乱，大量细胞坏 死，胞浆散布；免疫组鸡的十二指肠、腺胃、也肌无明显病理变化。因此，本实施例制备的 P抑NA-LD鹏Si化-NPs可W完全保护免疫鸡免受病毒的侵染。
[0064] 本实施例制备的P抑NA-LD鹏Si化-NPs免疫鸡W后可W诱导机体产生较高的体液 免疫，细胞免疫W及黏膜免疫，并刺激机体免疫器官及组织产生高滴度抗体，有效抵抗外源 病毒的侵染，并且制备方法简单，产品特性稳定。
[0065] 本实施例使用的LDH@Si化可W很好的包裹抗原，使得制备的疫苗促进免疫鸡产生 高效抗体。因此LDH@Si化壳-核纳米复合材料作为DNA疫苗载体具有广阔的应用前景，并 为其大规模的商业化奠定了理论与实践基础。
[0066] 表1免疫鸡对NDVF48E9株强毒攻击的保护率
[0067]
【权利要求】
1. LDHOSiO2壳-核纳米复合材料的合成方法，其特征在于它是按以下步骤实现： 一、 室温下，依次加入90mL无水乙醇、IOmL去离子水和2?4mL的氨水，磁力搅拌均勻； 在磁力搅拌条件下一次性加入IOmL的正硅酸乙酯，继续室温下搅拌2. 0?2. 5h，之后，静 置10?12h ;然后在转速为10000?12000r/min的条件下离心3?5min，收集沉淀，分别 用去离子水和无水乙醇反复离心洗涤沉淀，直至洗涤后的液体pH为中性，收集洗涤后的沉 淀置于50?65°C烘箱内干燥，即得SiO 2纳米粒； 二、取0. 5g步骤一中制备的SiO2纳米粒分散到IOmL去除CO2的去离子水中，超声分散 5?lOmin，得SiO 2悬浮液；准确称取6. 3gNa0H、9. IgNaNO3溶于62mL去除CO2的去离子水 中，将其与上述的SiO2悬浮液混合，置于三口瓶中，获得溶液A ; 三、 将16gMg (NO3)2 KH2OUL 7gAl (NO3)3 .9H20混合溶于63mL去除CO2的去离子水中， 获得溶液B ; 四、 在N2保护和搅拌条件下，将B液逐滴滴加到A液中，滴加完毕后，继续室温搅拌1? 2h ;之后，逐渐升温至70?75°C，恒温恒速搅拌20?24h后，过滤，收集沉淀，用去CO2的去 离子水洗涤沉淀至上清为中性，60?65°C真空干燥20?24h，即完成LDHOSiO 2壳-核纳米 复合材料的合成。
2. 根据权利要求1所述的LDHOSiO2壳-核纳米复合材料的合成方法，其特征在于步骤 一中氨水的用量为2mL。
3. 根据权利要求1或2所述的LDMSiO2壳-核纳米复合材料的合成方法，其特征在于 步骤一中氨水体积百分含量为25%。
4. 根据权利要求1所述的LDHOSiO2壳-核纳米复合材料的合成方法，其特征在于步骤 四中B液逐滴滴加到A液中的速度是0. 02mL/s。
5. 根据权利要求1所述的LDHOSiO2壳-核纳米复合材料的合成方法，其特征在于步 骤四中滴加完毕后继续室温搅拌1?2h，之后用去CO 2的去离子水洗涤沉淀至上清为中性， 将滤饼密封在玻璃容器中，溶胶20?24h，所得溶胶60?65 °C真空干燥20?24h，即完成 LDHOSiO2壳-核纳米复合材料的合成。
【文档编号】A61K39/17GK104310408SQ201410520387
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】赵凯, 王晓华 申请人:黑龙江大学