功能性自组装纳米多肽水凝胶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种既能促进细胞粘附，又能促进血管内皮细胞增殖迁移的功能性自组装纳米多肽水凝胶(RADA16-I/KLT/RGD)，其包含离子互补型自组装纳米多肽RADA16-I、含VEGF模拟多肽片段的KLT功能多肽和含RGD短肽序列的RGD功能多肽。本发明的功能性自组装纳米多肽水凝胶既能促进细胞粘附，又能促进血管内皮细胞增殖迁移，是一种优良的组织工程框架材料，可以用于组织工程技术或者细胞生物学等科学研究。本发明还提供了功能性自组装纳米多肽水凝胶的物理特性、制备方法和用途。
【专利说明】功能性自组装纳米多肽水凝胶
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种功能性自组装纳米多肽水凝胶及其制备方法。本发明的功能性自组装纳米多肽水凝胶既能促进细胞粘附，又能促进血管内皮细胞增殖迁移，可用作组织工程框架材料应用于血管组织工程领域，还可以用于组织工程技术或者细胞生物学等科学研究。
【背景技术】
[0002]1993年张曙光教授等发现一种可以自组装的离子互补型多肽，并用其合成了水凝胶。自组装多肽水凝胶是多肽分子之间通过氢键、静电相互作用、疏水相互作用等非共价键自发形成的稳定的聚集体，由此可得到不同结构和功能的材料。其溶解于去离子水后，遇盐溶液中的离子自发完成组装，形成孔隙均匀的，含水丰富的三维框架材料，具有以下的特点和优势:(I)随着多肽的合成和分离技术的发展和进步，自然多肽非常容易通过人工设计、合成而获得；(2)多肽序列本身来源于自然界，与生物体作用无免疫反应和毒副作用；(3)通过多肽序列上的氨基或羧基，很容易对多肽序列进行修饰与修改；(4)具备非常好的表面活性和生物相容性；(5)易于被生物降解，且降解后产物是氨基酸单体，非但无毒，而且还可以作为生物体的营养物质。自组装多肽的这些优势和特点使其成为优良的组织工程框架材料。
[0003]目前，经过很多科研工作者的努力研究，多肽的合成已经愈加成熟，特别是RADA序列，VEGF模拟片段，RGD短肽序列等都有研究报道。其中RADA中的一种RADA16-1是目前最常用的自组装多肽，其氨基酸序列为:Ac- (RADA) 4-NH2 ；RGD短肽序列Arg-Gly-Asp，广泛存在于粘连蛋白等多种细胞外基质蛋白中，与细胞膜上的整联蛋白特异性结合，是细胞贴附的关键结合位点；VEGF(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)模拟片段:GGGGKLTWQELYQLKYKGI，可以作为VEGF的类似物，模拟了 VEGF的17-25区间的螺旋区域，该区域能够激活VEGF受体，因此激活包括血管内皮细胞增殖在内的VEGF相关的细胞信号通路。
[0004]将设计和筛选出的功能多肽片段如RGD短肽序列或者VEGF模拟多肽片段复合在离子互补型自组装多肽RADA16-1的羧基末端，形成RGD功能多肽和KLT功能多肽，其序列分别为 Ac-RGD- (RADA) 4_NH2 和 Ac_GGGGKLTWQELYQLKYKGI_ (RADA) 4_NH2，这样就复合了不同功能的生物活性多肽片段以达到不同的应用目的。由于修饰过的多肽分子自组装成凝胶性能较差，为了促进其进行自组装，有科研工作者将RADA16-1多肽和KLT功能多肽以1:1的比率混合(表示为RADA16-1/KLT)，从而保证其可以自组装形成水凝胶，又附加了 KLT功能多肽的模拟VEGF功能片段的生物活性；同样RADA16-1多肽和RGD功能多肽以1:1的比率混合(表示为RADA16-1/RGD)，保证了其既能自组装形成水凝胶又能发挥RGD功能多肽的促进细胞粘附生物活性。然而RADA16-1/KLT虽然具备了模拟VEGF片段的功能，但是其作为组织工程材料，在细胞的粘附方面功能较局限，这使得其在实际应用中效率较低；RADA16-1/RGD虽然可以促进细胞粘附，但是对于血管内皮细胞并没有模拟VEGF片段的特殊功能。
[0005]因此需要一种既保留了多肽的自组装性能，又能够实现多肽功能片段(集合了KLT和RGD两种功能多肽所含有的功能片段)的特殊功能的自组装材料。
【发明内容】
[0006]为了实现上述目的，本发明进行了大量的实验研究和摸索，获得了既能促进细胞粘附，又能促进血管内皮细胞增殖迁移的可以成功进行自组装的功能性自组装纳米多肽RADA16-1/KLT/RGD 水凝胶。
[0007]因此，在第一个方面，本发明提供了一种功能性自组装纳米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝胶(在下文中简称为“RADA16-1/KLT/RGD水凝胶”)，其包含离子互补型自组装纳米多肽RADA16-1、含功能片段RGD短肽序列的RGD功能多肽和含VEGF模拟多肽片段的KLT功能多肽，其中RADA16-1多肽、RGD功能多肽和KLT功能多肽混合的摩尔比为2:1:1。
[0008]在一个优选的实施方案中，KLT功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成VEGF模拟多肽片段GGGGKLTWQELYQLKYKGI形成的，RGD功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成功能片段RGD短肽序列形成的。
[0009]在一个特别优选的实施方案中，所述RADA16-1多肽的序列为Ac- (RADA) 4_NH2 ；RGD功能多肽的序列为Ac-RGD- (RADA) 4_NH2 ；KLT功能多肽的序列为Ac_GGGGKLTWQELYQLKYKGI_(RADA) 4-NH2o
[0010]在第二个方面，本发明提供了制备本发明的功能性自组装纳米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝胶的方法(在下文中，有时简称“本发明的方法”)，该方法包括以下步骤:将RADA16-1多肽、KLT功能多肽和RGD功能多肽的水溶液按2:1:1的摩尔比混合成多肽混合溶液，通过超声处理使多肽完全溶解并混合均匀，然后在室温下诱发上述多肽混合溶液自组装形成水凝胶。
[0011 ] 在一个实施方案中，多肽混合溶液的自组装可以利用本领域常用的用于多肽自组装的平衡盐溶液(例如0.0lM的PBS缓冲液)，或细胞培养基(例如，DMEM/F12)来诱发。
[0012]在一个优选实施方案中，RADA16-1多肽、KLT功能多肽、RGD功能多肽的水溶液分别按1-5%质量浓度,优选I %质量浓度配制。但本领域技术人员应该理解的是，上述质量浓度仅是示例性的，并不限于其他浓度范围。根据本发明的教导，本领域技术人员可以根据本领域中制备水凝胶的常规方法，选择合适的浓度范围。
[0013]在第三个方面，本发明涉及本发明的RADA16-1/KLT/RGD水凝胶在制备组织工程材料中的用途。
[0014]在优选的实施方案中，所述组织工程材料可以用来作为人工血管组织材料。
[0015]在第四个方面，本发明提供了一种人工血管，所述人工血管通过将来源于哺乳动物的离体血管内皮细胞在本发明的RADA16-1/KLT/RGD水凝胶中进行三维培养而获得。
[0016]在一个优选的实施方案中，来源于哺乳动物的离体血管内皮细胞取自哺乳动物的肺、大动脉血管或脐血管。
[0017]在另一个优选的实施方案中，血管内皮细胞是微血管内皮细胞。
[0018]在本发明中，哺乳动物选自猪、马、牛、兔、灵长类动物和人，优选是猪，更优选是人。
[0019]本发明的有益效果
[0020]本发明的功能性自组装纳米多肽水凝胶是由离子互补型自组装纳米多肽RADA16-1、含功能片段RGD短肽序列的RGD功能多肽和含VEGF模拟多肽片段的KLT功能多肽按摩尔比2:1:1混合而成。这个比率是经过大量实验组的成凝胶效果分析得出的，可以保证混合后的多肽溶液既保留了优良的自组装性能，又附加了多肽功能片段(集合了 VEGF模拟片段和RGD短肽序列两种功能片段)的生物活性。
[0021]本发明的功能性自组装纳米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝胶可以用来进行血管内皮细胞的三维培养。本发明的RADA16-1/KLT/RGD水凝胶既能促进细胞粘附，又能促进血管内皮细胞增殖迁移成血管，使用其进行血管内皮细胞三维培养，既可以提供血管内皮细胞一种适宜环境使其增殖迁移成血管，又可以促进其粘附到这种三维框架内，从而负载更多的细胞，是一种集合了更多功能的更为优良的组织工程框架材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是三种多肽溶液按RADA16-1:KLT:RGD = 2:1:1的摩尔比混合后制作样本在原子力显微镜下观察到的多肽纳米纤维的显微照片，其中图1-1 (标注比例尺1.Ομπι)和图1-2 (标注比例尺300nm)显示混合后的该功能性自组装纳米多肽在水溶液中呈现纤维样形态，为一种纳米纤维材料，其纤维直径约5-15nm，长度约200_300nm。
[0023]图2是用盐溶液(0.0lM的PBS缓冲液)诱发摩尔比为2:1:1的RADA16-1/KLT/RGD多肽溶液自组装后得到的水凝胶的照片，如图2-1和图2-2显示，可见此比率的混合多肽溶液有较好的成胶效果，诱发后呈固态凝胶样性状，含水量极丰富，透明，可以将培养基渗透进去来为细胞提供丰富的营养。
[0024]图3是RADA16-1/KLT/RGD水凝胶脱水制作成的样本的扫描电镜显微照片，其中图3-1 (放大400倍)和图3-2 (放大1500倍)显示其聚合成的聚合物纤维尺寸约10-50 μ m,其形成的网络状纤维结构的孔径约10-50 μ m。
[0025]图4是在固态水凝胶中接种血管内皮细胞后在倒置相差显微镜下血管内皮细胞形态的显微照片，其中图4-1 (放大100倍)显示在A组多肽水凝胶(RADA16-1/KLT水凝胶组)中生长的血管内皮细胞；图4-2 (放大100倍)显示B组多肽水凝胶(RADA16-1/KLT/R⑶水凝胶组)中生长的血管内皮细胞。
[0026]图5是将接种血管内皮细胞的多肽纳米水凝胶消化后通过Α0/ΕΒ染色细胞悬液后在荧光显微镜下的显微照片(放大100倍)，其中图5-1显示RADA16-1/KLT水凝胶组的细胞染色结果，图5-2显示RADA16-1/KLT/RGD水凝胶组的细胞染色结果。
【具体实施方式】
[0027]部分术语定义
[0028]“功能多肽”:在本发明中，“功能多肽”是指已经结合了所需功能或活性的多肽片段的多肽，例如“RGD功能多肽”含有功能片段RGD短肽序列，而“KLT功能多肽”含有VEGF模拟多肽片段。
[0029]本发明的功能性自组装纳米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝胶的制备方法:
[0030]作为一个优选的实施例，本发明的功能性自组装纳米多肽RADA16-1/KLT/RGD水凝胶的制备方法可以利用下面的示例性步骤进行:
[0031]按RADA16-1 多肽的序列 Ac-(RADA) 4_NH2、RGD 功能多肽序列 Ac-RGD-(RADA)4-NH2和KLT功能多肽序列Ac-GGGGKLTWQELYQLKYKG1-(RADA)4-NH2合成多肽后，将其分别按1%质量浓度溶解于生物级去离子超纯水并按摩尔比2:1:1混合后用超声作用(例如，在20KHz频率下超声15分钟)使其完全溶解混合均匀，后用本领域中常用的盐溶液如0.0lM的PBS缓冲液诱发其在室温(20-25°C )下进行自组装形成功能性自组装纳米多肽水凝胶RADA16-1/KLT/腳。
[0032]下面结合具体实施例说明本发明，应该理解的是下面的实施例仅用于给出本发明的优选实施方式，而非限制本发明的范围。
[0033]实施例1、多肽的设计与合成
[0034]1.1、离子互补型自组装纳米多肽RADA16-1的序列:Ac_(RADA)4_NH2，可以保证混合后多肽溶液发生自组装。
[0035]1.2、RGD短肽序列Arg-Gly-Asp广泛存在于粘连蛋白等多种细胞外基质蛋白中，与细胞膜上的整联蛋白特异性结合，是细胞贴附的关键结合位点，将RADA16-1羧基末端合成功能片段RGD短肽序列即为本发明所用的RGD功能多肽，其序列为Ac-RGD-(RADA)4-NH2。
[0036]1.3、VEGF模拟多肽片段GGGGGKLTWQELYQLKYKGI，作为 VEGF 的类似物，模拟了 VEGF的17-25区间的螺旋区域。该区域能够激活VEGF受体，因此激活包括血管内皮细胞增殖在内的VEGF相关的细胞信号通路。将RADA16-1多肽的羧基末端合成VEGF模拟多肽片段即为本发明所用的KLT功能多肽，其序列为Ac-GGGGKLTWQELYQLKYKG1-(RADA)4_NH2。
[0037]以上三种多肽合成后均附有其质量分析报告，报告指明三种多肽纯度均在95%以上，符合标准规定。
[0038]实施例2、多肽溶液的制备及原子力显微镜检测
[0039]合成的RADA16_1、KLT及RGD三种多肽粉体分别溶解在生物级去离子超纯水中，分别得到三种质量浓度均为10g/L(l% )的多肽溶液，用超声探针20KHz超声15min，使多肽完全溶解。在经过设计大量实验组研究各种比率混合方法的自组装成凝胶效果后，确定按RADA16-1:KLT:RGD = 2:1:1的摩尔比率来混合。将RADA16-1多肽、KLT功能多肽及RGD功能多肽的水溶液以2:1:1的摩尔比率混合并超声混匀，得到混合多肽溶液(RADA16-1/KLT/RGD)，准备用其制备功能性自组装多肽水凝胶。混合后的多肽溶液迅速使用0.22 μ m的无菌滤器过滤灭菌备用。多肽溶液稀释100倍并超声混匀后，取10 μ I滴到新鲜剥开的云母片上，氮气吹干后用原子力显微镜观察其是否具有纳米纤维形态。
[0040]实施例3、功能性自组装多肽水凝胶的制备及扫描电镜观察凝胶的显微结构
[0041]3.1、为了组装成具有一定形状的完整的水凝胶，本研究使用transwell小室来完成盐溶液诱发自组装。将所需数目的transwell小室放入每孔加入400uL 0.0lM的PBS缓冲液的24孔培养板内，将培养板放入37°C孵箱中过夜使transwell小室的基底膜通透。然后将transwell小室中透过的液体吸出，小室中分别加入100 μ L的混合多肽溶液(RADA16-1/KLT/RGD),然后37°C下(此温度可以加速成胶)孵育至少Ih以凝胶。凝胶形成后取出一个小室，小心割下基底膜取出凝胶，2.5%戊二醛固定30分钟后梯度酒精脱水制作扫描电镜样本送检，测试结果的显微照片如图3。
[0042]3.2、由于RADA16-1/KLT水凝胶的促进血管内皮内皮细胞增殖迁移活性已被相关研究证明，因此本研究中采用其作为对照来证明本发明所特有的功能活性。使用同样的方法将RADA16-1多肽与KLT功能多肽溶液按摩尔比率1:1混合并用超声探针超声混匀，得到混合多肽溶液A (RADA16-1/KLT)，用其制备多肽水凝胶A，此组用于对照来证明本发明的特殊功能。而上面述及的RADA16-1/KLT/R⑶水凝胶则分组为B。用血管内皮细胞培养基EGM2-MV取代PBS缓冲液加入24孔板的孔中37°C细胞培养箱过夜，使培养基缓慢渗透到所有A、B组小室中的水凝胶中，反复换培养基3次来中和水凝胶中的培养基成分，保证细胞接种后的渗透压、PH值及营养成分均合适细胞生长。从而制备出可以接种细胞进行三维培养的功能性自组装多肽水凝胶。
[0043]实施例4、血管内皮细胞在功能性自组装纳米多肽水凝胶的体外三维培养
[0044]将人血管内皮细胞用0.25%的胰酶-EDTA从培养瓶中消化下来，然后调整细胞悬液中细胞的密度为I X 106/ml，各取100 μ L分别接种到Α、Β组小室中的水凝胶中，2小时后吸出未渗入凝胶中的细胞悬液。此时使用的水凝胶是上述制备好的可以接种细胞进行三维培养的功能性自组装多肽水凝胶。接种后每2天换一次24孔板里面的培养基，来保证小室水凝胶中的细胞生长环境。经过5天的培养，倒置相差显微镜观察血管内皮细胞的形貌、迁移状态。然后将小室中的水凝胶用消化酶消化后使用Α0/ΕΒ快速染色30秒后荧光显微镜观察，观察细胞生长状态，凋亡情况并进行细胞计数，分析Α、B两组有无统计学差异。
[0045]结果:
[0046]1、制备的多肽溶液经超声后由粘稠浑浊变得澄清，说明其已溶解并均匀。制备原子力显微镜检测样本后观察，可见混合多肽溶液表现出纳米纤维样结构，其纤维直径约5-15nm，长度约200-300nm，确实为纳米纤维材料属性(可见图1)。
[0047]2、制备的摩尔比率2:1:1的RADA16-1/KLT/RGD的多肽溶液经0.0lM的PBS缓冲液诱发自组装后得到的水凝胶的照片，其中图2-1和图2-2显示，可见此比率的混合多肽溶液有较好的成胶效果，诱发后呈固态凝胶样性状，含水量极丰富，透明，可以将培养基渗透进去来为细胞提供丰富的营养。制成扫描电镜样本后检测显示其聚合成聚合物纤维(如图3)，尺寸约10-50μπι，其形成的网络状纤维结构的孔径约10-50 μ m，而大部分真核细胞的尺寸约5-30 μ m,适合细胞在里面粘附迁移生长。自组装多肽纳米水凝胶材料能够提供真正意义上的三维培养环境。
[0048]3、将细胞接种于多肽水凝胶2小时并弃去未渗入水凝胶的细胞悬液，培养5天后可见B组多肽水凝胶(RADA16-1/KLT/RGD水凝胶)同A组多肽水凝胶(RADA16-1/KLT水凝胶)有相似的细胞生长状态，细胞伸展良好，且互相连接，有围成管腔的形态学趋势。RADA16-1/KLT水凝胶已被相关研究证实有促进血管内皮细胞成血管活性，通过本次实验中比较A、B两组水凝胶，得出RADA16-1/KLT/RGD水凝胶同RADA16-1/KLT水凝胶一样具有促进血管内皮细胞增殖迁移的活性。
[0049]4、分别将A、B两组水凝胶用消化酶消化后,Α0/ΕΒ染色细胞悬液30秒后在倒置相差荧光显微镜下观察，4倍物镜下随机取4个视野可见A、B两组均出现较少凋亡细胞(少于5 % )(橙色荧光)，说明细胞在两种多肽水凝胶中均能较好生存，但是细胞悬液中细胞密度却有较大差异，其中A组(RADA16-1/KLT水凝胶组)平均每个视野约45个细胞，而B组(RADA16-1/KLT/RGD水凝胶组)平均每个视野可见约70个细胞，有统计学差异，可以证明B组(RADA16-1/KLT/RGD水凝胶组)多肽水凝胶负载的细胞数量明显高于A组，说明了RADA16-1/KLT/RGD水凝胶除了有促进血管内皮细胞增殖迁移，还有促进细胞粘附的活性。
[0050]讨论:
[0051]上述所涉及的检测、实验均支持本发明所设计的既能促进细胞粘附，又能促进血管内皮细胞增殖迁移的功能性自组装纳米多肽水凝胶RADA16-1/KLT/RGD，其中原子力显微镜检测多肽溶液可以证明其纳米纤维材料属性；并且使用盐溶液(0.0lM的PBS缓冲液)成功地进行了对RADA16-1多肽、KLT功能多肽、RGD功能多肽按摩尔比率2:1:1混合的多肽溶液的诱发自组装成水凝胶；通过扫描电镜检测可见其内部孔隙结构适合细胞的生长迁移。在其功能活性方面，同已被证实具有促进血管内皮细胞增殖迁移的RADA16-1/KLT水凝胶组对照，接种血管内皮细胞后可以发现RADA16-1/KLT/RGD水凝胶同RADA16-1/KLT水凝胶一样具有促进血管内皮细胞增殖迁移的活性。消化水凝胶制备细胞悬液后Α0/ΕΒ染色证明在此两种多肽水凝胶中进行三维培养的细胞均存活较好，凋亡细胞少于5%，最为关键的是通过消化水凝胶后对其中生长的细胞计数，可证明本发明中设计的RADA16-1/KLT/RGD水凝胶，能在一定时间内使更多数量的细胞粘附生长，从而可以负载更多数量的细胞，所以本发明所设计的既能促进细胞粘附，又能促进血管内皮细胞增殖迁移的功能性自组装纳米多肽水凝胶RADA16-1/KLT/RGD是一种集合了更多功能的更为优良的组织工程框架材料。
[0052]在实际应用方面，鉴于其合成方便、易于对其修饰、安全无免疫反应毒副反应以及易降解等共有优点，加上本发明附加的促进细胞粘附和血管内皮细胞增殖迁移活性功能，使其为细胞生物学研究中模拟体内环境对细胞进行三维培养提供一定的支持，并且其可以在血管组织工程技术中，负载血管内皮细胞进行细胞移植，有较好的体内成毛细血管功能，相比单纯注射细胞疗法有更好的细胞存活率和细胞迁移，从而对于组织工程中组织存活起到重要作用，因此其作为一种负载血管内皮细胞的三维材料在血管组织工程领域有更好的应用前景。
【权利要求】
1.一种功能性自组装纳米多肽水凝胶，其特征在于其包含离子互补型自组装纳米多肽RADA16-1、含功能片段RGD短肽序列的RGD功能多肽和含VEGF模拟多肽片段的KLT功能多肽，其中RADA16-1、RGD功能多肽和KLT功能多肽的摩尔比为2:1:1。
2.权利要求1所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶，其特征在于KLT功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成VEGF模拟多肽片段GGGGKLTWQELYQLKYKGI形成的，且RGD功能多肽是在RADA16-1多肽的羧基末端合成功能片段RGD短肽序列形成的。
3.权利要求2所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶，其特征在于所述RADA16-1多肽的序列为Ac-(RADA) 4-NH2 ;所述RGD功能多肽的序列为Ac-RGD-(RADA) 4-NH2 ;且所述KLT功能多肽的序列为 Ac-GGGGKLTWQELYQLKYKG1-(RADA) 4-NH2。
4.制备权利要求1-3中任一项所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤:将RADA16-1多肽、KLT功能多肽和RGD功能多肽的水溶液按2:1:1的摩尔比混合成多肽混合溶液，通过超声处理使多肽完全溶解并混合均匀，然后在室温下诱发多肽混合溶液自组装形成水凝胶。
5.权利要求1-3中任一项所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶在制备组织工程材料中的用途。
6.权利要求5所述的用途，其特征在于所述组织工程材料是人工血管组织材料。
7.—种人工血管，其特征在于所述人工血管通过将来源于哺乳动物的离体血管内皮细胞在权利要求1-3中任一项所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶中进行三维培养而获得。
8.权利要求7所述的人工血管，其特征在于所述离体血管内皮细胞取自哺乳动物的肺、皮肤、大动脉血管或脐血管。
9.权利要求7所述的人工血管，其特征在于所述血管内皮细胞是微血管内皮细胞。
10.权利要求7-9中任一项所述的人工血管，其特征在于所述哺乳动物选自猪、马、牛、兔、猫、猴、灵长类动物和人，优选是猪，更优选是人。
【文档编号】A61L27/52GK104356402SQ201410531552
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】孙念峰, 刘占鳌, 黄文柏, 周冠洲, 范鲁峰, 邵闻冲 申请人:孙念峰, 刘占鳌