穿心莲总内酯提取方法、穿心莲总内酯药物组合物及用途
【专利摘要】本申请公开了一种提取穿心莲总内酯的方法。所述方法包括：将干燥的穿心莲全草或茎叶用C1-4低级醇水溶液浸提，浓缩浸提液，用活性炭热处理；和将处理后的浓缩液进一步浓缩至完全除去所述低级醇后加入非极性或弱极性有机溶剂萃取，取有机相浓缩结晶。该方法工艺步骤简单，提取效率显著提高，适于工业化生产。本申请还公开了一种穿心莲总内酯药物组合物及其在制备用于治疗或抑制炎症的药物中的用途。
【专利说明】穿心莲总内酯提取方法、穿心莲总内酯药物组合物及用途
【技术领域】
[0001] 本发明总地涉及中药提取物及提取方法，更具体地，涉及穿心莲总内酯提取物及 提取方法。
【背景技术】
[0002] 穿心莲是爵床科植物穿心莲（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥 地上部分（中国药典2010版）。穿心莲中主要活性成分为穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、 新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯等（陈丽霞、曲戈霞、邱峰，穿心莲二萜内酯类化学成分的 研究[J].中国中药杂志，2006, 31 (19): 1594)。穿心莲作为临床常用抗炎中药，具有多种抗 炎有效成分，有清热解毒、消炎、消肿止痛的作用，主要用于治疗细菌性痢疾、尿路感染、急 性扁桃体炎、肠炎、咽喉炎、肺炎和流行性感冒等（张望望、张文书，穿心莲抗炎作用机制研 究[J]?医学综述，2008,14(06) :938-939)。其中穿心莲内酯的抗炎效果是目前临床所公 认的。目前有关穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯抗炎作用研究较多（Niranjan A,Tewari SK, Lehri A. Biological activities of Kalmegh (Andrographis paniculata Nees)and its active principles - A review [J].Indian Journal of Natural Products and Resources, 2010, 1 (2): 125-135)，如在基于脂多糖（LPS)刺激小鼠巨噬细 胞RAW264. 7建立的体外炎症模型中，穿心莲内酯（Chiou WF，Chen CF，Lin JJ. Mechanism of suppression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression in RAW 264.7cells by andrograpolide[J]. British Journal of Pharmacology, 2000, 129(8) :1 553-1560)和新穿心莲内酯（Batkhuu J,Hattori K,Takano F,et al. Suppression of NO production in activated macrophages in vitro and ex vivo by Neoandrographolide isolated from andrographis paniculata[J]. Biol. Pharm. Bull. 2002, 25(9):1169-1174) 的IC50值分别为17. 4 y mol/L和35. 5 y mol/L。穿心莲内酯和新穿心莲内酯的抗炎机理是 在巨噬细胞RAW264. 7中，两者能通过降低诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达来抑制一氧化 氮的合成，还能从头阻止蛋白合成，加速蛋白的降解，降低其稳定性。
[0003] 已经有大量研究公开了提取穿心莲药材中有效成分的方法。例如，中国发明专利 申请CN 1810240A中公开了用70%乙醇溶液浸提穿心莲全草，去掉叶绿素等脂溶性杂质后 经树脂柱纯化，犾得的芽心连总内醋中，芽心连内醋占总内醋的20 -80%;或者米用C02超临 界流体萃取的方法获得的穿心莲总内酯中，穿心莲内酯占总内酯40-95 %。再如，中国发明 专利申请CN101559088A中公开了由穿心莲茎叶提取各种内酯纯品的方法。该方法用95% 乙醇溶液浸提后去掉叶绿素等脂溶性杂质，浓缩获得浸膏、溶于甲醇，并析出穿心莲内酯结 晶，再经氧化铝柱除去黄酮类，得到穿心莲总内酯，其中穿心莲内酯占总内酯含量的20%上 下。
[0004] 上述方法均需要采用柱纯化方法，工艺复杂，增加工业化生产的成本。
[0005] 此外，目前还未有关于穿心莲总内酯抗炎的详细研究的报道。
[0006] 因此仍需要开发更为简单有效且成本低廉的提取工艺并进一步明确穿心莲总内 酯的抗炎效果。
【发明内容】
[0007] 针对以上现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种工艺步骤简单，提 取效率更高的穿心莲总内酯提取方法。该方法不用柱纯化方法，更适于工业化生产。此外， 本发明还提供了一种穿心莲总内酯药物组合物，该组合物的各组分间具有协同作用，能更 好地抑制炎症。
[0008] 根据本发明的第一方面，提供一种提取穿心莲总内酯的方法。所述方法包括以下 步骤：
[0009] A.将干燥的穿心莲全草或茎叶用C1-4低级醇水溶液浸提，浓缩浸提液，用活性炭 热处理；和
[0010] B.将处理后的浓缩液进一步浓缩至完全除去所述低级醇后加入非极性或弱极性 有机溶剂萃取，取有机相浓缩结晶。
[0011] 穿心莲的干燥全草或茎叶都可作为提取原料。本发明的方法提取效率高，因此优 选采用成本更低廉的穿心莲全草。
[0012] 根据优选的实施方式，所述C1-4低级醇可为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁 醇，优选为甲醇或乙醇。
[0013] 所述C1-4低级醇的水溶液的体积百分比浓度（v/v)为70%以上，优选90%以上， 更优选为95%。最优选为95%乙醇溶液。
[0014] 根据一种实施方式，步骤A中，将干燥的穿心莲全草或茎叶用8?15倍量、优选 8?12量、最优选约10倍量的C1-4低级醇水溶液浸提1?3次，每次0. 5?2小时、优选 0. 5?1. 5小时。
[0015] 根据一种实施方式，在用活性炭热处理之前，减压或常压浓缩浸提液至原体积的 1/12?1/8、优选约1/10,以获得无沉淀浓缩液。浓缩温度为50?80°C，优选为约60°C。
[0016] 优选地，活性炭的用量以所述干燥的穿心莲全草或茎叶的重量计为3?8wt%、优 选3?6wt %、最优选为约4wt %。
[0017] 优选地，活性炭热处理温度为50?80°C、优选为约60°C。处理时间优选约30分 钟。
[0018] 所述非极性或弱极性有机溶剂优选为选自由乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿所组成组 中的一种或多种。
[0019] 考虑到溶剂的毒性以及对环境的影响，最优选为乙酸乙酯。且采用该溶剂时可完 全回收，在最终产品中无残留。
[0020] 根据优选的实施方式，萃取在50?80°C、优选约60°C下进行。所述非极性或弱 极性有机溶剂的用量以所述干燥的穿心莲全草或茎叶的重量计为200?1000ml/kg、优选 400 ?750ml/kg、最优选 500ml/kg。
[0021] 优选地，将所述有机相在50?80°C、优选约60°C浓缩为原体积的3/10?4/5、优 选约1/2,在10°C以下，优选在约4°C冷却结晶。
[0022] 根据一种优选实施方式，本发明的方法包括以下步骤：
[0023] A.将干燥的穿心莲全草或茎叶用浓度为90% (v/v)或更高的乙醇水溶液浸提 1?3次，每次0. 5?1. 5小时，在约60°C减压浓缩浸提液至原体积的约1/10,用活性炭在 约60°C热处理；和
[0024] B.将处理后的浓缩液进一步浓缩至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心莲全草或 茎叶的重量计，以400?750ml/kg的比例加入乙酸乙酯进行萃取，取有机相在约60°C下浓 缩为原体积的3/10?4/5,在10°C以下冷却结晶。
[0025] 根据一种最优选实施方式，本发明的方法包括以下步骤：
[0026] A.将干燥的穿心莲全草用浓度为95% (v/v)的乙醇水溶液浸提2次，每次0. 5? 1. 5小时，在约60°C减压浓缩浸提液至原体积的约1/10,用活性炭在约60°C热处理，其中活 性炭的用量以所述干燥的穿心莲全草的重量计为约4wt% ;和
[0027] B.将处理后的浓缩液进一步浓缩至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心莲全草的 重量计，以500ml/kg的比例加入乙酸乙酯进行萃取，取有机相在约60°C下浓缩为原体积的 约1/2,在约4°C冷却结晶。
[0028] 根据本发明的第二方面，提供一种穿心莲总内酯药物组合物。所述组合物中穿心 莲总内酯由穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯组成，所述穿心莲总内酯的含量 占所述组合物总重量的60wt%以上，其中所述组合物中穿心莲内酯：脱水穿心莲内酯：新 穿心莲内酯的重量比为5?8:1:1?3。
[0029] 优选地，所述组合物中穿心莲内酯：脱水穿心莲内酯：新穿心莲内酯的重量比为 5?7:1:2?3。根据优选实施方式，所述穿心莲总内酯的含量占所述组合物总重量的60? 80wt %
[0030] 根据优选的实施方式，所述穿心莲总内酯药物组合物为根据以上提取穿心莲总内 酯的方法制备得到的提取物。
[0031] 根据本发明的第三方面，提供上述穿心莲总内酯药物组合物在制备用于治疗或抑 制炎症的药物中的用途。
[0032] 所述炎症可为细菌性痢疾、尿路感染、急性扁桃体炎、肠炎、咽喉炎、肺炎、流行性 感冒、小儿手足口病等。
[0033] 本发明提供了一种工艺简单、成本低廉的穿心莲总内酯提取方法。该方法不需要 采用柱层析法对提取物进行纯化，大大降低了成本，且更适于工业化生产。而且该方法不需 用石油醚等溶剂预先除去脂溶性杂质，仅用有机溶剂进行萃取和结晶就可直接获得最终产 品，因而极大的简化了步骤。并且，根据优选方案所用的溶剂，乙酸乙酯，更为环保。采用本 发明的提取工艺，可对穿心莲全草进行提取。虽然穿心莲全草中穿心莲总内酯的含量要低 于穿心莲的叶子，根据产地、批次不同，全草中总内酯含量在约1. 99?4. 41%的范围内波 动（根据广东等五省穿心莲药材中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量比较），但是其价格 低廉，且采用本发明的提取方法在大规模提取中可达到较高的提取率，从而降低了成本。
[0034] 以本发明提取方法获得的提取物中，穿心莲内醋含量最_，占到提取物的40wt% 以上。其他内酯的含量以新穿心莲内酯其次，占到l〇wt%，甚至15wt%以上。再次是脱水 穿心莲内酯，占约7?8wt%左右。因此，本发明中的穿心莲总内酯是指由穿心莲内酯、新穿 心莲内酯和脱水穿心莲内酯组成的内酯；穿心莲总内酯的含量是指穿心莲内酯、新穿心莲 内酯和脱水穿心莲内酯三者的总含量。
[0035] 此外，经进一步研究发现，虽然穿心莲内酯对LPS诱导的巨噬细胞RAW264. 7释放 的NO的抑制效果显著好于脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯，但是本发明的穿心莲总内酯 提取物对NO抑制效果要显著好于任何一种单一成分。这提示穿心莲总内酯中的各成分间 存在协同作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 参照以下附图，将更好地理解本发明的许多方面。
[0037] 图1是显示穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯分别对巨噬细胞释放N0 的抑制作用的浓度vs抑制率曲线图。
[0038] 图2是显示根据本申请实施例1?3的穿心莲总内酯提取物对巨噬细胞释放N0 的抑制作用的浓度vs抑制率曲线图。
【具体实施方式】
[0039] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实 施方式进行详细说明。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的， 并且本发明并不限于这些实施方式。
[0040] 实施例1大规模制备穿心莲总内酯提取物
[0041] 穿心莲药材（购自安徽亳州，爵床科植物穿心莲（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥全草）24. 5kg用10倍量（体积）的95%乙醇回流提取 两次，每次lh，合并提取液，60°C减压浓缩，回收乙醇，得到体积为原提取液10%的浓缩液。 加入980g(以药材重量计4wt% )活性碳，60°C热处理30分钟，趁热抽滤，进一步在60°C下 浓缩至无醇味。向浓缩得到的水溶液中加入12. 25L(以药材重量计500ml/kg)乙酸乙酯， 在60°C下萃取，并在60°C下浓缩至有微量黄色结晶析出，冷却至4°C放置，待晶体完全析出 后抽滤，晾干，得到黄色粉末，即为穿心莲总内酯提取物。
[0042] 实施例2大规模制备穿心莲总内酯提取物
[0043] 穿心莲药材（购自安徽亳州，爵床科植物穿心莲（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥全草）25kg用10倍量（体积）的75%乙醇回流提取3 次，每次3h，合并提取液，60°C减压浓缩，回收乙醇，得到体积为原提取液9 %的浓缩液。加 入750g(以药材重量计3wt% )活性碳，60°C热处理30分钟，趁热抽滤，进一步在60°C下浓 缩至无醇味。将浓缩得到的水溶液，加入25L(以药材重量计1000ml/kg)乙酸乙酯，在60°C 萃取，并在60°C下浓缩至有微量黄色结晶析出，冷却至4°C放置，待晶体完全析出后抽滤， 晾干，得到黄色粉末，即为穿心莲总内酯提取物。
[0044] 实施例3大规模制备穿心莲总内酯提取物
[0045] 穿心莲药材（购自安徽亳州，爵床科植物穿心莲（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥全草）25kg用10倍量（体积）的90%乙醇回流提取1 次，每次2h，合并提取液，60°C减压浓缩，回收乙醇，得到体积为原提取液12%的浓缩液。加 入1500g(以药材重量计6wt% )活性碳，80°C热处理30分钟，趁热抽滤，进一步在60°C下 浓缩至无醇味。将浓缩得到的水溶液，加入18. 75L(以药材重量计750ml/kg)乙酸乙酯，在 60°C萃取，并在70°C下浓缩至有微量黄色结晶析出，冷却至4°C放置，待晶体完全析出后抽 滤，晾干，得到黄色粉末，即为穿心莲总内酯提取物。
[0046] 实施例1?3的提取效率
[0047] 以上实施例1?3的提取效率分别以转移率和得率表示如下表1。
[0048] 其中，转移率和得率的计算公式如下：
【权利要求】
1. 一种提取穿心莲总内酯的方法，包括以下步骤： A. 将干燥的穿心莲全草或茎叶用C1-4低级醇的水溶液浸提，浓缩浸提液，用活性炭热 处理；和 B. 将处理后的浓缩液进一步浓缩至完全除去所述低级醇后加入非极性或弱极性有机 溶剂萃取，取有机相浓缩结晶。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述C1-4低级醇为甲醇或乙醇。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述C1-4低级醇的水溶液的体积百分比浓度 (v/v)为70%以上。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，步骤A中，将干燥的穿心莲全草或茎叶用8?15 倍量的C1-4低级醇的水溶液浸提1?3次。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤A中，减压或常压浓缩所述浸提液至原体积 的1/12?1/8,以获得无沉淀浓缩液，其中浓缩温度为50?80°C。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤A中，所述活性炭的用量以所述干燥的穿心 莲全草或茎叶的重量计为3?8wt% ;且用活性炭热处理的温度为50?80°C。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤B中，所述非极性或弱极性有机溶剂为选自 由乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿所组成组中的一种或多种。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，步骤B中，所述萃取在50?80°C下进行；非极性 或弱极性有机溶剂的用量以所述干燥的穿心莲全草或茎叶的重量计为200?1000ml/kg。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤B中，将所述有机相在50?80°C浓缩为原 体积的3/10?4/5 ;并在10°C以下冷却结晶。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中，包括以下步骤： A. 将干燥的穿心莲全草或茎叶用浓度为90% (v/v)或更高的乙醇水溶液浸提1?3 次，每次〇. 5?1. 5小时，在60°C减压浓缩浸提液至原体积的1/10,用活性炭在60°C热处 理；和 B. 将处理后的浓缩液进一步浓缩至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心莲全草或茎叶 的重量计，以400?750ml/kg的比例加入乙酸乙酯进行萃取，取有机相在60°C下浓缩为原 体积的3/10?4/5,在10°C以下冷却结晶。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中，包括以下步骤： A. 将干燥的穿心莲全草用浓度为95% (v/v)的乙醇水溶液浸提2次，每次0. 5?1. 5 小时，在60°C减压浓缩浸提液至原体积的1/10,用活性炭在60°C热处理，其中活性炭的用 量以所述干燥的穿心莲全草的重量计为4wt% ;和 B. 将处理后的浓缩液进一步浓缩至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心莲全草的重量 计，以500ml/kg的比例加入乙酸乙酯进行萃取，取有机相在60°C下浓缩为原体积的1/2,在 4 °C冷却结晶。
12. -种穿心莲总内酯药物组合物，其中，穿心莲总内酯由穿心莲内酯、脱水穿心莲内 酯和新穿心莲内酯组成，所述穿心莲总内酯的含量占所述组合物总重量的60wt%以上，其 中，所述组合物中穿心莲内酯：脱水穿心莲内酯：新穿心莲内酯的重量比为5?8:1:1? 3〇
13. 根据权利要求12所述的穿心莲总内酯药物组合物，其中，所述组合物中穿心莲内 酯：脱水穿心莲内酯：新穿心莲内酯的重量比为5?7:1:2?3。
14. 一种穿心莲总内酯药物组合物，该药物组合物为根据权利要求1?11中任意一项 所述的提取穿心莲总内酯的方法制备得到的提取物。
15. 根据权利要求12?14中任意一项所述的穿心莲总内酯药物组合物在制备用于治 疗或抑制炎症的药物中的用途。
16. 根据权利要求15所述的用途，其中，所述炎症为细菌性痢疾、尿路感染、急性扁桃 体炎、肠炎、咽喉炎、肺炎、流行性感冒或小儿手足口病。
【文档编号】A61K36/19GK104382968SQ201410583323
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】徐芳芳, 石伟, 张桥, 王振中, 杨华巍 申请人:南京慷睿特医药科技有限公司