非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的方法。该方法选择高脂饲料喂养C3H/HeN小鼠12周，观察小鼠体重、肝重、转氨酶、糖脂代谢指标及肝脏组织学变化，建立非酒精性脂肪性肝病小鼠。再选择10PFU量的鼠肝炎3型病毒(MHV-3)感染小鼠，观察受感染后小鼠的存活率、肝脏组织学及肝内病毒复制，从而建立类似人类疾病过程的非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。该模型的建立为系统研究非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎的病毒动力学、免疫学改变和防治措施提供了有力的工具。
【专利说明】非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学研究领域，涉及一种动物模型的构建方法，特别涉及一种用 于模拟、研究和防治非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎的小鼠模型的构建方法。
【背景技术】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代谢综 合征在肝脏的表现，包括单纯性脂肪肝（simple steatosis),脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH),以及NASH相关的肝纤维化/肝硬化、肝癌。随着生活水平的提 高，NAFLD在发展中国家的发病率显著上升，我国NAFLD发病率在过去的10年增加了近一 倍，部分地区的发病率已达四分之一。我国是肝炎病毒感染的高发地区，约有1亿乙型肝炎 病毒（Hepatitis B virus, HBV)感染者及 4000 万丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV) 感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趋势，NAFLD合并病毒性肝炎是我国面临的一 个新的健康问题。目前，关于NAFLD对病毒性肝炎的病毒动力学、免疫学及肝脏损伤影响机 制仍不明确。
[0003] 对于NAFLD合并病毒性肝炎的人群研究存在很多难点。首先，研究中多用肝脏超 声诊断脂肪肝。肝脏超声检查仅能检出肝内脂肪沉积超过30%的中度脂肪肝，难以检出轻 度脂肪肝（肝脏内脂肪沉积为5% -30% )，因此在分组时，可能将轻度脂肪肝患者作为无脂 肪肝的对照。其次，在研究NAFLD合并慢性乙型肝炎（Chronic h印atitis B，CHB)时，难以 保证受试者在代谢、病毒、治疗等多种因素上的一致性。第三，人群研究难以获取肝组织观 察肝内免疫、代谢等方面的改变。建立可以模拟人类NAFLD合并病毒性肝炎疾病特点的动 物模型，可以克服上述临床研究中的不足。
[0004] 相关的模型建立方法极少，中国科技大学傅苗苗在2009年发表的硕士研究生 学位论文《乙肝病毒转基因小鼠对营养性脂肪肝炎更敏感》中，曾采用胆碱蛋氨酸缺乏 (Methionine-Choline_Deficient，MCD)饮食喂养转有乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的转基因小鼠，建立NASH合并HBsAg表达的小鼠模型。但该模型与非酒精 性脂肪性肝病合并病毒性肝炎患者的临床特点仍存在些许不同。第一，该小鼠模型仅转入 了含有编码HBsAg的基因片段，并不是完整的病毒基因，在体内不能形成完整的病毒颗粒， 不能模拟病毒复制情况；第二，该模型为转基因小鼠，小鼠免疫系统对转入的基因片段所表 达的HBsAg产生耐受，不能产生抗病毒免疫应答；第三，MCD饮食诱导的小鼠模型，只是在肝 脏病理上具有和非酒精性脂肪性肝炎一致的特征，但是模型小鼠会出现体重降低，外周胰 岛素敏感，甚至出现低血糖，与临床患者的代谢情况相反。范建高等（Fatty liver reduces hepatitis B virus replication in a genotype B hepatitis B virus transgenic mice model，Journal of gastroenterology and hepatology，27(2012) 1858 - 1864)使用高脂饮 食喂养HBV转基因小鼠，构建了具有非酒精性脂肪性肝病及HBV病毒表达的小鼠模型。该 动物模型较傅苗苗建立的小鼠模型更接近临床病人表现，但是无法克服转基因小鼠所共有 的缺陷。第一，转基因小鼠对HBV病毒耐受，小鼠免疫系统对HBV病毒不会产生免疫应答， 不能进行免疫学方面的研究；第二，转基因小鼠虽然可以复制并释放HBV颗粒，但是HBV病 毒本身并不能感染小鼠肝细胞，不能模拟病毒感染及复制的完整周期。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有NAFLD合并病毒性肝炎动物模型所存在的不足，提供 一种建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型的方法，用该方法建立的小鼠模型克服了现有 NAFLD合并病毒性肝炎动物模型所存在的不足，模型小鼠构建成本低廉、易于复现、临床症 状明显、具有完整的病毒感染及复制周期，并可以刺激免疫系统产生抗病毒免疫应答，可以 复制出NAFLD合并病毒性肝炎的多种特征且与人类情况类似。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝 炎小鼠模型的建立方法，包括对小鼠依次进行高脂饮食诱导、鼠肝炎病毒感染，构建非酒精 性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模型小鼠。
[0007] 其中，所述小鼠选择C3H/HeN纯系近交小鼠。
[0008] 特别是，所述小鼠选择雌性C3H/HeN纯系近交小鼠。
[0009] 其中，所述C3H/HeN纯系近交小鼠的年龄为6-7周胎龄。
[0010] 特别是，所述小鼠的动物级别为SPF级。
[0011] 尤其是，所述C3H/HeN纯系近交小鼠的体重为15. 8-19. 4g。
[0012] 其中，所述高脂饮食诱导是采用高脂饲料喂养小鼠至少12周，构建非酒精性脂肪 性肝病小鼠。
[0013] 特别是，所述高脂饮食诱导时间优选为12周。
[0014] 特别是，每千克所述1?脂词料含有258g酿蛋白、162g糊精、89g鹿糖、32g ?油、 317g猪油、65g纤维素、58g矿物质、13g维生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸胆碱及0. 069g食 物抗氧化剂。
[0015] 尤其是，将小鼠喂养于无菌过滤空气鼠笼内，控制笼内温度为22°C，相对湿度为 40%，12小时光照/黑暗交替进行，供给双蒸水，小鼠于笼内自由进食；每周更换两次垫料 及饲料。
[0016] 尤其是，喂养过程中每周更换两次垫料及饲料，可防止高脂饲料变质，影响小鼠进 食。
[0017] 其中，所述鼠肝炎病毒感染是对高脂饮食诱导后的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小 鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。
[0018] 特别是，所述鼠肝炎病毒选择鼠肝炎3型病毒。
[0019] 特别是，采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病毒。
[0020] 尤其是，所述腹腔注射是在小鼠中下腹壁行腹腔内注射。
[0021] 其中，所述鼠肝炎病毒的注射量为每只小鼠体内注射至少5PFU(病毒噬斑形成单 位）的鼠肝炎病毒，优选为5-15PFU，进一步优选为10PFU。
[0022] 本发明另一方面提供一种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立 方法，包括如下顺序进行的步骤：
[0023] A)高脂饮食诱导处理
[0024] 在无菌过滤空气鼠笼内，自由摄取食水的条件下，采用高脂饲料喂养小鼠至少12 周，诱导获得非酒精性脂肪性肝病小鼠；
[0025] B)第一次体征监测
[0026] 对高脂饮食诱导处理的小鼠进行体重、体型，肝脏形态、肝脏组织学变化以及血液 中丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰岛素水平及 胰岛素抵抗水平测定；
[0027] C)病毒感染处理
[0028] 将鼠肝炎病毒通过注射的方式注入非酒精性脂肪性肝病小鼠体内，感染小鼠，建 立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型；
[0029] D)第二次体征监测
[0030] 分别于病毒感染第4、8、12、16、20、30天对病毒感染小鼠外周血检测转氨酶，观察 病毒感染小鼠肝脏组织学及肝内病毒复制变化。
[0031] 其中，步骤A)中所述小鼠选择C3H/HeN纯系近交小鼠。
[0032] 特别是，所述小鼠选择雌性C3H/HeN纯系近交小鼠。
[0033] 其中，所述C3H/HeN纯系近交小鼠的年龄为6-7周胎龄。
[0034] 特别是，所述小鼠的动物级别为SPF级。
[0035] 尤其是，所述C3H/HeN纯系近交小鼠的体重为15. 8-19. 4g。
[0036] 特别是，所述高脂饮食诱导时间优选为12周。
[0037] 特别是，每千克所述1?脂词料含有258g酿蛋白、162g糊精、89g鹿糖、32g ?油、 317g猪油、65g纤维素、58g矿物质、13g维生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸胆碱及0. 069g食 物抗氧化剂。
[0038] 尤其是，将小鼠喂养于无菌过滤空气鼠笼内，控制笼内温度为22°C，相对湿度为 40%，12小时光照/黑暗交替进行，供给双蒸水，小鼠于笼内自由进食；每周更换两次垫料 及饲料。
[0039] 尤其是，喂养过程中每周更换两次垫料及饲料，可防止高脂饲料变质，影响小鼠进 食。
[0040] 其中，步骤C)中所述鼠肝炎病毒选择鼠肝炎3型病毒。
[0041] 特别是，采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病毒。
[0042] 尤其是，所述腹腔注射是在小鼠中下腹壁行腹腔内注射。
[0043] 其中，所述鼠肝炎病毒的注射量为每只小鼠体内注射至少5PFU(病毒噬斑形成单 位）的鼠肝炎病毒，优选为5-15PFU，进一步优选为10PFU。
[0044] 本发明方法所建立的模型具有如下优点：
[0045] 1、本发明方法首先采用高脂饮食喂养小鼠制备NAFLD小鼠，然后再采用鼠肝炎3 型病毒感染NAFLD小鼠，避免了因为MHV-3感染后，小鼠肝内免疫微环境的显著改变，导致 在病毒感染后的小鼠的基础上诱导非酒精性脂肪性肝病自然病理过程发生变化，与人类非 酒精性脂肪性肝病病变产生差异；本发明先诱导产生NAFLD再感染MHV-3,才能观察NAFLD 对MHV - 3感染的影响，本发明的模型小鼠的构建方法具有简便易行、成本低廉、可重复性 高、遗传背景清晰、模拟人类代谢综合征和抗病毒免疫应答，以及完整的病毒感染与复制周 期的优点；
[0046] 小鼠感染MHV-3后，小鼠肝内会发生显著的免疫微环境改变，包括：肝内双阴性T 细胞（double negative T cell，DN Treg cell)、CD4+CD25+T 细胞、CD8+PD-1+T 细胞及 CD8+FasL+T 细胞比例增加，肝内 IFN-γ、IFN-β、IL-I β、IL-6、IL-12、IL-4、TNF-α 表达 及含量增加。在这样的基础上诱导NAFLD的形成，会对NAFLD的自然病理过程产生较显著 的影响，例如加快NASH的形成。因此，应当先诱导NAFLD再感染MHV-3,才能观察NAFLD对 MHV-3感染的影响。
[0047] 2、本发明方法选用的C3H/HeN小鼠自由摄取高脂饮食至少12周后，小鼠体形肥 胖、体重增加、转氨酶轻度升高、糖脂代谢异常及肝内脂肪沉积，与人类的NAFLD的各种临 床症状相类似；
[0048] 3、本发明方法所选鼠肝炎3型病毒感染NAFLD C3H/HeN小鼠先患有急性肝炎，约 80%的存活小鼠2周后转为持续性感染，对合并肝炎小鼠的免疫状态及病毒复制情况进行 研究，是探讨NAFLD对病毒性肝炎免疫学影响的有力工具；
[0049] 4、本发明方法建立的小鼠模型重复性好，遗传背景清晰，为系统性、动态性研究 NAFLD对病毒性肝炎的免疫学、病毒学影响提供新的研究思路；
[0050] 5、本发明方法选用的高脂饲料易于获取，鼠肝炎3型病毒易于体内、体外培养，所 建模型成本相对较低，同时也克服了转基因小鼠对病毒耐受，对病毒不产生免疫应答，并缺 乏病毒感染与复制完整周期的局限型。
[0051] 本发明采用免疫力健全的小鼠，成年小鼠感染病毒后产生免疫应答，而转基因小 鼠在胚胎发育阶段，免疫细胞因识别转入的病毒抗原，而产生克隆敲除，不会产生针对病毒 抗原的免疫应答；本发明的模型小鼠在MHV-3感染后，外周血抗检测到MHV3抗体，呈阳性 的，淋巴细胞也出现激活，证明小鼠感染MHV3病毒后产生免疫应答；转基因小鼠虽然是转 入的HBV全部基因组，也能合成完整的病毒颗粒，但是新合成的HBV病毒是不能感染小鼠肝 细胞的（HBV只能感染灵长类动物肝细胞）。故，转基因小鼠缺乏完整的病毒感染过程。一 部分转基因小鼠，甚至只转入部分HBV基因，只能合成一些病毒抗原，连完整的病毒颗粒都 无法合成。因此说转基因小鼠中，缺乏完整的病毒复制周期。而MHV3病毒,是鼠肝炎病毒， 即感染小鼠肝细胞的病毒，并能在小鼠肝细胞中复制。本发明的模型小鼠采用活病毒注入 小鼠体内，并观察到小鼠出现症状、转氨酶升高、甚至死亡，这就是一个感染的过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图1是本发明高脂饮食及正常饮食喂养C3H/HeN小鼠体重变化曲线图；
[0053] 图2是喂养12周后的小鼠外观图，其中A为高脂饮食喂养小鼠外观图，B为正常 饮食喂养小鼠外观图；
[0054] 图3是喂养12周后的小鼠肝脏外观改变图，其中A为正常饮食喂养小鼠肝脏，B为 高脂饮食喂养小鼠肝脏；
[0055] 图4是本发明喂养12周的小鼠肝组织HE染色及油红0染色显微镜观察图，其中 A为正常饮食小鼠肝组织HE染色镜检图；B为正常饮食小鼠肝组织油红0染色镜检图；C为 高脂饮食小鼠肝组织HE染色镜检图；D为高脂饮食小鼠肝组织油红0染色镜检图，箭头所 示为肝细胞内沉积之脂肪滴；
[0056] 图5本发明NAFLD合并病毒性肝炎小鼠生存曲线；
[0057] 图6本发明NAFLD合并病毒性肝炎小鼠肝脏组织学变化镜检图（HEX400)，其中， A为对照组NAFLD小鼠肝脏切片图；B、C、D依次为感染4、8、20天小鼠肝脏切片图；图中▲ 所示为肝细胞肿胀，胞浆疏松，丨所示为肝细胞坏死灶；
[0058] 图7本发明NAFLD合并病毒性肝炎小鼠肝内MHV-3病毒检测凝胶电泳图，其中A 为未感染MHV-3的对照组NAFLD小鼠样本，未见病毒条带；B为MHV-3感染30天小鼠样本， 4只小鼠中有3只小鼠肝内可扩增到病毒条带，条带大小位于100-150bp，与目的片段117bp 吻合。
【具体实施方式】
[0059] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0060] 实施例1
[0061] 1、高脂饮食诱导处理
[0062] 1A)选择6-7周龄SPF级雌性C3H/HeN小鼠125只，予以高脂饲料喂养（简称为高 脂饲料组小鼠），其中，高脂饲料购于南通特洛菲饲料科技有限公司，货号TP23520,每千克 饲料含有258g酪蛋白、162g糊精、89g蔗糖、32g豆油、317g猪油、65g纤维素、58g矿物质、 13g维生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸胆碱及0. 069g食物抗氧化剂；
[0063] 本发明中实验小鼠选择性格温顺的雌性小鼠，既方便饲养又利于试验处理的顺利 进行。
[0064] 1B)另取6-7周龄SPF级雌性C3H/HeN小鼠15只，予以正常饲料喂养（简称正常 对照组小鼠）；
[0065] 1C)每周称取两组小鼠体重，并观察小鼠一般情况，连续喂养12周后高脂饲料组 小鼠体重显著高于正常对照组小鼠的体重，并且高脂饲料组小鼠体型肥胖，皮毛油腻，不喜 活动；小鼠的体重、体型从喂养的第3周开始表现出显著的差异性；2组小鼠的体重测定结 果如图1所示；体型及形态如图2所示。
[0066] 1D)喂养12周后高脂饲料诱导的小鼠构建为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)小鼠， 然后随机取高脂饲料组小鼠15只，及正常对照组15只小鼠，收集外周血检测转氨酶及糖脂 代谢指标，观察肝脏外观及皮下脂肪堆积情况，称取肝脏重量，收集肝组织进行苏木素一伊 红染色和油红〇染色，观察肝脏组织学变化，检测结果如下：
[0067] 肝脏的外观变化如图3所示，其中：正常对照组小鼠的肝脏红润有光泽，边缘锐 利，质韧（图3A);高脂饲料组小鼠的肝脏显著增大、边缘圆钝、色泽红黄、表面光滑、有油腻 感、质地变脆，同时可见内脏及皮下脂肪增多（图3B);
[0068] 肝脏组织学可见肝细胞脂肪变（如图4);
[0069] 肝脏的重量以及血液中丙氨酸转氨酶（ALT)、谷草转氨酶（AST)、空腹血糖、胆固 醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰岛素水平及胰岛素抵抗水平测定结果如表1所示；
[0070] 表1喂养12周后的小鼠肝脏以及血相指标检测结果
[0071]
【权利要求】
1. 一种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特征是包括对小 鼠依次进行高脂饮食诱导、鼠肝炎病毒感染，构建非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模 型小鼠。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征是所述小鼠选择C3H/HeN纯系近交小鼠。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述高脂饮食诱导是采用高脂饲料喂养小 鼠至少12周，构建非酒精性脂肪性肝病小鼠。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒感染是对高脂饮食诱导后 的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒选择鼠肝炎3型病毒。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征是采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病 毒。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒的注射量为每只小鼠体内注射 至少5PFU的鼠肝炎病毒。
8. -种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特征是包括如下 顺序进行的步骤： A) 高脂饮食诱导处理 在无菌过滤空气鼠笼内，自由摄取食水的条件下，采用高脂饲料喂养小鼠至少12周， 诱导获得非酒精性脂肪性肝病小鼠； B) 第一次体征监测 对高脂饮食诱导处理的小鼠进行体重、体型，肝脏形态、肝脏组织学观察以及血液中丙 氨酸转氨酶、谷草转氨酶、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰岛素水平及胰岛 素抵抗水平测定； C) 病毒感染处理 将鼠肝炎病毒通过注射的方式注入非酒精性脂肪性肝病小鼠体内，感染小鼠，建立非 酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型； D) 第二次体征监测 分别于病毒感染第4、8、12、16、20、30天对病毒感染小鼠外周血检测转氨酶，观察病毒 感染小鼠肝脏组织学及肝内病毒复制变化。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征是步骤A)中所述小鼠选择C3H/HeN纯系近交小 鼠；步骤C)中所述鼠肝炎病毒选择鼠肝炎3型病毒。
10. -种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模型小鼠，其特征是按照如权利要求 1-9任一所述方法构建而成。
【文档编号】A61K35/76GK104365543SQ201410588721
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】宁琴, 罗小平, 习东, 吴婷, 王宏武, 王晓晶, 严伟明 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院