人bace1基因转录启动子及其主要顺式作用元件及应用的制作方法

人bace1基因转录启动子及其主要顺式作用元件及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种人BACE1基因转录启动子及其核心启动区域和顺式作用元件。本发明首次确定了决定人BACE1基因高水平转录的最小启动子区域和决定基础转录的核心启动子区域，并确定了具有增强基因转录的两个顺式作用元件，揭示了对于BACE1基因的转录起着关键作用的BACE1基因启动子核心区域的结构，更加深入的理解了BACE1基因的转录调控机制和基于上述发现的干扰BACE1基因的转录和表达。并为预防、诊断、治疗AD及其它疾病提供了有效的作用靶点。
【专利说明】人BACE1基因转录启动子及其主要顺式作用元件及应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人基因的启动子及其主要顺式作用元件，尤其涉及人的BACEl基 因的的表达和调控。

【背景技术】
[0002] BACEl基因编码β位淀粉样前体蛋白剪切酶（BACE1，别名Asp2或memapsin2)，是 一个具有501个氨基酸的跨膜天冬氨酸蛋白酶。BACEl是人体内唯一的的β分泌酶，通过 剪切淀粉样前体蛋白（ΑβΡΡ或ΑΡΡ)生成β淀粉样蛋白（amyloid β peptide, Αβ)，这 是Αβ生成的一个限速步骤。在阿尔茨海默氏病（AD)患者脑中，Αβ是一种重要的病理表 现-淀粉样神经炎性斑块的主要成分，Αβ沉积在AD的发生发展中起着关键的作用。通过 抑制BACEl的活性来降低A β的生成成为防治AD药物研发的靶点。
[0003] 人BACEl基因具有9个外显子，全长30. 6kb，位于染色体llq23. 2_llq23. 3。其 真正的翻译起始位点ATG位于第一个外显子。BACEl的mRNA的分布具有种属和组织特异 性，人类神经组织表达水平远远高于除了胰腺之外的其他外周组织。BACEl基因的表达在 转录水平被严格的调控。BACEl基因位于转录起始位点（transcriptional start site, TSS)上游I. 5kb的启动子区域缺乏经典的CAAT和TATA盒等顺式作用元件。其启动子区 和5'非翻译区含有多个潜在的转录因子结合位点。很多因子已经被证实可以在转录水平 调控BACEl的表达，特殊蛋白（specificity protein 1，Spl)是首个被证实的上调人BACEl 基因表达的转录因子。有研究报道Spl作用的发挥有赖于2/15脂氧合酶的激活。低氧诱 导因子（Hypoxia inducible factor 1，HIF-1)通过与位于BACEl基因启动子区域的低氧 反应元件（hypoxia responsive element, HRE)作用而引起低氧诱导的BACEl转录上调。 信号传感器和转录激活因子 I (Signal transducer and activator of transcription 1， STAT1)是BACEl在神经细胞持续表达所必需的，在星形胶质细胞中的表达则有赖于Y干扰 素（interferonY，IFNY)的诱导。转录因子YYl(Transcriptional factor Yin Yang，YYl) 和激活T细胞的核转录因子（nuclear factor of activated T-cells 1，NFAT1)也被证实 可以上调BACEl的转录。除了上述激活转录的因子外，也有好多被证实会下调BACEl转录 的因子。在鼠BACEl的ATG上游106-97,209-200有两个GATA-I就发挥着下调作用。过氧 化物酶体增殖物激活因子（peroxisome proliferator-activated receptor-PPARy) 可以与鼠BA CEl基因启动子区域的PPARy反应元件结合而发挥下调BACEl表达。炎性因 子通过降低PPARy的水平而激活BACEl启动子。在BACEl的启动子区域还发现了核转录 因子kappaB (Nuclear factor κ B, NF-κ B)的结合位点。研究表明这一因子会因细胞类型， 状态不同而发挥不同的调控作用。在生理状态，神经元以及未激活的星形胶质细胞NF-κ B 可以抑制BACEl的转录，而当在Αβ过量沉积以及激活的星形胶质细胞中NF-κ B则会激 活BACEl的转录。上述众多转录因子结合的顺式作用元件都位于距离转录起始位点较远的 上游位置和发挥对转录的调节作用，而与这些顺式作用元件相结合而发挥转录调控作用的 转录因子是依赖于与通用转录因子的相互作用而发挥作用的，目前对于BACEl基因与通用 转录因子相互作用和位于转录起始位点附近的核心启动子区域的研究还甚少，而近几年的 研究表明通用转录因子并不仅仅与基因的基础表达相关，也与基因在时空的特异性表达相 关。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供人BACEl基因转录启动子及其核心启动子、顺式作用元 件。
[0005] 本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0006] 一种人BACEl基因转录启动子，其特征在于：具有：（a) SEQ ID NO. 1和/或SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列；或（b) SEQ ID NO. 1和/或SEQ ID NO. 2所示核苷酸的互补序列；（c) SEQ ID NO. 1和/或SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列或其互补序列经取代、缺失和/或添加 一个或几个核苷酸且等功能的由（a)或（b)衍生的核苷酸序列。本发明确定了在BACEl基 因转录中起关键作用的顺式作用元件，SEQ ID NO. 2区域的很多碱基的单碱基突变会引起 启动子活性下降70%，而SEQ ID NO. 1的单碱基突变则仅引起约50%的降低，优选地，SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 2具有协同增效作用。
[0007] 上述人BACEl基因转录启动子，所述SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 2之间具有特定 的位置关系，即SEQ ID NO. 1的3'端位于SEQ ID NO. 2的5'端上游39-79个核苷酸的位 置，优选为58个核苷酸。SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 2之间的间隔位置在此范围仍能保持 顺式作用元件对BACEl基因转录的协同增强作用。SEQ ID NO. 1反向插入会降低两个顺式 作用元件对BACEl基因转录作用。SEQ ID NO. 1是一个近端活化因子，其依赖BACEl启动 因转录的协同增强作用。SEQ ID NO. 1置于其它基因的启动子之前无增强转录的子核心区 域，且具有方向性和空间依赖性。
[0008] 上述人BACEl基因转录启动子，具有（d) SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列；或（e) SEQ ID NO. 3所示核苷酸的互补序列；（f) SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列或其互补序列经取代、缺 失和/或添加一个或几个核苷酸且等功能的由（d)或（e)衍生的核苷酸序列。SEQ ID NO. 3 为起始BACEl基因基础转录的最短序列区域，是人BACEl基因核心启动子。
[0009] 上述人BACEl基因转录启动子，具有（g) SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列；或（h) SEQ ID NO. 4所示核苷酸的互补序列；（i) SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列或其互补序列经取代、缺 失和/或添加一个或几个核苷酸且等功能的由（g)或（i)衍生的核苷酸序列。SEQ ID NO. 4 为起始BACEl基因高水平转录的序列区域。
[0010] 针对上述启动子和/或顺式作用元件的干扰因子。所述干扰因子可通过干扰或竞 争抑制等方式降低或阻断启动子的表达，从而影响该启动子下游基因的转录，是针对上述 启动子和/或顺式作用元件所设计的DNA短片段或反义核酸序列以及蛋白质和多肽等。
[0011] 包含上述启动子的基因表达载体。
[0012] 包含上述启动子或上述载体的遗传工程菌。
[0013] 上述启动子作为药物有效作用靶点筛选预防、诊断或治疗阿尔茨海默氏病药物中 的用途。
[0014] 本发明探索到人的BACEl基因转录起始点及上游调控区，对具有启动子活性的基 因组区段进行分析，得到一个具有强启动子活性的区域，它驱动了 BACEl基因的表达。进 一步研究得到，调控BACEl基因高水平转录最小的启动子区域位于翻译起始位点（ATGiA 作为+1)上游的-583?-480bp区间的104bp(SEQ ID NO. 4)调控BACEl基因基础水平转 录最小的核心启动子区域位于翻译起始位点（ATG之A作为+1)上游的-550?-480bp区 间的7ibp(SEQ ID NO. 3)。并进一步确定了在BACEl基因转录中起关键作用的两个顺式作 用元件，分别位于翻译起始位点-583?-573bp区间的Iibp DNA序列（SEQ ID NO. 1)和上 游-515?-509bp区间的7bp DNA序列（SEQ ID NO. 2)，比较这两个元件对于启动子活性的 影响发现，SEQ ID NO. 2区域的很多碱基突变会引起启动子活性下降70%，而SEQ ID NO. 1 则仅引起约50%的降低，SEQ ID NO. 2在调控BACEl转录方面具有更强的作用。进一步证 明SEQ ID NO. 1是一个近端活化因子，它不仅仅依赖BACEl启动子核心区域，而且具有方向 性和空间依赖性。
[0015]有益效果
[0016]本发明首次确定了决定人BACEl基因高水平转录的最小启动子区域和决定基础 转录的核心启动子区域，并确定了具有增强基因转录的两个顺式作用元件，揭示了对于 BACEl基因的转录起着关键作用的BACEl基因启动子核心区域的结构，更加深入的理解了 BACEl基因的转录调控机制和基于上述发现的干扰BACEl基因的转录和表达，并为预防、诊 断、治疗AD及其它疾病提供了有效的作用靶点。

【专利附图】

【附图说明】
[0017]图 I (a)人 BACEl 的 ATG 上游-1273/-400 序列。（b)p3BU-1273/400B 启动子-荧 光素酶报告基因载体图谱。
[0018] 图2构建删切质粒分析人BACEl基因的启动子区域的边界。（a) (c)为删切质粒示 意图。其中直线表示人BACEl基因的启动子区域，水平箭头表示转录方向，垂直箭头所指为 BACEl基因转录起始位点，LUC表示荧光素酶报告基因编码序列，数字表示以BACEl基因翻 译起始位点A为+1的上游序列。（b) (d) (e) (f)HEK293细胞瞬时共转染BACEl基因的启动 子区域删切质粒和海肾荧光素酶质粒，以空载体pGL3basic作为对照，培养24小时后双荧 光素酶活性测定结果。
[0019] 图3确定顺式作用元件区域。（a) (c) (e)分别以p3BU-583/-400或p3BU-1149/-400 为模板，构建人BACEl基因启动子区的突变质粒。其中直线表示人BACEl基因的启动子区 域，水平箭头表示转录方向，垂直箭头所指为BACEl基因转录起始位点，圆内字母表示突变 碱基。（b) (d) (f)HEK293细胞瞬时共转染BACEl基因的启动子区域突变质粒和海肾荧光素 酶质粒，以空载体pGL3basic作为对照，培养24小时后双荧光素酶活性测定结果。（g)-578G 和-510A周围的碱基突变位置。
[0020] 图4两个顺式作用区域对BACE1基因转录具有协同作用。（a) (c)分别以 P3BU-583/-400或p3BU-1149/-400为模板，构建人BACEl基因启动子区的双突变质粒。其 中直线表示人BACEl基因的启动子区域，水平箭头表示转录方向，垂直箭头所指为BACEl基 因转录起始位点，圆内字母表示突变碱基。（b) (d)HEK293细胞瞬时共转染BACEl基因的启 动子区域双突变质粒和海肾荧光素酶质粒，以空载体pGL3basic作为对照，培养24小时后 双荧光素酶活性测定结果。（e)HEK293细胞瞬时转染绿色荧光蛋白报告基因，培养24小时 后40倍显微镜下荧光结果。
[0021] 图5确定BACEl基因中两个顺式作用元件的碱基构成。（a) (C) HEK293细胞瞬时共 转染BACEl基因的启动子区域突变质粒和海肾荧光素酶质粒，以空载体pGL3basic作为对 照，培养24小时后双荧光素酶活性测定结果。（b) (d)以质粒p3BU-1149/-400为模板，分别 对-584/572和-515/-505区域的碱基依次替换为其他三种碱基。
[0022] 图6 TCEl是一个高度保守的近端激活区域。（a)BACEl-583/-480在不同物种中 的保守性分析，红色框标注代表高度保守的序列。（b)(d)(f)图示为所构建质粒。其中LUC 和黑色箭头表示荧光素酶报告基因的编码序列及转录方向；直线表示报告载体中荧光素酶 基因的上游片段；虚线表示缺失片段；短箭头表示插入的DNA模块。（c) (e) (g)HEK293细胞 瞬时转染报告基因载体后荧光素酶活性比较。

【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如 Sambroom 等人，分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所有实验数据均采用GraphPad Prism5软件（GraphPad Software, USA)进行统计分析，所有数据采用J±SD表示；采用方 差分析AN0VA，显著性水平p = 0. 05。
[0024] 实施例
[0025] 1.材料与方法
[0026] I. 1查询GenBank数据库及文献，确定BACEl基因的启动子区域。
[0027] 1. 2删切质粒构建
[0028] BACEl启动子荧光素酶报告基因p3BU-1273/-400包含着BACEl基因翻译起始 位点上游-1273到-400的序列，用PCR的方法扩增目的片段，命名为B1U-1273/-400或 B1U1273_400(以下命名均同此法，B1U-1273/-400表示BACEl基因翻译起始位点上游第 1273位核苷酸到第400位核苷酸的序列），引物为B1U1273F/B1U400R(见表1)，模板为细菌 人工染色体DNA (RP11-970G21)(来自于BAC DNA文库）。采用TAKARA公司LA TAQ酶进行 扩增，反应程序为初始变性95°C，30s，然后按98°C 30s，68 °C 2min运行30个循环，72°C延伸 10min。目的片段B1U1273-400用胶回收试剂盒（AXYGEN)进行回收，经过Xhol/Hindlll双 酶切后插入到空载体pGL3_Basic (Promega)的Xhol/Hindlll之间，转化大肠杆菌DH5 α，并 对重组质粒进行测序鉴定（Invitrogen公司）。
[0029] 又以质粒P3BU-1273/-400 (表示含有BACEl基因翻译起始位点上游-1273 到-400的序列，即-1273/-400片段的p3BU质粒，以下质粒命名同此法）为模板， 设计一系列删切引物（表1)，按照上述实验方法构建了如下质粒P3BU-1149/-400， P3BU-919/-400, p3BU-800/-400, p3BU-700/-400, p3BU-583/-400, p3BU-574/-400， P3BU-560/-400, p3BU-540/-400, p3BU-520/-400, p3BU-500/-400, p3BU-583/400M580T， P3BU-583/400M578A，p3BU-583/400M580T578A。所用正向引物分别为 B1U1149F，B1U919F， B1U800F, B1U700F, B1U583F, B1U574F, B1U560F, B1U540F, B1U520F, B1U500F, B1U583T580F, B1U583A578F，B1U583T580A578F，反向共用引物B1U400R，将目的片段插入到空载体 pGL3-Basic 的 Xhol/Hindlll 之间。
[0030]质粒 p3BU-583/-420, p3BU-583/-440, p3BU-583/-460, p3BU-583/-480， P3BU-583/-500, p3BU-583/-510的构建以质粒p3BU-1149/-400为模板，共用正向引物 B1U583F，以如下反向引物B1U420R，B1U440R，B1U460R，B1U480R。将目的片段插入到空载体 pGL3-Basic 的 Xhol/Hindlll 之间。
[0031] P3BU-583/-500 和 P3BU-583/-510 以 p3BU-583/-480 为模板，共用 p3BasicPF分别以B1U500PR，B1U510PR为反向引物扩增整个质粒，然后自连。同理 P3BU-570/-480, P3BU-560/-480, P3BU-550/-480, P3BU-540/-480, P3BU-530/-480， P3BU-520/-480, P3BU-510/-480 以 p3BU-583/-480 为模板，分别以 B1U570PF，B1U560PF， B1U-550PF，B1U-540PF，B1U530PF，B1U520PF，B1U510PF 为正向引物，共用反向引 物 p3BasicPR。 P3BU-583/-400M510C 和 P3BU-583/-400M482A，以 p3BU_583/-400 为 模板，以如下引物B1U482TF，B1U510CMR，B1U482AMF，B1U510AR扩增质粒后自连而得 至lj。P3BU-583/-400M578A510C，P3BU-583/-400M578A482A 以 p3BU-583/-400M510C 或 P3BU-583/-400M482A 为模板，BlU583CAf，p3BasicPR 为引物。P3BU-1149/-400M578A， P3BU-1149/-400M510C 和 P3BU-1149/-400M482A 以 p3BU-1149/-400 为模板， B1U583A578/B1U584R， B1U482TF/B1U510CMR， B1U482AMF/B1U510AR 为引物扩增质粒 自连而来。P3BU-1149/-400M578x， P3BU-1149/-400M578y， P3BU-1149/-400M578z， P3BU-1149/-400M510x， P3BU-1149/-400M510y， P3BU-1149/-400M510z，均以 P3BU-1149/-400 为模板，用如下引物 BlU583PfMx/BlU584R，BlU583PfMy/BlU584R， BlU583PfMz/BlU584R, BlU482TF/BlU510PrMx, BlU482TF/BlU510PrMy, B1U482TF/ BlU510PrMz扩增质粒自连而来。
[0032] P3BU-1149/-400M578A510C，P3BU-1149/-400M578A482A 以 P3BU-1149/-400M510C 或 p3BU-1149/-400M482A 为模板，以 BlU583CAf/BlU584R 为引 物扩增质粒自连而来。pGL3basic-EGFP， pGL3promoter-EGFP， p3BU-1149/400EGFP 和P3BU-1149/400M578A510CEGFP，均是将EGFP片段插入到相应的质粒pGL3-Basic， pGL3-Promoter， p3BU-1149/400 和 p3BU-1149/400M578A510C 中的 Hindlll/Xbal 之间 以替代原有的荧光素酶报告基因。EGFP片段以质粒EGFP-N2为模板，以EGFP-F/R为 引物。P3BU-1149/-400M550-551R， p3BU-1149/-400M550-551D 分别以 B1UR570-535PF/ B1UR551-586PR，B1U550PF/B1U571PR 为引物，P3BU-1149/-400 为模板，扩增质粒自连而来。 其余单突变质粒均以相应的质粒为模板，以含突变位点的引物扩增相应的质粒而来。所有 质粒都经过测序鉴定。
[0033] 1. 3细胞培养和转染
[0034] HEK293细胞用常规方法培养，完全培养基由Gibco公司的DMEM basic (Dulbecco' s modified Eagle medium)和 Hyclone 的 FBS(fetal bovine serum)配 制,均置于细胞培养间的C02培养箱（Thermo scientific，F0RMA3111)，37°C，5% C02,相对 湿度控制在95%以上，细胞培养箱中培养。
[0035] 按上述细胞计数方法将细胞按3. 5 X IO5个/ml，200 μ L/孔接种至48孔板。待细胞 融合度约为70%时进行转染。（1)用Nanodrop2000测定质粒浓度并均稀释至lOOng/μ 1，将 内参质粒P3PRluc稀释为20ng/ μ 1。用购于Invitrogen的转染试剂Lipofectamine2000， 按说明书进行转染。（2)用Opti-MEM配置含0. 3 μ g质粒（0. 27 μ g目的质粒+0. 03 μ g内 参质粒P3PRluc)的混合液。即每管配置15. 8 μ I Opti-MEM+2. 7 μ 1目的质粒+0. 15 μ I P3PRluc。（3)用 Opti-MEM配制转染试剂，S卩每管 19. 1 μ I Opti-MEM+O. 9μ I Lipo2000。室 温静置5min。（4)将（2)，（3)中的两管液体共40 μ I混合均匀后，室温静置20min后，逐滴 缓慢加入到48孔板各细胞中，缓慢摇晃使其均匀。将细胞放回37°C CO2培养箱中继续培养 24h。
[0036] L 4荧光素酶活性测定
[0037] 转染细胞24h后用真空泵吸去培养基后，用Promega公司的Passive lysis buffer 60μ1裂解细胞，室温摇床上40r/min放置30min。取2μ1细胞裂解液加入 10μ1 luciferase assay reagent,置于单管发光仪检测萤火虫突光素酶（Firefly luciferase-FLUC)，待反应完后再加入10μ1 Stop & Glo reagent检测海肾突光素酶 (Renila Iuciferase-RLUC)。二者比值反映启动子荧光素酶活性。
[0038] 2.结果分析
[0039] 2· 1-550/-480是BACEl基因核心启动子
[0040]我们前期研究发现BACEl基因翻译起始位点（ATG作为+1)上游1311-400具有 明显的启动子活性。为了确定该基因的启动子具有高水平转录活性的最小区域，我们首 先克隆了含有BACEl启动子区域的萤火虫荧光素酶报告基因p3BU-1273/-400,即将BACEl 基因ATG上游的1273-400的序列（图a)克隆到pGL3-basic空载体中（图Ib)。插入的 片段与全基因组序列比对显示插入的为人11号染色体117187784-117186911 (GRCh37/ hgl9)，其中有一个在我们的序列中为G，比对后发现该位点为单核苷酸基因多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP)位点 rs536817(chrll :117187441),空载体 pGL3_basic 缺乏真核生物的启动子和增强子序列，因此转染后的荧光素酶的表达和活性取决于插入片 段是否具有启动子的功能。
[0041] 为了确定具有启动子活性的最小区域的5'端边界，通过删切构建了一系列 含不同启动子区域的荧光素酶报告基因（图2a)，并转染HEK293细胞。测定结果显示 P3BU-1273/-400, p3BU-1149/-400, p3BU-919/-400, p3BU-800/-400, p3BU-700/-400， P3BU-583/-400在HEK293中具有相同的启动子活性，明显高于阴性对照（图2b)。
[0042] 将P3BU-583/-400进一步删切得到p3BU-500/-400则荧光素酶活性明显降低。 这说明P3BU-583/-400插入的这184bp包含着BACEl的启动子功能区域。-583/-501这 83bp含有影响人BACEl启动子功能的重要元件。为了进一步缩小该区域，又删掉了 10个 碱基，得到P3BU-574/-400,其活性明显降低，但仍略高于阴性对照。进一步删切14个碱基 得到P3BU-560/-400,发现其活性与p3BU-574/-400相当。然而继续删切20个碱基后得到 P3BU-540/-400,荧光素酶活性明显降低，几乎与阴性对照pGL3basic-样（图2c，2d)，这些 结果显示-583/-574和-560/-540可能含有重要的启动子功能区域。
[0043] 因为-583/-400具有明显的启动子活性，进一步5'删切会引起活性明显减低。因 此以P3BU-583/-400为模板从3'删切构建质粒并转染HEK293来研究最小启动子区域的3' 端边界。依次删切20个碱基后分别得到p3BU-583/-420和p3BU-583/-440,发现活性并没 有明显改变。进一步删切得到P3BU-583/-460,荧光素酶活性则明显降低，然而再删切20个 碱基得到P3BU-583/-480,活性反而升高约相当于p3BU-583/-400的活性。继续删切20个 碱基得到P3BU-583/-500,活性又明显降低。再删切10个碱基得到p3BU-583/-510,荧光素 酶活性继续降低约与pGL3basic差不多（图2e)。综上可知-480有可能是启动子最小区域 的3'端，-510/-480是BACEl基因启动子的重要功能区域。
[0044] 为了验证在其他的5'删切质粒中-480是否都是启动子发挥活性所需要的最小区 域的3'端，又构建了一系列质粒并转染HEK293细胞。荧光素酶活性测定结果显示，以-480 结尾的一系列质粒跟以-400结尾的整体趋势一致。p3BU-583/-480插入片段从5'端删切14 个碱基得到P3BU-570/-480,活性则明显降低，再继续删切10个碱基得到p3BU-560/-480， P3BU-550/-480三者活性相当。继续删切得到p3BU-540/-480活性又明显降低。这些结果 显示-550/-480这71个碱基仍具有较强的启动子活性。将-583/-480反向插入得到质粒 P3BU-583/-480R则不具有启动子活性（图2f)。综上，-583/-480这104个碱基是细胞内 BACEl高表达所必需的。而-550/-480这71个碱基就是BACEl基因的核心启动子区域。
[0045] 2. 2-583/-574和-510/-480是BACEl基因转录调控的重要DNA区域
[0046] 以上的结果显示：在BACEl最小的启动子区域有一些对BACEl基因转录很重要的 亚区域，主要集中在-583/-574和-510/-480这两个区域。为了进一步探讨这些区域是否 有功能，我们以P3BU-583/-400为模板来构建含有不同单核苷酸突变体的BACEl基因启动 子-荧光素酶报告基因载体，并转染HEK293细胞。荧光素酶活性的测定结果显示-580C/ T(-580位C突变成T)的荧光素酶活性与p3BU-583/-400相比无明显变化，578G/A、510A/C 和482T/A的荧光素酶活性则不同程度的降低（图3a，3b)。
[0047]由于在质粒 p3BU583-400B580T 和 p3BU583-400B578A 的载体序列中，-580 和-578 位点非常接近侧翼区，因此为了排除侧翼区载体序列对插入片段可能的影响和进一步确定 突变的影响，以5'端更长的质粒p3BU-1149/-400为模板，构建含上述突变位点的质粒（图 3c)。荧光素酶活性测定结果显示：在HEK293细胞中，-580位A突变成T后，荧光素酶活性不 仅没有降低，P3BU-1149/-400B580T的活性反而显著增加（图3d)。但是，与p3BU-l 149/-400 的荧光素酶活性相比，-578位点G突变成A(578G/A)，-510位点A突变成C(510A/C)的活 性则明显降低。
[0048] 为了确定-578和-510附近是否有顺式作用元件区域，我们决定研究-578G 和-510A周围的碱基的影响。如图3e，3g所示，构建了一系列突变质粒。荧光素酶活性测 定结果显示（3f)，-578G和-510A周围的6个位点的突变都会导致p3BU-l 149/-400的荧光 素酶活性明显降低，由此推测在-578G和-510A附近各存在一个功能性的顺式作用元件区 域。
[0049] 2. 3两个顺式作用元件在影响BACEl启动子活性方面具有协同作用
[0050] 为了研究各顺式作用元件在影响BACEl启动子活性方面是否具有协同作用， 以P3BU-583/-400为模板构建了一系列含复合突变位点的质粒并转染HEK293细胞。双 突变质粒578G/A和580C/T (p3BU-583/-400B580T578A)与之前的单突变质粒578G/ A(p3BU-583/-400B578A)或 580C/T(p3BU-583/-400B580T)相比，双突变质粒 578G/ A和580C/T (p3BU-583/-400B580T578A)的荧光素酶活性与单突变578G/A相当，提示 580C/T单突变对p3BU-583/-400B578A而言没影响。然而双突变-578G/A和-510A/ C(p3BU-583/-400B578A510C)则明显降低荧光素酶活性，p3BU-583/-400B578A510C 的活性 仅为P3BU-583/-400的I. 15±0. 26%，双突变比其中任何一个单突变的活性都低。双突变 质粒 578G/A 和 482T/A(p3BU-583/-400B578A482A)与单突变 578G/A 活性相当，说明 482T/ A没有作用。双突变质粒510A/C和482T/A(p3BU-583/-400B510C482A)也说明482T/A对于 BACEl基因的转录没有作用（图4a，4b)。
[0051] 为了排除侧翼区载体序列对插入片段可能的影响，比较以更长的 质粒P3BU-1149/-400为模板得到的相应质粒，双突变质粒578G/A和510A/ C(p3BU-1149/-400B578A510C)与各自的单突变 578G/A(p3BU-1149/-400B578A)或 510A/ C(p3BU-1149/-400B510C)相比，活性均明显低于单突变（图4c，4d)。
[0052] 荧光素酶报告基因的优势在于它比较敏感，然而有时也可能放大样本之间的差 异。为了进一步证实-578G/A和-510A/C双突变的作用，构建了四个含绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，EGFP)报告基因载体，即将EGFP代替荧光素酶报告基因 插入到 pGL3basic，pGL3promoter，p3BU-1149/-400 和 p3BU-1149/-400B578A510C。空 对照pGL3basic-EGFP转染HEK29324小时后未见荧光，阳性对照pGL3promoter-EGFP， 含有一个强启动子序列SV40,转染24小时后可见较强的绿色荧光（图4e)。 p3BU-l 149/-400B-EGFP较pGL3basic-EGFP也出现了较强的绿色荧光，跟预期的一样， P3BU-1149/-400B578A510C-EGFP 相比 p3BU-1149/-400B-EGFP 荧光则弱 了很多（图 4e)。 这些结果提示双突变578G/A和510A在影响BACEl基因启动子活性方面具有协同作用。而 且双突变P3BU-1149/-400B578A510C的活性甚至低于阴性对照pGL3basic的。由此推测位 于-578G，-510A附近的顺式作用元件在控制BACEl基因转录中起着至关重要的作用。
[0053] 2. 4确定两个顺式作用元件的碱基构成
[0054] 以-578G或-510A为中心，将其周围的碱基依次替换为其他三种碱基，将构建的质 粒转染细胞后测定荧光素酶发现-578G所在的功能区域有可能是-583/-573,因为这区间 大部分碱基替换后P3BU-1149/-400B的启动子活性都降低（图5a，5c)。因此-583/-573 包含着一个顺式作用元件功能区域，序列CGGCAGAGGGC被命名为BACE1转录关键元件 I (Transcription Critical Elementl，TCEl)，该元件可能与某未知的转录因子相互作 用。-584T替换为A或G时，活性基本没变化，但当-584T替换为C同时-572A替换为G时， 启动子活性反而升高。-580C变为T也会使启动子活性明显增高。这说明野生型的序列有 可能不是TCEl结合的最佳序列。同样的，-510A所在的功能区域有可能是-515/-509,因 为这之间每一个突变都会明显降低启动子活性（图5b，5d)。而-516C，-508C到-505突变 为其他碱基，则没有太大影响。因此-515/-509包含着另一个顺式作用元件功能区域，序列 TTCCCAG 被命名为 BACE 1 转录关键元件 2 (Transcription Critical Element2，TCE2)。比 较这两个元件对于启动子活性的影响发现，TCE2区域的很多单个碱基突变会引起启动子活 性下降70%，而TCEl则仅引起约50%的降低，这说明TCE2在调控BACEl转录方面可能具 有更强的作用。
[0055] 2.5 TCEl是一个高度保守的近端激活因子
[0056] 利用在线数据库http ://genome. ucsc. edu/，我们分析了 100个脊椎物种 的-583/-480这一序列。确定了三个高度保守的区域，-583/-570(117187094-117187081, CGGCAGAGGGCATCC)， -551/-544(117187062-117187055, CCGGAAGC)以及-528/-509(11 7187039-117187020GGGAAGACTACACTTCCCAG)。对人，狒狒，小鼠，大鼠，大象进行碱基比 对分析，发现-583/-569, -551/-544和-528/-509是完全一致的。尽管在100个物种 中-582(117187093)和-577(117187088)在-583/-569 不是完全保守的（图 6a)。这些 查询结果与实验数据是一致的，即-583/-570是BACEl转录的关键区域，删切掉该区域和 P3BU-583/-480以及p3BU-570/-480相比会引起荧光素酶活性的明显降低。p3BU-570/-480 进一步删切20个碱基得到p3BU-550/-480对于荧光素酶活性则没有影响。在五个物种 中-570/-550并非高度保守区域，这提示-570/-550在BACEl转录中可能不起作用。
[0057] RNA聚合酶II核心启动子通常定义为能够起始基因转录的最小的DNA序列。因 为-550/-480仍然具有很高的荧光素酶活性，进一步删切掉10个碱基则没有活性，这提示 这一区域可能是决定BACEl的基础转录的核心启动子区域。核心区域上游的TCEl极可能 是一个近端激活因子或是增强子。因为增强子作用的发挥没有方向性，而且位置也没有要 求。为了验证反向是否发挥作用，以及是否作用于其他基因的启动子，我们构建了报告基 因 P3BU-1149/-400TCE1R 和 pGL3p-TCEl。p3BU-1149/-400 中 TCEl 替换为其反向互补序 列（CGGCAGAGGGC 变为 GCCCTCTGCCG)从而得到 p3BU-1149/-400TCElR(图 6b)，将 TCEl 序 列插入到pGL3_Promoter (Promega)中的启动子SV40前得到质粒pGL3p_TCEl (图6b)。转 染细胞后荧光素酶活性测定结果显示P3BU-1149/-400TCE1R低于p3BU-1149/-400的50% (P3BU-1149/-400TCE1R 36. 09±5· 47vs p3BU-1149/-40099. 98±1· 12, p < 0· 05)这提示 TCEl具有方向性（图6c)。然而将TCEl插入到缺乏增强子的pGL3Promoter的启动子SV40 前面，对于荧光素酶活性没有影响，这说明TCEl功能的发挥有赖于BACEl的核心启动子区 域（图 6d，6e)。
[0058] 在某些情况下，两个顺式作用元件之间的间隔距离会对基因转录起着重要作 用。5'端删切实验从-570删切到-551对于BACEl的基本转录没影响。因此我们以 P3BU-1149/-400为模板构建了 -570到-551反向突变或缺失突变的质粒（图6f)，用来研 究删切或突变-570到-551是否影响TCEl和TCE2或TCEl和启动子核心区域的相互作用。 转染HEK293细胞后测定荧光素酶活性发现反向突变后没影响，缺失突变则会使启动子活 性明显降低（图6g)。这一结果提示TCEl与核心启动子之间间隔的碱基个数而不是碱基的 种类对基因的转录有重要作用。综上所述，TCEl是一个近端活化因子不仅仅依赖BACEl启 动子核心区域，而且还具有方向性和空间依赖性。
[0059] 表1实施例中的PCR引物
[0060]

【权利要求】
1. 一种人BACE1基因转录启动子，其特征在于：具有：（a) SEQ ID NO. 1和/或SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列；或（b) SEQ ID NO. 1和/或SEQ ID NO. 2所示核苷酸的互补序列； (c) SEQ ID NO. 1和/或SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列或其互补序列经取代、缺失和/或 添加一个或几个核苷酸且等功能的由（a)或（b)衍生的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述的人BACE1基因转录启动子，所述SEQ ID NO. 1的3'端位于SEQ ID NO. 2的5'端上游39-79个核苷酸的位置，优选为58个核苷酸。
3. 如权利要求1所述的人BACE1基因转录启动子，具有（d) SEQ ID NO. 3所示核苷酸 序列；或（e) SEQ ID NO. 3所示核苷酸的互补序列；（f) SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列或其 互补序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且等功能的由（d)或（e)衍生的核苷 酸序列。
4. 如权利要求1所述的人8八0￡1基因转录启动子，具有&)5￡〇10勵.4所示核苷酸 序列；或（h) SEQ ID NO. 4所示核苷酸的互补序列；（i)SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列或其 互补序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且等功能的由（g)或（i)衍生的核苷 酸序列。
5. 如权利要求1-4所述的人BACE1基因转录启动子的干扰因子。
6. 包含权利要求1-4所述启动子的载体，或包含权利要求5所述干扰因子的载体。
7. 包含权利要求1-4所述启动子或包含权利要求5所述载体的遗传工程菌。
8. 权利要求1-4所述启动子作为药物有效作用靶点在预防、诊断或治疗阿尔茨海默氏 病药物中的用途。
9. 权利要求5所述干扰因子在预防、诊断或治疗阿尔茨海默氏病药物中的用途。
【文档编号】A61P25/28GK104357448SQ201410603446
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】周卫辉 申请人:重庆医科大学附属儿童医院