快速鉴定基因可变剪接类型的方法及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种快速鉴定基因可变剪接类型的方法，包括预处理、样本检测以及数据分析。与现有技术相比，本发明的优势在于：适用范围广，实验步骤少、检测耗时短，结果判读简单，检测通量大，准确率高、误差小，检测成本低；同时，本发明提供的方法是在封闭管中一步完成基因片段的反转录?扩增?定性的检测方法，是一种非常简便的适用于临床样本研究的方法，特别适用于临床外周血和组织样本基因可变剪接类型的分析，经试验证实该方法快速、高效、实用，在研究基因可变剪接方面具有很好的理论和应用价值，因此其应用前景十分广阔。
【专利说明】
快速鉴定基因可变剪接类型的方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及基因可变剪接，具体说，是涉及鉴定基因可变剪接类型的方法及其应 用，尤其鉴定真核生物特定基因在特定组织特定时期的可变剪接类型的方法及其应用。
【背景技术】
[0002 ]可变剪接(也称可变剪切)是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同 的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可变剪接是从相对简单的基因组提 高蛋白质组多样性的重要机制，剪接过程受多种顺式作用序列和反式作用因子相互作用调
[0003] 据预测，人类基因组可能有约35000个基因，果蝇约14000个，而简单的模式生物线 虫约19000个基因。生物的复杂性与其基因组基因数量似乎存在明显差异，原因在蛋白质 组。基因重排，RNA编辑，和可变剪接等机制，可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质 组中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。从影响的基因数量和生物种类范围来看，可 变剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制。从可变剪接涉及的基因分布格局分析，可变 剪接多发生在参与信号传导和表达调节等复杂过程的基因上，如受体，信号传导通路（凋 亡），转录因子等。对个体分化发育和一些关键的细胞生理过程如凋亡、细胞兴奋等的精确 调控有重要意义。大约人类59%~74%的基因都是由可变剪接产生的。从可变剪接涉及的 基因系统分类分析，可变剪接多发生在免疫和神经等复杂系统。可变剪接产生的多样性，赋 予这些系统精确处理复杂信息相适应的潜力。可变剪接的错误调节可以引起多种人类和动 物疾病。总体来说，RNA的可变剪接在基因表达调控中起到很重要的作用，因此，对可变剪接 机制的研究并在研究基础上预测同一基因的不同剪接模式，对于进一步分析基因的功能及 其表达调控具有重要的理论意义。另一方面，由于异常的可变剪接可导致多种人类和动物 疾病，因此在药物设计中，许多作为药物靶点的基因也具有多种剪接模式。因此，对可变剪 接类型的研究有助于疾病的诊断与防治，对于针对不同剪接模式进行组织特异性的药物设 计也具有重大的实际意义。
[0004] 随着生物技术的发展，基因可变剪接的检测方法大致发展如下：
[0005] (一)基于EST数据的可变剪接检测
[0006] EST就是一组cDNA序列，由随机产生cDNA经过一次克隆得到的表达序列标签。EST 的平均长为300~500bp。一个EST的拷贝数表示了生物体某个基因在特定组织特定时期的 表达情况。EST在应用于预测新基因和基因表达谱分析中具有高通量、快速等优点。使用EST 数据可以发现新的可变剪接位点，从而利于进行全基因组可变剪接的研究。但其对于找到 可变剪接事件的准确程度依赖于EST序列数据的质量，并且对于结果还要进行生物学的分 析验证。由于EST序列数据不具有较高的质量，并且不包含完整转录的信息，故单纯依靠统 计的结果可靠性较低。
[0007] (二)基于芯片技术的可变剪接检测
[0008] 由于EST序列数据具有上述局限性，芯片技术被开发出来代替EST进行可变剪接事 件的分析。这样的芯片技术主要有剪接连接点芯片技术和外显子芯片技术。剪接连接点芯 片是由大量的寡核苷酸探针固定在玻璃片上制成的。这些寡核苷酸探针分为若干组，每组 探针都和特定的外显子或剪接位点一一对应。通过这种外显子芯片可以有效地发现可变剪 接事件，并且这种技术是高通量的，适于进行全基因组范围的研究。最近几年，这种芯片技 术被大量应用于发现具有组织和疾病特异性的可变剪接事件研究中。但对于检测生物体某 一特定基因在特定组织特定时期的可变剪接类型，这种高通量的优势就体现不出了，反而 它的高通量造成高费用的缺点显现无疑。
[0009] (三)基于新一代测序技术的可变剪接检测
[0010] DNA测序就是给出DNA序列片段，分析其序列组成，也就是四种核苷酸的排列方式。 RNA测序需要将RNA反转录为cDNA，再应用DNA测序技术对其进行测序。用这种方法确定基因 可变剪接的类型最为可靠，但需要将同一样品进行2次独立的RT-PCR扩增、纯化产物分别与 载体连接后转化到大肠杆菌感受态细胞，提取质粒作为测序模板，而且每一个克隆最少挑 取5个克隆子分别测序，其过程繁琐、费时、费力。
[0011](四）基于RT-PCR-RFLP技术的可变剪接检测
[0012] 逆转录-聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism,RT-PCR-RFLP)的基本原理是用RT-PCR扩增目的RNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大 小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度 的DNA片段条带。这种方法简便，分型时间短，但有一定的失误率。此方法可以用来初步确定 基因可变剪接的类型，但最终确定还要靠基因测序法，不过作为初筛，RT-PCR-RFLP方法大 大降低了基因测序法所需的测序量，因而RT-PCR-RFLP方法是确定基因可变剪接类型的有 效辅助手段。
[0013] 但上述方法无法快速确定基因可变剪接的类型，故提供一种快速、简便的鉴定基 因可变剪接类型的方法为时下亟待解决的一个重要问题。
【发明内容】
[0014] 针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种能快速、简便鉴定基因 可变剪接类型的方法，使检测一步完成，以达到快速、低费用、准确鉴定基因可变剪接类型 的目的。
[0015] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0016] 快速鉴定基因可变剪接类型的方法，是用Real-time RT-PCR的方法进行基因可变 剪接类型的快速检测，其步骤为：
[0017]步骤a)预处理:设计引物，采集待测基因样本；
[0018] 步骤b)样本检测:对步骤a所得样本进行检测，获得可变剪接片段的熔融温度；
[0019] 步骤c)数据分析:将步骤b所得可变剪接片段与标准熔融曲线对比，确定可变剪接 类型。
[0020] 优选地，标准熔融曲线选自根据GenBank数据库、文献中检索和/或其它方式(如通 过其他已知实验方法等现有技术，在此不做赘述)获取的基因全部可变剪接类型获取的基 因标准熔融温度曲线库。
[0021] 优选地，待测基因为生物学中任一具有可变剪接现象的基因。
[0022] 优选地，步骤a的具体操作为:选定生物体的待测基因，根据待测基因设计引物，对 生物体进行RNA采样;具体地，RNA采样根据选定的待测生物体特定时期的特定组织进行采 样，采样方法随不同生物组织有所不同，具体操作可参考《RNA实验技术手册》，在此不作赘 述。
[0023] 更优选地，引物设计可为现有技术任一手段或方法，如根据与可变剪接相关数据 库中提供或其它方式获取的靶基因mRNA序列，运用01igo6.31和Primer Premier 5.0软件 在相应序列保守区域设id^ -对引物，（数据库选自：ASTD(Alternative Splicing and Transcript Diversity database),http://www.ebi.ac.uk/astd/main.html；FASTdb (Splicing and Transcript database)http://www.fast-db.com/fastdb2/frame.html^ 数据库），在此不做赘述。
[0024] 优选地，步骤b的具体操作为:对步骤a所得样本进行Real-time RT-PCR，获得待测 样本可变剪接片段的熔融温度。
[0025] 更优选地，步骤b中反应体系为扩增反应总体积20yL，其中2\〇]16 3七6口5丫81^:1^- PCR Buffer 10yL,TaKaRa Ex Taq HS Mix 1.2yL, PrirncScripl1'PLUS RTase Mix OAuL, PCR上游引物（10pM)0.8yL，PCR下游引物（10pM)0.8yL，R0X Reference Dye or Dyell(50 X )0.4iiL，Total RNA 2yL，RNase Free dH2〇 4.4yL。
[0026] 更优选地，步骤b中反应程序为：反转录反应(42°C5~lOmin，95°C 10~20s)，PCR (40 个循环：93°C ~95°C5 ~10s，50°C ~65°C20 ~30s)，40°C 结束反应。
[0027] 值得一提的是，本发明的进一步优势还体现在，本发明的另一目的是提供是快速 鉴定鸡MHC I基因可变剪接类型的方法，其中，上述快速鉴定基因可变剪接类型的方法的待 测基因为鸡MHC I基因。
[0028] 优选地，上述快鉴定测鸡MHC I基因可变剪接类型的方法的步骤a中设计地引物对 为：上游引物5 ' -ACAACAITGCGCCCG-3 ' ；下游引物5 ' -AAGCAGAATGAGATGTGAGA-3 '。
[0029]优选地，上述快速鉴定鸡MHC I基因可变剪接类型的方法的步骤b中反应程序为： 反转录反应（42￡€51^11，95°(：108)，？〇?(40个循环：93°(：~95 1€5~108,55°(：~601€20~ 30s)，40 °C结束反应。
[0030] 本发明的进一步优势还体现在，本发明的另一目的是提供是快速鉴定家猪TLR 4 基因可变剪接类型的方法，其中，上述快速鉴定基因可变剪接类型的方法的待测基因为家 猪TLR 4基因。
[0031] 优选地，上述快速鉴定家猪TLR 4基因可变剪接类型的方法的步骤a中设计地引物 对为：上游引物5 ' -GACCCTTGCGTGCAG-3 ' ；下游引物5 ' -CTCTGGATAGGAITTCC-3 '。
[0032]优选地，上述快速鉴定家猪TLR 4基因可变剪接类型的方法的步骤b中反应程序 为:逆转录反应(42￡€51^11，95°(：108)，？〇?(40个循环:951€58,61 1€308)，40°(：结束反应。 [0033]本发明的进一步优势还体现在，本发明的另一目的是提供是快速鉴定龙眼MEE70/ MSI 1基因可变剪接类型的方法，其中，上述快速鉴定基因可变剪接类型的方法的待测基因 为龙眼MEE70/MS11基因。
[0034]优选地，上述快速鉴定龙眼MEE70/MS11基因可变剪接类型的方法的步骤a中设计 地引物对为：上游引物5 ' -CGGTTGTTGCTCATC-3 ' ；下游引物5 ' -CTGGGCTTCCATATC-3 '。
[0035] 优选地，上述快速鉴定龙眼MEE70/MS11基因可变剪接类型的方法的步骤b中反应 程序为：逆转录反应(42￡€5!^11，95°(：108)，？〇?(45个循环 ：951€58,581€208)，40°(：结束反 应。
[0036] 本发明的另一目的是提供上述快速鉴定基因可变剪接类型的方法在鉴定任一具 有可变剪接现象的基因类型的应用。
[0037] 优选地，所述快速鉴定基因可变剪接类型的方法可用于各基因的统计或筛查。
[0038] 与现有技术相比，本发明具有以下优势：
[0039] 1、适用范围广:本发明提供的鉴定方法适用于待测基因为生物学中任一具有可变 剪接现象的基因，只需针对不同待测基因设计合适的引物，采用适应的反应体系及反应程 序即可，必要时还可用于各基因的统计或筛查；
[0040] 2、实验步骤少，结果判读简单，鉴定耗时短:将待测基因的反转录-扩增-定性合并 为一步完成，节约了实验步骤，缩短了实验时间，获得待测样本熔融温度后，只需根据标准 曲线对照目的基因不同剪接类型片段的标准熔融温度，即可确定待测样本可变剪接片段的 可变剪接类型;从对样本核酸的提取到最终熔融温度和目的基因不同剪接类型片段的标准 曲线的熔融温度对比，只需要3~4小时，花费的时间仅为现有技术的1/10;
[0041] 3、鉴定成本低、检测通量大:使用的仪器都为现有的检测费用低的仪器，与现有技 术中准确率最高高但检测成本也颇高的基因测序方法比较，检测结果一致的同时本发明花 费低得多;检测多个样本时，以一台96孔的实时荧光PCR仪为例，去掉阴阳性对照，可同时检 测94个样本；
[0042] 5、准确率高，误差小：用于对比的标准熔融曲线库中的熔融温度已为当前基因测 序的最高水平，故采用本发明得到的检测结果与曲线库中做对比后将得到当前准确率最高 的结果，随科技发展，只需更新标准熔融曲线库即可。
[0043] 综上，本发明是从RNA样品出发，不用内参基因，只用一对引物，在封闭管中一步完 成待测基因片段的反转录-扩增-定性，再通过与基因标准熔融曲线对比后进行基因鉴定的 方法。该方法是一种较为简便的适用于临床样本研究的方法，特别适用于临床外周血和组 织样本基因可变剪接类型的分析，可用于各种基因的统计或筛查，为现在临床医学中的基 因可变剪接类型的快速确定提供了一种切实可行的方法，经试验证实该方法快速、高效、实 用;此外，本发明适用范围广，提供的检测方法适用于待测基因为生物学中任一具有可变剪 接现象的基因，只需针对不同待测基因设计合适的引物，采用适应的反应体系及反应程序 即可，在研究基因可变剪接方面具有很好的理论和应用价值。
【附图说明】
[0044] 图1为本发明实施例1中包含外显子7的MHC I基因可变剪接类型的融解曲线图；
[0045] 图2为本发明实施例1中不包含外显子7的MHC I基因可变剪接类型的融解曲线图。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细、完整地说明。实施例中出现的试 剂或仪器在【具体实施方式】中无如特殊说明，均为市售，且按照其说明书进行操作，在此不作 赘述。
[0047] 一、主要实验材料
[0048] UNIQ-lOTrizol RNA抽提试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0049] M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶，购自Promega公司；
[0050] .SYBR像Premix Ex Taq? II(Perfect Real Time)，购自TaKaRa公司。
[0051]二、主要实验仪器
[0052] MLS-3020型高压蒸气自动灭菌器，购自日本Hirayama公司；
[0053] Centrifuge 5418小型高速离心机，购自德国Eppendorf公司；
[0054] MIKRO 200R台式高速冷冻离心机，购自德国赫提驰Hettich公司；
[0055] Light Cycle 2.0型PCR仪，购自德国ROCHE公司。
[0056] 实施例1快速鉴定试验鸡MHC I基因的可变剪接类型
[0057]以检测试验鸡MHC I基因可变剪接体类型为例：从GenBank数据库和文献中检索 和/或其它方式(如通过其他已知实验方法)获取的鸡MHC I基因全部可变剪接类型，据此设 计合适的引物对，利用该引物对实时荧光定量PCR扩增鸡MHC I基因全部可变剪接类型，分 别获取它们的熔融温度，如此就构建了该基因的标准熔融温度曲线库，其中通过试验的方 法构建鸡MHC I基因标准熔融温度曲线库的步骤如下：
[0058] (1)从GenBank数据库和文献中检索获取鸡MHC I基因全部可变剪接类型；运用 01 igo6 ? 31或Primer Premier 5 ? 0软件设计引物对，引物对为：上游引物5 ' -ACAACATTG CGCCCG-3 ' ；下游引物5 ' -AAGCAGAATGAGATGTGAGA-3 ' ；
[0059] (2)对处于不同生长阶段的不同种类试验鸡的多个个体的不同组织进行总RNA采 样，采样方法参照《RNA实验技术手册》进行，在此不做赘述；
[0060] (3)使用Light Cycle 2.0型PCR仪扩增步骤2所得RNA样本，反应体系见表1，设置 反应程序为:42°C孵育15min，95°C预变性15s，然后进行40个循环(95°C变性，30s，59°C退火 30s，72°C延伸lmin)，72°C延伸10min，4°C保存，通过对鸡MHC I基因可变剪接位点的Real-time RT-PCR扩增，获得该基因的所有可变剪接目的片段；
[0061] (4)对步骤3所得不同的MHC I基因的可变剪接片段进行核酸序列测定，确保它们 为MHC I基因不同剪接类型片段；
[0062] (5)对步骤3所得不同可变剪接片段进行Real-time PCR融解曲线分析，以便分别 获得该基因不同剪接类型片段的标准熔融温度，此时构建该基因的标准熔融温度曲线库如 下:鸡MHC I基因共有两种可变剪接类型，序列测定结果分别为:包含外显子7的MHC I基因 序列
[0063] (5 ' -ACAACATCGCGCCCGACAGGGAAGGTGGATCCAGCAGCTCGAGCACAGGGAGC AACCCCTCCATCTGAGTGCTGTGCTT-3'）和不包含外显子7的MHC I基因序列
[0064] (5，-ACAACATCGCGCCC GGGAGCAACCCCGCCATCTGAGTGCTGTGCTT-3，）。其中，包含外显 子7的MHC I基因可变剪接类型的熔融温度在87.55 ±0.2763，熔融曲线方程为￥3 = -3.695X +45.758,相关系数为1.00,融解曲线见图1;不包含外显子7的MHC I基因可变剪接类型的熔 融温度在86.81 ± 0.2079，熔融曲线方程为Yb = -3.608X+58.165，相关系数为0.99，融解曲 线见图2。
[0065] 快速鉴定待测样本可变剪接类型步骤如下：
[0066] (1)引物设计
[0067] 根据试验鸡MHC I基因可变剪接体序列（GenBank登录号：EU746446、EU746447)设 计引物对，引物对为：上游引物5 ' -ACAACATTGCGCCCG-3 ' ；下游引物5 ' -AAGCAGAATGAGATGTGAGA-3，。
[0068] (2)样品米集并保存
[0069]购买30日龄霞烟鸡324只，每只试验鸡分别采集左右两鸡翅下静脉抗凝血各 500ul，置于1.5ml EP管中，样品编号为1~324,分别对样品1~324进行处理。以处理样品1 为例，向样品1血样中加入500ul PBS以进行稀释，沿管壁轻轻吹打，混匀后于37°C水浴中平 衡；取混匀后的血样500ul缓慢加入到含500ul外周血淋巴细胞分离液的1.5ml EP管中， 2000rpm/min离心20分钟；离心结束后可见分为3层，吸取中间的白色絮状层400ul左右，-80 °C保存备用。
[0070] (3)提取外周血淋巴细胞总RNA
[0071] 向步骤2所得的含有50ul淋巴细胞的EP管中加入lml Trizol，吹打混匀，静置 5min，使核酸蛋白复合物完全分离；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min ; 12000rpm/min于4°C离心15min，样品分为三层，吸取上层水相；将水相转入新的EP管，用冰 冷的异丙醇沉淀水相中的RNA，置于-20°C冰箱中45min;12000rpm/min，4°C离心10min，弃 掉上清；加入lml 75 %乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm/min，4°C离心5min，弃上清；室温放置至 RNA干燥，加入50ul无RNA酶双蒸水，置于-80 °C保存备用。
[0072] (4)Real_time RT-PCR扩增
[0073]对步骤3所得样本进行Real-time RT-PCR扩增，获得待测样本可变剪接片段的熔 融温度;反应体系见表1，反应程序为:42°C孵育15min，95°C预变性15s，然后进行40个循环 (95°(：变性，3〇8,59°(：退火3〇8,72°(：延伸1111111)，72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[0074]表 1 Real-time RT-PCR反应体系
[0076] (5)数据分析
[0077]将步骤4所得MHC I基因不同剪接类型片段的标准熔融温度与已构建的该基因的 标准熔融温度对比：其中，195个样品（熔融温度87.55±0.1263)属于包含外显子7的MHC I 基因可变剪接类型；129个样品(熔融温度86.81 ±0.1995)属于不包含外显子7的MHC I基因 可变剪接类型。本方法共耗时230min，仅为现有技术的1/10。
[0078] 实施例2快速鉴定试验猪TLR 4基因的可变剪接类型
[0079] 本实施例与实施例1的差别仅在于待测基因为家猪TLR 4基因，引物对为:上游引 物5 '-GACCCTTGCGTGCAG-3 ' ；下游引物5 '-CTCTGGATAGGATTTCC-3 '。该基因共有3种基因可变 剪接类型:TLR 4完整型，TLR 4外显子2完全缺失型，TLR 4外显子3部分缺失型；其中，各基 因序列如下：
[0080] (l)TLR 4完整型基因序列
[0082] (2)TLR 4外显子3部分缺失型基因序列
[0084] (3)TLR 4外显子2完全缺失型基因序列
[0086]将所得待测基因不同剪接类型片段的标准熔融温度与已构建的该基因的标准熔 融温度对照，进行基因统计或筛选。本方法共耗时230min，仅为现有技术的1/10。
[0087] 实施例3快速鉴定试验龙眼MEE70/MS11基因的可变剪接类型 [0088]本实施例与实施例1的差别仅在于待测基因为龙眼MEE70/MS11基因，引物对为:上 游引物5 ' -CGGITGTTGCTCATC-3 ' ；下游引物5 ' -CTGGGCTTCCATATC-3 '。该基因共有2种基因可 变剪接类型:MEE70/MS11完整型，MEE70/MS11外显子4-7缺失型；其中，各基因序列如下：（1) MEE70/MS11完整型基因序列
[0092] 将所得待测基因不同剪接类型片段的标准熔融温度与已构建的该基因的标准熔 融温度对照，进行基因统计或筛选。本方法共耗时250min，仅为现有技术的1/10。
[0093] 综上，只要提供基因可变剪接类型的数据库，或设计适当引物并建立好相关基因 的标准曲线，即可采用本发明提供的方法鉴定待测基因的可变剪接类型，其实验步骤少，数 据判读简单，鉴定结果准确，耗时仅为现有技术的1/10,且检测成本降低了一半左右，具有 显著的进步;此外，采用本发明提供的鉴定方法可进行任一具有可变剪接现象基因的生物 的样品检测，不仅可用于医院各类基因筛查，还可用于科研中的基因统计与分析，具有极大 的经济价值和科研意义，故应用前景十分广阔。
[0094]最后有必要在此说明的是：上面结合表格对本发明实施方式进行了详细说明，但 是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在 不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。 SEQUENCE LISTING <ll〇>湖南科技人学 <120>快速鉴定基因可变剪接类型的方法及其应用 <130- I <160> 7 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 79 <212> DNA
[0095] <、213、Unknown <220> <223>包含外显子7的鸡MHC I基因序列 <400> 1 acaacatcgc gceegacagg gaaggtggat ccageagctc gagcacaggg agcaacccct 60 ccalclgagi gcigtgclt ^ ) <210> 2 <21i> 46 <212> DNA <213 ^ Unknown <220> <223>不包含外显子7的鸡MHC I基因序列 <400> 2 acaacalcgc gcccgggagc aaccccgcca Iclgagtgci glgcii 46 <210> 3 <211> 269 <2,1.2> DNA <213> Unknown <220> <223>猪TLR 4完整型基因序列
[0096] <400> 3 gacccilgcg Igcaggtggt icciaacatt agttaccaal gcalggagcl gaatUclac 60 aaaatccctg acaacatcce cacatcagtc aagataetgg aectgagctt taactacctg： 120 aglcattlag acagcaatag cllclccagc lUccagaac Igcagglgct ggalUaicc 180 agalglgaaa Ucagacaal Igacgaigal gcaialcagg gcciaaalla cclltccacc 240 ttgacaotga cgggaaatcc tatccagag 269 <210> 4 <211> 228 <212> DNA <213〉Unknown <220> <223>猪TLR 4外显子3部分缺失型基因序列 <400> 4 gacccilgcg Lgcaggtggl tcctaacatt agttaccaaL ^c^iggagct gaatttctac 60 aaaaiccctg acaacaiccc cacalcagtc aagataclgg acclgagctt laaclacctg 120 agtcatttag acagcaatag cttctccagc lUccagaae tgcaggigcl ggal.ttal.cc 180 agatgtgaaa ttcagacaat tgacgatgac gggaaatcct atccagag 228
[0097] <210> 5 <211> 102 <212> DNA <21:3> Unknown <220> <223>猪TLR 4外显子2完全缺失型基因序列 <400> 5 gacccilgcg tgcagatglg aaaltcagac aattgacgal gatgcatatc agggcclaaa 60 ttacctttcc accttgacae tgacgggaaa tcctatccag ag 102 <210> 6 <21]> 475 <212> DNA <213> Unlaiown <220> <223>龙眼MEE70/MSU完整型基因序列 <400> 6 cggli..Ug^ leatcagagl gaggitaact gettagoatt caalccctU aalgaalgga 6Q UUggcgnc Igggiclaci gataagalgg UaagUati IgaiUgcgc aagattagca 120 cggcacttca cacaLUagi cticaaggagg augUtlcca tigUggaigu gacccaaaga 180
[0098] gtgagaclal Uiagcatcl IgllglcUg glagaaggU gaagglglgg galctlagga 240 ggatcgatga ggaacagaca ctagaggatg ccgaagatgg tccaccagag ttgcttttta 300 ctcaiggigg icacacgagt aaaalclcag aliutcaig gaacccalgi gaagallggg 360 ttattgctag cgtagcggaa gataatattc ttcaaatatg geagatggca gagaacattt 420 accatgalga ugcitgiiliU：t cclggagalg algaatctac tagagaLalg gaagc 475 <210> 7 <211> 71 <2;12>' DNA. <213> Unknown
[0099] <22〇> <223>龙眼MEE70/MS11外显子4-7缺失型基因序列 <400> 7 cggllgUgc icalcagagl gagglgtgta iclagalaca aaclccgicg Iccicllcag 60 galagagaag c 71
【主权项】
1. 快速鉴定基因可变剪接类型的方法，其特征在于：是用Real-time RT-PCR的方法进 行基因可变剪接类型的快速鉴定。2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤a)预处理:设计引物，采集待测基因样本； 步骤b)样本检测:对所得样本进行检测，获得可变剪接片段的熔融温度； 步骤c)数据分析：将步骤b所得可变剪接片段与标准熔融曲线对比，确定可变剪接类 型。3. 权利要求1所述的方法，其特征在于:标准熔融曲线选自根据GenBank数据库、文献中 检索和/或其它现有技术获取的基因全部可变剪接类型获取的基因标准熔融温度曲线库。4. 快速鉴定鸡MHCI基因可变剪接类型的方法，其特征在于：是用Real-time RT-PCR的 方法进行鸡MHCI基因可变剪接类型的快速鉴定。5. 快速鉴定家猪TLR 4基因可变剪接类型的方法，其特征在于:是用Real-time RT-PCR 的方法进行家猪TLR 4基因可变剪接类型的快速鉴定。6. 快速鉴定龙眼MEE70/MS11基因可变剪接类型的方法，其特征在于：是用Real-t imeRT-PCR的方法进行龙眼MEE70/MS11基因可变剪接类型的快速鉴定。7. 权利要求1~6所述的方法用于鉴定任一具有可变剪接现象的基因类型。8. 权利要求7所述的应用，其特征在于:所述方法用于各基因的统计或筛查。
【文档编号】C12Q1/68GK105821121SQ201610170243
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月23日
【发明人】金元昌, 勾越, 张政, 陈修月, 任朝云, 张舟, 宋国娇, 李玉峰, 赵攀
【申请人】湖南科技大学