一对用于花生根结线虫pcr检测的特异性引物及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了1对用于花生根结线虫PCR检测的特异性引物及其使用方法，所述方法的关键创新点为新的花生根结线虫的特异性引物可与已报道的南方根结线虫和爪哇根结线虫的特异性引物组合建立三重PCR检测方法，通过一次PCR扩增反应即可鉴别上述三种线虫，克服了以前上述三种线虫的特异性引物在单条线虫的水平必须分开使用的难题。本发明中的方法高效、稳定，灵敏度达到单条线虫的水平，可在我国口岸及农林部门检疫鉴定中推广应用。
【专利说明】
一对用于花生根结线虫PCR检测的特异性引物及其使用方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物线虫检疫鉴定领域，提供了 1对用于花生根结线虫PCR检测的特异 性引物及其使用方法，具体而言，所述方法通过组合使用新的花生根结线虫特异性引物以 及已报道的南方根结线虫和爪哇根结线虫的特异性PCR引物，在单条线虫的水平上建立了 用于鉴别上述3种线虫的三重PCR检测方法，克服了以前无法在单条线虫的水平上将上述三 种线虫的特异性引物混合使用的难题，显著提高了检测效率，适用于口岸及农林业相关检 疫鉴定实验室应用。
【背景技术】
[0002] 南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M. arenaria)和爪唾根 结线虫(M. javanica)是根结线虫属中分布最广、寄主最多、危害最重的3种线虫。由于这3 种线虫可能是在长期的演化中，通过染色体丢失或融合逐渐分化而来，种间遗传差异较小， 导致对其鉴别十分困难。
[0003] 传统方法鉴定以上3种线虫主要基于形态和同工酶技术，但这些方法对技术人员 专业素质要求高、耗时长，并且受虫体发育阶段等因素限制较大。以线虫DNA为基础的分子 鉴定技术由于克服了以上方法的不足，逐渐成为根结线虫鉴定的重要手段。Xu等（2004)通 过扩增线虫线粒体⑶II-16S rRNA基因之间的序列，并利用内切酶Hinf I对扩增产物进行 酶切，实现了对以上3种根结线虫的区分[4]，但该方法扩增单条线虫时重复性较差，而且对 线虫进行酶切又耗时较长。通过建立特异引物PCR方法对以上3种线虫进行鉴定有大量报 道。Adam等通过筛查发现，104/10^ &以1^^?」&￥/幻&￥三对引物用于特异性扩增南方、 花生、爪哇根结线虫效果最好，特异性引物Inc-K14-F/R扩增南方根结线虫结果为阴性。而 Kiewnick等的研究表明，Far/Rar、Fjav/Rjav能够很好的特异性扩增花生和爪唾根结线虫， 与Adam等的研究结果相同。但MI-F/MI-R用于特异扩增南方根结线虫时多个群体结果为阴 性，反而是Adam等排除的特异性引物Inc-K14-F/R在扩增南方根结线虫时效率极高。
[0004] 基于存在的以上问题，本发明在以前学者研究的基础上，对南方、花生、爪哇根结 线虫的特异性引物进行重新筛选、验证和设计，建立了一种快速、准确、稳定的以上3种线虫 多重PCR检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术中在单条线虫的水平上无法混合使用 已报道的花生根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫的特异性引物的难题，提供了一对 新的花生根结线虫的特异性引物及其与已报道南方根结线虫和爪哇根结线虫特异性引物 混合使用的方法，所述新的花生根结线虫特异性引物和使用方法如下： 所述新的花生根结线虫的特异性引物序列为： 上游引物 Far2:5 Z-TGCTATGCCATCAGGAGATGTG-3 ' 下游引物Rar 2:5 二CTCTTCTCCACTCGCAGGAA-3 ' 所述新的花生根结线虫特异性引物可与已报道的南方根结线虫特异性引物Inc-K14-F: GGGATGTGTAAATGCTCCTG 和 Inc-K 14-R: CCCGCTACACCCTCAACTTC 以及已报道的爪哇花生根 结线虫特异性引物F jav: GGTGCGCGAITGAACTGAGC和 R jav: CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC组合建 立三重PCR检测方法，该方法包括如下步骤： 步骤一、线虫DNA的提取： 用双蒸水将线虫清洗干净，挑取单条线虫放入含8yL ddH20的PCR管中，用小型解剖刀 将线虫切为2-3段，瞬时离心，反复冻融2次(液氮处理lmin，65°C水浴2min)后，加入2yL裂解 液(所述裂解液为1 〇 X PCR Buf f er、双蒸水与20mg/mL蛋白酶K的混合液(体积比10:9:1)， 10 X PCR Buffer与20mg/mL蛋白酶K均购自 TAKARA公司），56°C保温lh，95°C加热lOmin，瞬 时离心后上清液可用于后续的分子检测。
[0006] 步骤二、多重PCR扩增：PCR反应体系（50yL):10X PCR Buffer(Mg2+)5 yL，dNTPs (2.5 mmol/L)2 yL，三种线虫的上、下游引物（10 ymol/L)分别为0.5 yL(共3yL)，rTaq DNA 聚合酶(5 U/yL)0.4 yL，模板DNA 8 yL，ddH20 31.6 yL。除引物外，所用试剂均购自宝生物 (TAKARA)公司。PCR反应条件:95 °C预变性5 min;40个循环反应:95 °C变性30 sec，62.5 。(:退火40 sec，72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保温5 min，使反应物充分延伸。
[0007] 步骤三、结果判定:扩增产物经电泳检测若出现335 bp特异性条带，则说明待检线 虫为花生根结线虫，若出现399 bp特异性条带，说明待检线虫为南方根结线虫，若出现670 bp的特异性条带，说明待检线虫为爪哇根结线虫，若无扩增产物或出现大小不一致的条带， 则说明待检线虫不是上述3种线虫的任何一种。
[0008] 所述双蒸水即为经过两次蒸馏的无菌水，其通常用于分子生物学实验。
[0009] 所述裂解液中的10X PCR Buffer和20mg/mL的蛋白酶K均为TAKARA公司生产，商 品编号分别为R001B和9033; 优选地，本申请的花生根结线虫特异性引物的使用方法中，步骤二中PCR反应条件要求 退火温度为62.5 °C; 本申请的方法适用于鉴别花生根结线虫Meloidogyne arenaria、南方根结线虫M. incognita和爪唾根结线虫M. javanica。
[0010] 与现有技术相比，本发明的进步在于:新的花生根结线虫的特异性引物可与已报 道的南方根结线虫和爪哇根结线虫的特异性引物组合建立三重PCR检测方法，通过一次PCR 扩增反应鉴别上述三种线虫，克服了以前上述三种线虫的特异性引物在单条线虫的水平必 须分开使用的难题。本发明中的方法高效、稳定，灵敏度达到单条线虫的水平，可在我国口 岸及农林部门检疫鉴定中推广应用。
【附图说明】
[0011] 图1三重PCR检测方法特异性测试结果； 图2三重PCR检测方法灵敏度测试结果-南方根结线虫； 图3三重PCR检测方法灵敏度测试结果-花生根结线虫； 图4三重PCR检测方法灵敏度测试结果-爪哇根结线虫； 图5三重PCR检测方法重复性测试结果； 图1中各字母含义如下：泳道M:100bp ladder marker;泳道1-5:南方根结线虫 M. incognita(MIAUl、MIIT1、MIXC2、MITJ1、MITJ3);泳道6-8 :花生根结线虫M. arenaria (MATJ1、MAJS1、MAXC1);泳道9、10:爪哇根结线虫M. javanica(MJHNl、MJTJ2);泳道 11-17:北 方根结线虫M.hapla、象耳豆根结线虫M. enterolobii、西班牙根结线虫M.hispanica、苹果 根结线虫M.mali、山茶根结线虫M.camelliae、奇氏根结线虫M. chitwoodi、虚假根结线虫 M.fallax;泳道 18:CK(ddH20) 图2,图3,图4中各字母的含义如下：泳道M:100bp ladder marker;泳道1-3:单条线虫 DNA未稀释;泳道4-6:稀释5 X ;泳道7-9:稀释10 X ;泳道10-12:稀释20 X ;泳道13-15:稀释 50 X ;泳道 16-18:稀释 100 X ;泳道 19: CK 图5中各字母的含义如下：泳道M:100bp ladder marker;泳道1-10:南方根结线虫 M.incognita(MIAUl、MIJS3、MIIT1、MIHNHK、MIXC1、MIXC2、MIHB1、MITJ1、MITJ2、MITJ3);泳 道 12-21:花生根结线虫M. arenaria(MAUSl、MAH01、MAJS1、MAYN1、MATW1、MAXC1、MAXC2、 MATJ1、MATJ2);泳道23-32:爪哇根结线虫M. javanica(MJYNl、MJHN1、MJGX1、MJIR1、MJ⑶、 MJBE1、MJTJ1、MJTJ2、MJXC1、MJXC2);泳道 11、22、33: CK
【具体实施方式】
[0012]为能进一步了解本发明的
【发明内容】
、特点及功效，兹举以下实施例，并配合附图详 细说明如下： 标本来源 供试线虫包括南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫等10种线虫的36个群体，详 情见下表：
实施例1、三重PCR检测方法特异性测试 1.单条线虫DNA提取 用双蒸水将线虫清洗干净，挑取单条线虫放入含8yL ddH20的PCR管中，用小型解剖刀 将线虫切为2-3段，瞬时离心，反复冻融2次(液氮处理lmin，65°C水浴2min)后，加入2yL裂解 液(所述裂解液为1 〇 X PCR Buf f er、双蒸水与20mg/mL蛋白酶K的混合液(体积比10:9:1)， 10 X PCR Buffer与20mg/mL蛋白酶K均购自 TAKARA公司），56°C保温lh，95°C加热lOmin，瞬 时离心后上清液可用于后续的分子检测。
[0013] 多重PCR扩增 PCR反应体系（50yL):10X PCR Buffer(Mg2+)5 yL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，三种线 虫的上、下游引物（10 ymol/L)分别为0.5 yL(共3yL)，rTaq DNA聚合酶(5 U/yL)0.4 yL，模 板DNA 8 yL，ddH20 31.6 yL。除引物外，所用试剂均购自宝生物(TAKARA)公司。PCR反应条 件:95 °C预变性5 min;40个循环反应:95 °C变性30 sec，62.5 °C退火40 sec，72 °C延伸 1.5 min;最后72 °C保温5 min，使反应物充分延伸。
[0014]电泳检测 每个样品取3yL扩增产物，使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，设置电压160V，电泳30min后 将凝胶放入EB染液中染色15min，随后置于凝胶成像系统中观察并拍照。
[0015]三重PCR检测方法特异性测试结果 本研究利用南方根结线虫10个群体、花生根结线虫9个群体、爪哇根结线虫10个群体和 7种其它根结线虫群体对构建的多重PCR检测体系进行特异性测试，每个群体3个重复。考虑 到群体太多，本研究最终选取5个南方根结线虫群体，3个花生根结线虫群体和2个爪哇根结 线虫群体以及其它7种根结线虫群体的各1个群体以展示实验结果。结果表明（图1)，南方、 花生和爪哇根结线虫均在相应的泳道内特异性扩增获得目的条带，而其它7种根结线虫均 未出现特异性目的条带，说明新构建的多重PCR检测体系满足特异性要求。
[0016]实施例2、三重PCR检测方法灵敏度测试 1.单条线虫DNA提取 同实施例1。
[0017] 多重PCR扩增 同实施例1。
[0018]电泳检测 同实施例1。
[0019] 三重PCR检测方法灵敏度测试结果 将3种根结线虫的单条线虫DNA提取物分别以未稀释、5X、10X、20X、50X、100X稀释 进行灵敏度测试，每个梯度3个重复。结果表明，稀释至20X时，南方和花生根结线虫的目的 条带依然可以有效扩增（图2-3)，而爪哇根结线虫甚至在稀释至100X时，目的扩增条带依 然可见（图4)。不过，由于花生根结线虫在稀释到5 X时扩增效率显著降低，因此在实际检测 过程中不建议对单条线虫DNA提取物稀释后使用。
[0020] 实施例3、三重PCR检测方法重复性测试 1.单条线虫DNA提取 同实施例1。
[0021] 多重PCR扩增 同实施例1。
[0022] 电泳检测 同实施例1。
[0023]三重PCR检测方法重复性测试结果 选取南方、花生和爪哇根结线虫共计29个群体，每个群体随机挑取10条线虫，即10个重 复，以测试多重PCR检测体系的重复性。由于重复太多，最终每个群体选取1个重复以展示实 验结果。结果表明（图5)，本研究构建的多重PCR检测体系能够稳定的扩增出以上3种根结线
【主权项】
1. 一对用于花生根结线虫PCR检测的特异性引物，其特征在于，序列为： 上游引物 Far2:5 二TGCTATGCCATCAGGAGATGTG-3 ' 下游引物Rar 2:5 二CTCTTCTCCACTCGCAGGAA-3 \2. 根据权利要求1的特异性引物，其特征在于，该特异性引物可与已报道的南方根结线 虫特异性引物 I nc-K 14-F: GGGATGTGTAAATGCTCCTG 和 I nc-K 14-R: CCCGCTACACCCTCAACTTC 以 及已报道的爪哇花生根结线虫特异性引物Fjav:GGTGCGCGATTGAACTGAG(^PRjav: CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC组合建立三重PCR检测方法，该方法包括如下步骤： 步骤一、单条线虫DNA的提取； 步骤二、多重PCR扩增：PCR反应体系（50yL):10X PCR Buffer(Mg2+)5 yL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，上、下游引物（10 μ mol/L)分别为0.5 yL(共3yL)，rTaq DNA聚合酶(5 U/yL) 0.4 yL，模板DNA 8 yUddifeO 31.6 yL;除引物外，所用试剂均购自宝生物(TAKARA)公司； PCR反应条件:95 °C预变性5 min;40个循环反应:95 °C变性30 sec，62.5 °C退火40 sec， 72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保温5 min，使反应物充分延伸； 步骤三、结果判定:扩增产物经电泳检测若出现335 bp特异性条带，则说明待检线虫为 花生根结线虫，若出现399 bp特异性条带，说明待检线虫为南方根结线虫，若出现670 bp的 特异性条带，说明待检线虫为爪哇根结线虫，若无扩增产物或出现大小不一致的条带，则说 明待检线虫不是上述3种线虫的任何一种。3. 根据权利要求2的使用方法，其特征在于，步骤二的PCR反应条件中，退火温度为62.5 Γ。4. 根据权利要求1的特异性引物和权利要求2的检测方法，其特征在于:所述三重PCR检 测方法系用于通过一步PCR鉴别花生根结线虫Meloidogyne arenaria、南方根结线虫M. incognita和爪唾根结线虫Μ· javanica。
【文档编号】C12N15/11GK105821118SQ201510934300
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月14日
【发明人】王金成, 刘跃庭, 林宇, 冯洁, 顾建锋, 张裕君, 陈先锋
【申请人】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心