大蒜素在制备用于治疗人肝硬化的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供大蒜素在制备用于治疗人肝硬化的药物中的新用途，药物其剂型可以为药学上可接受的剂型，例如但不限于片剂、胶囊或针剂。经药理实验发现，大蒜素对肝星状细胞(HSC-T6细胞株)的增殖有抑制作用。用MTT法测定大蒜素作用后的HSC-T6细胞增殖率，结果发现细胞增殖率随大蒜素浓度的增加不断下降，且与大蒜素呈剂量依赖性关系。经临床试验证实，大蒜素对人肝硬化的治疗改善了患者肝功能、明显降低了患者血清中胶原蛋白的含量，显示出了多重药理活性，初步推测其具有多途径、多靶点的抗肝硬化的机制。因此，其可用于制备治疗肝硬化的药物。本发明为治疗人肝硬化提供了一种新的药源。
【专利说明】大蒜素在制备用于治疗人肝硬化的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药【技术领域】，特别涉及大蒜素在制备用于治疗人肝硬化的药物中的 新用途。
【背景技术】
[0002] 大蒜素（DiallyI trisulfide)又名大蒜新素，化学名为二條丙基二硫化物，是大 蒜的主要有效成分。大蒜作为一种天然药剂，在我国古代医药学记载中最早可见于《本草 经集注》，被国际医学界称为"二十一世纪在天然食药物领域中的最伟大神奇发现之一"。大 蒜素为百合科植物大蒜鳞茎中提取的特有的含硫化合物，为多种烯丙基有机硫化合物复合 体。蒜氨酸是大蒜素的前体物质，以稳定无臭的形式存在于大蒜中。当大蒜里的蒜酶被激 活后，催化蒜氨酸形成大蒜素，其为无色油状物，分子式为C 6HltlO2，其主要有效成分是特有 的有机含硫化合物（OSCs)。近年来，国内外学者对大蒜素的药理和临床应用进行的多方面 研宄表明它具有杀菌、抗菌、抗肿瘤、降胆固醇、抗血小板聚集、护肝、预防心血管疾病、降血 压、神经保护等药理学作用。
[0003] 现代药物化学研宄证明，大蒜内含有二烯丙基一硫化合物（DAS)、二烯丙基二硫 化合物（DADS)、二烯丙基三硫化合物（DATS)等化合物。其中DATS含量最高，且性质最稳 定。现研宄表明二烯丙基三硫化合物是一种具有药理学活性的合成物，具有抗菌、杀菌、抗 氧化、保肝、增强机体免疫力和抗癌等作用。其临床应用较为广泛，已经用于治疗微生物感 染等疾病。目前市面上的大蒜素药物有新疆特丰药业股份有限公司生产的大蒜素肠溶片、 新疆华世丹药业生产的大蒜素软胶囊、江苏正大清江制药有限公司生产的大蒜素胶囊、徐 州莱恩药业生产的大蒜素针剂等。这些大蒜素药物其适应症大多为抗感染药，用于防治急 慢性菌痢和肠炎、百日咳、肺部和消化道的真菌感染、白色念珠菌菌血症、隐球菌性脑膜炎、 肺结核等。
[0004] 但是目前，对于大蒜素在人肝硬化方面的治疗药物中的应用鲜有报道，而且也没 有相关临床数据证实其具有治疗人肝硬化活性的报道。肝硬化形成和发展的关键环节是肝 星状细胞OfepatiC stellate cell，HSC)的活化，肝脏组织内80%的胶原成分均为HSC所 产生，激活的HSC转化为肌成纤维母细胞，分泌大量细胞外基质（ECM)，导致肝脏ECM的合成 与降解的失衡，促进肝硬化不断进展。
[0005] 我国是慢性乙型病毒性肝炎大国，全球慢性乙型肝炎病毒（HBV)感染者约3. 5亿， 我国约有1. 3亿。西方国家以慢性丙型肝炎为主，慢性丙型病毒性肝炎在我国的发病率亦 有所上升。近年来，随着人们物质生活的相对富足与精神生活的相对匮乏，酒精性和非酒精 性脂肪性肝病明显增多，并且与肝硬化关系密切。随着医疗技术的不断发展与进步，自身免 疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等疾病的诊断率不断升高，同时所导致的肝硬化也逐渐引 起重视。大多数慢性肝病患者就诊时已经出现了肝硬化并发症。世界卫生组织报道，全世界 肝硬化发病率为17. 1/10万，其并发症食管、胃底静脉曲张破裂出血病死率可达到50%? 60%。在我国，肝硬化占内科住院人数的4. 2%?4. 3%，每年国家耗费大量医疗资源及财 政支出，但目前国内外尚缺乏对肝硬化治疗的有效办法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供大蒜素在制备用于治疗人肝硬化的药物中的新用途。
[0007] 进一步地，本发明提供大蒜素作为唯一有效成分在制备用于治疗人肝硬化的药物 中的应用。
[0008] 所述药物其剂型可以为药学上可接受的剂型，例如但不限于片剂、胶囊或针剂。
[0009] 经药理实验发现，大蒜素对肝星状细胞（HSC-T6细胞株）的增殖有抑制作用。用 MTT法测定大蒜素作用后的HSC-T6细胞增殖率，结果发现细胞增殖率随大蒜素浓度的增加 不断下降，且与大蒜素呈剂量依赖性关系。电镜和流式细胞学实验则发现大蒜素进一步诱 导了星状细胞发生凋亡。因此大蒜素不仅可抑制HSC-T6细胞的增殖、影响其胶原形成，还 可诱导其凋亡，从而阻断了肝硬化的主要形成进程。进一步动物实验证明，大蒜素可保护肝 功能，抑制肝组织的炎症反应，降解肝硬化病灶中的胶原蛋白。经临床试验证实，大蒜素对 人肝硬化的治疗改善了患者肝功能、明显降低了患者血清中胶原蛋白的含量，显示出了多 重药理活性，初步推测其具有多途径、多靶点的抗肝硬化的机制。因此，其可用于制备治疗 肝硬化的药物。
[0010] 本发明为治疗人肝硬化提供了一种新的药源。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1 :不同浓度大蒜素作用12h对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响。A.空白对 照；B.溶剂对照（2. 7ul/ml DMSO) ;C. 3ug/mL 大蒜素；D. 6ug/mL大蒜素；E. 12ug/mL大蒜素； F. 24ug/mL 大蒜素；G. 48ug/mL 大蒜素。
[0012] 图2 !Hoechst 33342染色法检测不同浓度大蒜素作用不同时间诱导大鼠肝星状 细胞凋亡的作用。A-H为不同浓度大蒜素作用大鼠肝星状细胞6小时组；I-P :不同浓度大蒜 素作用大鼠肝星状细胞12小时组；Q-X :不同浓度大蒜素作用大鼠肝星状细胞24小时组； A、I、Q :空白对照组；B、J、R :溶剂对照组；C、K、S :12 μ g/ml大蒜素组；D、L、T :24ug/ml大 蒜素组；E、M、U :空白对照组Hoechst33342染色；F、N、V :溶剂对照组Hoechst33342染色； G、 0、W : 12ug/ml 大蒜素组 Hoechst33342 染色；H、P、X :24ug/ml 大蒜素组 Hoechst33342 染 色。
[0013] 图3 :透视电镜下观察24 μ g/ml大蒜素作用12小时对HSC-T6细胞凋亡形态学变 化的影响。A为溶剂对照组；B、C、D为24 μ g/ml大蒜素组。A :溶剂对照组HSC-T6 (X9700); B:核染色质凝聚并边集（X5800) ;C:核染色质凝聚（X5800) ;D:细胞核体积缩小，分裂成 多个致密体，并且形成的凋亡小体具有完整的膜结构（X5800)。
[0014] 图4 :流式细胞仪检测：Annexin V-FITC/PI双染色检测大蒜素对HSC-T6细胞凋 亡的影响。A :1. 35ul/ml DMSO作用于大鼠肝星状细胞（HSC-T6) 12小时；B:24ug/ml大蒜素 作用于大鼠肝星状细胞（HSC-T6) 12小时。
[0015] 图5 :Western blot检测大蒜素作用24小时对大鼠肝星状细胞Bcl-2蛋白表达的 影响。1:空白对照组；2:溶剂对照组；3:12yg/ml大蒜素组；4:24yg/ml大蒜素组。
[0016] 图6 :Western blot检测大蒜素作用24小时对大鼠肝星状细胞MAO蛋白表达的影 响。1:空白对照组；2:溶剂对照组组；3:12yg/ml大蒜素组；4:24yg/ml大蒜素组。
[0017] 图7 Western blot检测大蒜素作用24小时对大鼠肝星状细胞--ΜΡ-1蛋白表达 的影响。1:空白对照组；2:溶剂对照组；3:12yg/ml大蒜素组；4:24yg/ml大蒜素组。
[0018] 图8 :大鼠肝组织HE和Masson染色（100X)结果：A、C、E、G为HE染色结果，B、 D、F、H为Masson染色结果。其中，A、B:空白对照组；C、D:模型对照组；E、F:小剂量预防 组；G、H:中剂量预防组。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明：
[0020] 实施例1 :大蒜素对大鼠肝星状细胞增殖的影响
[0021] I. 1实骀材料:
[0022] 大鼠肝星状细胞细胞株（HSC-T6)购自北京肿瘤研宄所；大蒜素 （Dialyll trisulfide，DATS)，购自美国 ChromaDex 公司；高糖型 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基粉剂，购自美国Gibco公司；胎牛血清（Fetal Bovine Calf Serum，FBS)，购 自美国Gibco公司；胰蛋白酶（Trypsin)，购自美国Gibco公司；青-链霉素（Penicillin/ Streptomycin)，购自美国 Gibco 公司；磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline， PBS)粉剂，购自武汉博士德公司；乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt, EDTA)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；二甲基亚砜（Dimethyl sulfide，DMS0)，购自美国 Sigma 公司；四甲基偶氮挫蓝（3-(4,5-dimethylthiazol_2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)，购自美国 Sigma 公司；Cell Proliferation Elisa试剂盒，即BrdU试剂盒，购自印度Roche Diagnostics试剂公司。
[0023] L 2不同浓度大蒜素作用12小时对HSC-T6增葙的影晌
[0024] 大鼠肝星状细胞株HSC-T6于体积分数为lOOml/L小牛血清及I X 105U/L青霉素、 100mg/L链霉素的DMEM培养液中培养。受试对象分为对照组、大蒜素处理组。大蒜素处理 组设定如下浓度梯度：3ug/ml，6ug/ml，12ug/ml，24ug/ml，48ug/ml，以不加药物而加等体积 的DMEM培养基为对照组，设定DMSO为溶剂对照。培养12小时后进行显微镜拍照，如图1 所示。图1中A为空白对照组；B为溶剂对照（2. 7ul/ml DMS0)组；C为3ug/mL大蒜素组； D为6ug/mL大蒜素组；E为12ug/mL大蒜素组；F为24ug/mL大蒜素组；G为48ug/mL大蒜 素组。从图1中各图可观察到：A图中细胞呈卵圆形和长梭形，生长活跃，排列密集；B图中 细胞呈卵圆形和长梭形，生长活跃，排列密集。C图中细胞呈卵圆形和长梭形，细胞排列较A 组稀疏。D图中大部分细胞呈卵圆形和长梭形，少数细胞聚集成团，胞浆浓缩，致密。E图中 少数细胞呈卵圆形和长梭形，大部分细胞聚集成团，胞浆浓缩，致密。F图中细胞呈小圆形， 大部分聚集成团，胞浆浓缩，致密。G图中细胞呈小圆形，聚集成团，胞浆浓缩，致密。
[0025] I. 3MTT法检测不同浓度大蒜素作用不同时间对HSC-T6增葙的影晌
[0026] L 3. 1实骀分组说明
[0027] (1)HSC-T6细胞空白对照组：用体积分数为10%的小牛血清及IXlO5IU/!的青霉 素、100mg/L的链霉素，不加大蒜素。
[0028] ⑵HSC-T6溶剂对照组：用体积分数为10 %的小牛血清及I X IO5IUzl的青霉素、 100mg/L的链霉素、1. 35 μ 1/ml DMSO的高糖型DMEM培养基作为试剂。
[0029] (3)HSC-T6大蒜素药物实验组：分成2个不同浓度的大蒜素，用于MTT实验。大蒜 素的药物作用浓度分别为12 μ g/ml、24 μ g/ml。
[0030] I. 3. 2实验步骤:取对数牛长期HSC-T6细胞，消化液消化，离心，用完全培养基将 细胞重悬为单细胞悬液，浓度调至IX l〇5/ml。将细胞接种至96孔板，每孔100 μ 1，每个组 设5个副孔。实验按照1. 3. 1中的分组方法分为空白对照组、溶剂对照组、12 μ g/ml大蒜素 组、24 μ g/ml大蒜素组共4组，每组设5个复孔。种板12小时后更换各组相应的培养基，更 换培养基6、12、24小时后分别加入5mg/ml的MTT液20 μ 1/孔继续于37°C孵箱内继续孵育 4小时，此时倒置相差显微镜下可观察到活细胞内形成颗粒状蓝紫色结晶。小心吸去上清， 加 DMSO 100 μ 1/孔终止反应，在微型振荡器上摇匀lOmin，彻底溶解形成的结晶，立即在主 波长570nm条件下，用酶标仪检测吸光值。用100 μ I DMSO做空白孔调零，读数三次取平均 值。细胞增殖抑制率％ =[(对照孔A值-实验孔A值）/对照孔A值]X 100%。
[0031] MTT法的检测结果如下表1所示，由表1可见，HSC-T6细胞经过大蒜素的作用，明 显抑制了细胞的增殖。
[0032] 表I. MTT法测不同浓度大蒜素作用不同时间对大鼠肝星状细胞增殖的影响
【权利要求】
1. 大蒜素在制备用于治疗人肝硬化的药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中大蒜素作为唯一有效成分。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物其剂型为药学上可接受的剂型。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述剂型为片剂、胶囊或针剂。
【文档编号】A61K31/255GK104490858SQ201410693574
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】刘清华, 周晓明, 王璐璐 申请人:刘清华, 周晓明, 王璐璐