一种高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种高纯度秋茄叶总黄酮的制备方法，包括如下步骤：（1）取秋茄叶粉碎成粗粉，用15倍的体积分数60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取时间为0.5~1.5h，提取温度为60~80℃，合并提取液；（2）浓缩步骤（1）所得的提取液使其浓度为5mg/ml，离心，取上清液，用非极性大孔吸附树脂纯化，吸附30min，水洗除杂，再用35~80%的乙醇洗脱；非极性大孔吸附树脂为HPD722型、HPD100型、HPD826型吸附树脂中的一种或几种；（3）收集步骤（2）所得的洗脱液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，即得本品，本品中秋茄叶总黄酮的含量至少为60%。本发明的方法简便、高效、环保，且针对性强，能获得高纯度的、美白祛斑活性强秋茄叶总黄酮。
【专利说明】一种高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高纯度秋茄叶总黄酮的制备方法，属于生物分离【技术领域】。
【背景技术】
[0002]秋前(Kandelia candel)为红树科秋前属植物，秋前为我国红树植物中最耐寒的树种，在我国红树植物分布区自南向北，红树植物种类逐渐减少，只有秋茄还有分布，达到最北端28°25’N(浙江乐清)。秋茄中的化学成分主要有黄酮类、鞣质类、留醇类、脂肪酸和多糖等。近年来诸多学者对秋茄中的各种化学成分研宄，发现了一些具备药物开发价值的功用，例如学者李宝才在《红树林秋茄叶类脂化学及活性物质的研宄》一文中报道:秋茄叶总黄酮(含量为29.3%)有抗氧化作用，能明显降低四氧嘧啶所致高过氧化脂质小鼠血清MDA值(中国科学院研宄生院广州地球化学研宄所，博士毕业论文，2002.)。此外，本申请的发明人经过前期研宄也发现了:秋茄叶总黄酮具有较好的抑制黑色素生成、抑制酪氨酸酶活性、抗氧化和抗紫外作用，且作用的强弱与秋茄叶总黄酮的纯度有一定的关联。
[0003]现有的秋茄叶总黄酮的制备方法，经检索只有两篇文献提及，其一是纪丽丽、宋文东、陈煜藩在《红树植物秋茄叶黄酮的提取及抑菌活性实验》一文中公开的方法:秋茄叶粉末Ikg用5L 60%乙醇浸渍4次，浓缩除去乙醇后离心取上清液，再通过AB-8大孔离子交换树脂，用去离子水冲洗柱子至清亮，再用75%乙醇冲洗，收集乙醇液，回收乙醇，干燥，得到总黄酮45.3g，总黄酮的含量为17.8%(《天然产物研宄与开发》，2009年21卷:179-181页)。其二是李宝才、闻克威等人在《秋茄叶中芦丁的分离与鉴定》一文中公开的方法:1kg秋茄叶粉末用5L 60%乙醇浸渍4次，浓缩除去乙醇后离心取上清液，再通过DA201大孔离子交换树脂，用去离子水冲洗柱子至清亮，再用80%乙醇冲洗，收集乙醇液，回收乙醇，干燥，得粗黄酮50.2g，总黄酮的含量为18.9%。将上述粗黄酮45g，研磨成粉，用500ml乙醇/三氯甲烷(3:17)混合溶剂，萃取2次，离心取上清液。残余物用500ml乙醇/三氯甲烷(1:1)萃取2次，离心，取上清液。合并所有离心液，回收溶剂，干燥，得“精制黄酮”9.6g，黄酮含量为29.3% (《热带海洋学报》，2002年21卷第3期)。上述两种方法的主要缺点在于:所得到的总黄酮纯度低，过完大孔树脂后，纯度都小于20%，即使用大量的有毒有机溶剂萃取后，总黄酮含量也没超过30%，影响药物开发功效，且采用有毒有机溶剂萃取也易引发环境污染的隐患。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，解决了【背景技术】中所述的技术缺陷。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，包括如下步骤:
(I)取秋茄叶粉碎成粗粉，用15倍的体积分数60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取时间为0.5-1.5h，提取温度为60~80°C，合并提取液； (2)浓缩步骤(I)所得的提取液使其浓度为5mg/ml，离心，取上清液，用非极性大孔吸附树脂纯化，吸附30min，水洗除杂，再用35~80%的乙醇洗脱；非极性大孔吸附树脂为HPD722型、HPDlOO型、HPD826型吸附树脂中的一种或几种；
(3)收集步骤(2)所得的洗脱液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，即得本品，本品中秋茄叶总黄酮的含量至少为60%。
[0006]本发明选用的HPD100型、HPD722型和HPD826型非极性大孔吸附树脂对秋茄叶总黄酮的吸附量和解吸率明显优于现有技术中其他几种实验树脂，如采用静态吸附-解吸附实验(具体实验方法见具体实施实施方式中记载)进行考察，考察结果表明，HPD100的吸附量可达到71.99 mg/mL，解吸率87.15%，HPD722的吸附量可达到70.41 mg/mL，解吸率87.40%，HPD826的吸附量可达到66.55 mg/mL，解吸率88.14%，吸附量远大于现有技术中的HPD417 的 35.40 mg/mL, DM130 的 49.45 mg/mL, AB-8 的 48.85 mg/mL, DlOl 的 49.84 mg/
mLo
[0007]优选的，步骤(I)的提取时间0.5h，提取温度为80°C。
[0008]优选的，步骤(2)优选采用HPD722型吸附树脂纯化。在动态吸附和解吸方面(具体实验方法见具体实施实施方式中记载)，HPD722型树脂的吸附量为19.57mg/mL，解吸率97.84%，相比于HPD100、HPD826型的树脂，吸附量多2.5~3mg/mL，解吸率高8~10%，故本发明将HPD722型大孔树脂作为最优选择。
[0009]优选的，步骤(2)上清液纯化时的上样浓度优选为5mg/ml，上样流速为2~3BV/h，上样量为4.5-6.5BVo
[0010]将秋茄叶提取液浓缩到不同的秋茄叶总黄酮含量，比较吸附量，结果表明，上样浓度较高为好，但本申请的发明人发现当浓度超过5mg/mL时容易堵塞树脂柱，影响纯化效果，故上样浓度优选5mg/mL，既能保证纯化效果，又能提高纯化效率。
[0011]另外，本申请的发明人以不同流速进行动态吸附，考察最优上样流速，取上清液过大孔吸附树脂柱，分段收集流出液，测定每份收集液的秋茄叶总黄酮浓度，绘制泄漏曲线确定最佳上样量。结果发现，上样流速越慢，吸附量越大，吸附效果越好。上样流速为3BV/h，吸附量达28.54mg/mL，比6BV/h流速吸附量高出20%，因此确定上样流速为2~3BV/h。另外，本申请的发明人还发现当上样量大于6.5BV时，秋茄叶总黄酮开始明显泄露，故样品液的最大上柱体积优选为6.5BV，确保秋茄叶总黄酮泄露少。
[0012]优选的，步骤(2)采用50%的乙醇洗脱。不同体积分数的乙醇溶液洗脱效果不同，50%的乙醇洗脱黄酮的解吸率和总黄酮含量都较高，分别高达95.13%和76.19mg/mL，比其他浓度的乙醇解吸率高5~20%，吸附量高4~14mg/mL ;继续增加乙醇浓度，总黄酮的洗脱率稍有降低但是变化不大。因此优选50%乙醇为洗脱剂，可以降低溶剂成本。
[0013]优选的，步骤(2)乙醇洗脱时的洗脱流速为3?6BV/h，更优选3BV/h，洗脱液用量为3~5BV，更优选4BV。
[0014]洗脱流速越低，解吸率越高，解吸效果越好，洗脱流速为3BV/h时，解吸效果最好，高达95.02%，因此更优选洗脱剂的流速为3BV/h。
[0015]本申请的发明人发现当洗脱液收集到2 BV的时候，大部分的黄酮已经由大孔树脂中解吸出来；当收集到4BV的时候，积累解吸率已达到98.61%。说明此时黄酮类化合物已基本洗脱完全，故更优选4倍柱体积，可以节约资源和获得较高纯度的秋茄叶总黄酮。
[0016]优选的，一种高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，包括如下步骤:
(1)取秋茄叶粉碎成粗粉，用60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取时间为0.5h，提取温度为80°C，合并提取液；
(2)浓缩步骤(I)所得的提取液使其浓度为5mg/ml，离心，取上清液，用HPD722型吸附树脂纯化，纯化时上样浓度为5mg/ml，上样流速为3BV/h，上样量为6.5BV ;吸附30min，用3.5BV蒸馏水洗去水溶性杂质，再用50%的乙醇洗脱，洗脱时的洗脱流速为3BV/h，洗脱液用量为4BV。
[0017](3)收集步骤(2)所得的洗脱液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，即得本品，所述本品中秋茄叶总黄酮的含量大于70%。
[0018]本发明提供的一种高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，方法简便、高效、环保，且针对性强，能获得高纯度的、美白祛斑活性强秋茄叶总黄酮。
【具体实施方式】
[0019]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0020]1、秋茄叶总黄酮含量测定采用NaNO2-Al (NO3) 3_NaOH法，具体操作为:用60%乙醇稀释和定容样品，加入0.6mLNaN02溶液(5%)摇匀后立即加入0.6mLAl (NO 3) 3溶液(10%)，摇匀后放置6min，加入6mLNa0H溶液(I mol/L)后立即在波长500 nm处测定吸光度。
[0021]2、静态吸附-解吸附实验方法具体为:分别取不同型号已预处理好的湿树脂，每份1.0mL，置250mL磨口三角瓶中，加入2.63mg/mL提取液样品80 mL，放置恒温摇床中25°C, 100 r/min恒温振荡12h后将树脂滤出，滤液定容于100 mL容量瓶，测定滤液中总黄酮浓度。将吸附平衡的树脂用蒸馏水洗涤后放入锥形瓶中，加入95%乙醇80 mL, 25°C，100r/min振荡12 h进行洗脱，然后将树脂滤出，滤液定容于100 mL容量瓶，测定洗脱液中总黄酮浓度，计算总黄酮吸附量，解吸率。
[0022]吸附量和解吸率按下面公式计算:
Q=(C1V1-C2V2) / V0
R=C3XV3/ QXV1
其中，Q-吸附量(mg/mL) ;R-解吸率(％) ;C1_吸附前溶液中总黄酮的浓度(mg/mL)；C2-吸附后样品液中总黄酮的浓度(mg/mL) ;C3_洗脱液中总黄酮浓度(mg/mL) ；V0-树脂体积(mL) ；V1-样品液体积(mL) ；V 2-吸附液体积(mL) V3-洗脱液体积(mL)。
[0023]3、动态吸附-解吸附实验方法具体为:取预处理好的大孔树脂装柱(树脂柱体积20mL，固定径高比1:6)，加入2.88mg/mL的提取液至流出液中显色反应呈阳性，静置30min，用蒸馏水洗柱至无色，收集蒸馏水并测体积和吸光度。用80%乙醇进行洗脱至显色反应阴性，收集洗脱液测体积和吸光度，计算吸附量，解吸率。
[0024]吸附量(mg/mL)=(CJ1-C5isV5is-C7mV7m ) /V 解吸率(qZq)=CbiVbi/ (C± N1-Cm Nm-CymNym ) X 100%
其中，c±为上样液中黄酮浓度，V±为上样液总体积，Cm为过柱流出液中黄酮平均浓度，Va为过柱流出液总体积，(^|为蒸馏水洗脱下来的黄酮平均浓度，为洗脱的蒸馏水体积，Cs为乙醇洗脱下来的黄酮平均浓度，Vs为洗脱的乙醇总体积，V为树脂的体积，
实施例1: (1)提取:取秋茄叶粉碎成粗粉，取lOOOg，以体积分数60%的乙醇为提取剂，料液比1:15 (质量与体积比)，提取温度80 0C，提取时间0.5 h，提取2次；
(2)分离纯化:以HPD722大孔吸附树脂对步骤(I)获得的秋茄叶总黄酮进行纯化，具体纯化工艺为:上样总黄酮浓度为5.0 mg/mL,上样流速为3BV/h，上样量为6.5 BV树脂柱体积，吸附时间30 min,以3.5倍水冲洗除杂，洗脱剂为体积分数50%的乙醇，洗脱流速为3BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积，收集乙醇液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，得到黄棕色秋茄叶总黄酮粉末94.51g，总黄酮含量为77.58%。
[0025]实施例2
(1)提取:取秋茄叶粉碎成粗粉，取1000g，以体积分数70%的乙醇为提取剂，料液比1:15 (质量与体积比)，提取温度60 °C，提取时间1.5 h，提取2次；
(2)分离纯化:以HPD722大孔吸附树脂对步骤(I)获得的秋茄叶总黄酮进行纯化，具体纯化工艺为:上样总黄酮浓度为5.0mg/mL，上样流速为2.5BV/h，上样量为6BV树脂柱体积，吸附时间30 min,以3.5倍水冲洗除杂，洗脱剂为体积分数35%的乙醇，洗脱流速为4BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积，收集乙醇液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，得到黄棕色秋茄叶总黄酮粉末93.23g，总黄酮含量为75.11%。
[0026]实施例3
(1)提取:取秋茄叶粉碎成粗粉，取1000g，以体积分数70%的乙醇为提取剂，料液比1:15 (质量与体积比)，提取温度80 0C，提取时间0.5 h，提取2次；
(2)分离纯化:以HPD100大孔吸附树脂对步骤(I)获得的秋茄叶总黄酮进行纯化，具体纯化工艺为:上样总黄酮浓度为5.0mg/mL,上样流速为3BV/h，上样量为5.5 BV树脂柱体积，吸附时间30 min，以3.5倍水冲洗除杂，洗脱剂为体积分数50%的乙醇，洗脱流速为3BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积，收集乙醇液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，得到黄棕色秋茄叶总黄酮粉末85.51g，总黄酮含量为65.21%。
[0027]实施例4
(1)提取:取秋茄叶粉碎成粗粉，取1000g，以体积分数70%的乙醇为提取剂，料液比1:15 (质量与体积比)，提取温度80 0C，提取时间0.5 h，提取2次；
(2)分离纯化:以HPD826大孔吸附树脂对步骤(I)获得的秋茄叶总黄酮进行纯化，具体纯化工艺为:上样总黄酮浓度为5.0mg/mL,上样流速为2BV/h，上样量为4.5 BV树脂柱体积，吸附时间30 min，以3.5倍水冲洗除杂，洗脱剂为体积分数50%的乙醇，洗脱流速为5BV/h，洗脱剂用量为4 BV树脂柱体积，收集乙醇液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，得到黄棕色秋茄叶总黄酮粉末84.25g，总黄酮含量为64.51%。
[0028]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【权利要求】
1.一种高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，包括如下步骤: (1)取秋茄叶粉碎成粗粉，用15倍的60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取时间为0.5-1.5h，提取温度为60~80°C，合并提取液； (2)浓缩步骤(1)所得的提取液使其浓度为5mg/ml，离心，取上清液，用非极性大孔吸附树脂纯化，吸附30min，水洗除杂，再用35~80%的乙醇洗脱；所述非极性大孔吸附树脂为HPD722型、HPDlOO型、HPD826型吸附树脂中的一种或几种； (3)收集步骤(2)所得的洗脱液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，即得本品，所述本品中秋茄叶总黄酮的含量至少为60%。
2.根据权利要求1所述的高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，其特征在于:所述步骤(I)的提取时间优选0.5h，提取温度优选80°C。
3.根据权利要求1所述的高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，其特征在于:所述步骤(2)中非极性大孔吸附树脂优选HPD722型。
4.根据权利要求1所述的高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，其特征在于:所述步骤(2)上样流速为2~3BV/h，上样量为4.5-6.5BV。
5.根据权利要求1所述的高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，其特征在于:所述步骤(2)米用50%的乙醇洗脱。
6.根据权利要求1所述的高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，其特征在于:所述步骤(2)乙醇洗脱时的洗脱流速为3?6BV/h，洗脱液用量为3~5BV。
7.根据权利要求1所述的高纯度秋茄叶总黄酮的分离纯化方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)取秋茄叶粉碎成粗粉，用15倍的体积分数60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取时间为0.5h，提取温度为80°C，合并提取液； (2)浓缩步骤(I)所得的提取液使其浓度为5mg/ml，离心，取上清液，用HPD722型吸附树脂纯化，纯化时上样浓度为5mg/ml，上样流速为3BV/h，上样量为6.5BV ;吸附30min，用3.5BV蒸馏水洗去水溶性杂质，再用50%的乙醇洗脱，洗脱时的洗脱流速为3BV/h，洗脱液用量为4BV ； (3)收集步骤(2)所得的洗脱液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，即得本品，所述本品中秋茄叶总黄酮的含量大于70%。
【文档编号】A61K127/00GK104473981SQ201410725902
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】李成平, 唐岚, 饶桂维, 计燕萍, 徐兴, 严小平, 活泼 申请人:浙江树人大学