红树植物秋茄金属硫蛋白基因及其编码的序列的制作方法

专利名称：红树植物秋茄金属硫蛋白基因及其编码的序列的制作方法
红树植物秋茄金属硫蛋白基因及其编码的序列所属领域本发明涉及基因工程领域，利用分子生物学基因技术分离一种新的植物金属硫蛋白基因 及其所编码多肽，以及该基因的应用方法。技术背景1957年Margoshe和vajle首次在马肾中发现并分离出金属硫蛋白(metallothionein MT) (Margoshes, M.， Vallee, B, L., 1957. A cadmium protein from equine kidney cortex. J. Am. Chem. Soc. 79, 4813-4814)以来，科学家们相继在植物(Purdue University, West Lafayette, IN 47907. Regulation and function of metallothionein genes in plants)、 微生物以及海洋生物中发现和证明了具有相似结构和生理功能基本一致的金属硫蛋白 (Classification of Metallothionein' P.-A. Binz， J. H. R. K3gi， 1999)。到1997年第 四届国际MT会议止，共发现并确定氨基酸序列的MT有170多种(茹炳根.第四届国际金属 硫蛋白会议简介.生命科学，1998， 10(3): 157 15)。金属硫蛋白是一类低分子量、富含半胱氨酸、可吸附金属的特异蛋白质，(Viarengo， A., 1989. Heavy metals in marine invertebrates: mechanisms of regulation and toxicity at cellular level. Crit. Rev. Aquat. Sci. 1, 295-317)。到目前为此，金属硫蛋白被认 为有以下功能(1)调节细胞内微量金属离子的动态平衡；(2)保护有机生物体免受过多重金 属离子的伤害；(3)清除体内自由基；(4)贮存有机生物所必需金属离子，以备其它金属蛋 白的利用；(5)保护细胞免受细胞内过氧化的损伤(Karin, M., 1985. metallothioneins: proteins in search of function. Cell 41， 9_10; Hamer， D. H., 1986. Metallothioneins. Ann. Rev. Biochem. 55, 913-951)。金属硫蛋白研究已涉及农业、医药、生物化学、分子生 物学、环境科学、卫生毒理学、食品科学、营养学、保健科学和方法学等领域；除了可以开 发各种治疗药物、保健化妆品等外，还可以利用转基因金属硫蛋白生物进行重金属污染环境 的修复。植物金属硫蛋白到目前为止发现存在三种主要类型。用于此设计的为II型(plant metalllothionein type II),发现于红树植物木榄中，其cDNA克隆基因序列和氨基酸序列 见于序列表。根据半胱氨基酸的在金属硫蛋白分子中的分布规律，可以将植物金属硫蛋白序 列分成三个区域区域(1)中半胱氨的序列分布为SCCGGnCGCGsgCKCgnGCgGCKmy;区域(2) 序列中没有发现半胱氨酸的分布；区域(3)中半胱氨的序列分布为gCKCGsxC[kt]C[dn]PCxC。 半胱氨酸的分布规律序列为CC， CXC和CXXXC，两个保守序列区域(1)和(3)分布于分子 两端，形成哑铃状，富含巯基(-SH)，与哺乳动物金属硫蛋白分子中半胱氨基酸重复分布规 律一致。植物金属硫蛋白II型有十四个半胱氨酸(Cys),是目前发现在植物蛋白中含有巯基数目最多的类型。红树植物秋茄是东方红树林中的广普种之一，生活在富含多种重金属的河口、海湾和海 岸，能吸附大量金属离子于体内(Peters E.C. ， GassmanN.丄,Firman J. C. ， Richmond R.H., Power E. A.. Ecotoxicology of tropical marine ecosystems. Enviro. Toxicol. Chem.， 1997， 16: 12 40)，研究它的相关金属硫蛋白基因，对环境生态中重金属污染的净化具有重 要意义。 发明内容本发明通过从红树植物秋茄分离总RNA，合成第一链cDNA，再根据植物type II MT相对 保守的(1)和(3)区域中氨基酸序列设计简并引物，应用快速末端扩增(RACE)技术克隆 到秋茄金属硫蛋白的cDNA，该基因命名为KMT，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，所编码 的蛋白命名为週T，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。将秋茄金属硫蛋白的核苷酸序列及 其编码的氨基酸序列，在GenBank数据库中进行BLAST同源检索和比较，发现湖T是一种新 的植物typell金属硫蛋白。将秋茄金属硫蛋白的cDNA插入到pET100-T0P0表达载体上，将 重组子转化到大肠杆菌BL21，发现该转化子对重金属Zn2+、 Hg"和C(T具有抗性。因此，本发明的第一目的是提供从红树植物秋茄中克隆到的金属硫蛋白基因KMT以及由 此推断的氨基酸序列，这个基因可以转入生长速度快、生物量大、适应性强的生物中，培育 转基因金属硫蛋白生物，对重金属污染的环境进行修复。本发明的第二目的是提供利用载体表达所述金属硫蛋白基因BMA的方法。本发明将在下述方面产生有益效果将红树植物秋茄金属硫蛋白基因转入生长速度快、 生物量大、适应性强的生物中，培育转基因金属硫蛋白生物，对重金属污染的环境进行修复。


图l是秋茄金属硫蛋白(II)的氨基酸序列与其它植物type II MT的同源比较。type II protein)
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于本发明，但本发明不限于 下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子克隆实验指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条 件。实施例1:秋茄腿T的cDNA序列的克隆和测序 1. KMT的局部cDNA的扩增及测序 分离秋茄总RNA:称0.2克秋茄(嫩芽)于研钵中加入液氮，磨成粉末，并立即转入无RNase的2 ml离 心管中，加入lml植物RNA提取液，充分混匀，水平放置离心管；混合液乳化5 min后， 在室温中，13000rpm离心4 min。将上清液转入另一无RNase的2 ml离心管中；加入0. 2 ml 5 M NaCl于管中混匀，再加入0.6 ml的三氯甲烷，充分混匀后，在4 。C下，13000rpm离心 10 min;将上清液再转入无RNase的2ml离心管中，加等体积的异丙醇。混匀后，放置-20 。C 15 min后，在4 。C下；小心地废弃上浮液，其沉淀物用1 ml无RNase的75%的乙醇漂洗， 13000rpm离心1 min;倒掉上浮液，用40 u 1无RNasc DEPC水充分溶解RNA，并进一步纯 化，放入-70 。C备用。合成第一链cDM:根据试剂盒的要求和上述RNA的质量，其第一链cDNA合成体系与反应参数如下总RNA (5吗) 5 pi10mMdNTPmix 1 |il01igo(dT)12-l8(0.5吗) 1 pi2 , GSP 1 piDEPC-treated water 2 pi将上述溶液混合后，65'C反应5min,立即放入冰中5 min后加入10 XRT Buffer 2 pi25 mM MgCl2 4 (xl0.1MDTT 2^1RNaseOUT RNase Inhibitor (40UV1) 1混合后，在离心机上轻离，其后将管在45 'C下反应2 min，再加入l)il的反转录酶 (Superscript IIRT 200U4U)，在45 。C下反应60 min，其后在70 。C下反应15 min。将 管放入冰上，再加入l^d的RNaseH (40U4d)，在37 。C下20 min。放入-20 。C下保存备用。以第一链cDNA为模板，用一对简并引物——A: 5'- ATGWSITGYGGIGGIAAYTG-3' 为正向引物，B: 5'-RCAIKTRCAIGGRTYRCAIKTRCA-3'为反向引物(其中W=A/T; S=G/C; Y=C/T;R=A7G;K=G/T)，进行PCR扩增。PCR条件为94 'C预变性4 min; 94 。C变 性40s; 58 °C退火40s; 71 。C延伸1. 5 min;循环40次；最后72 。C延伸10 min。将目的 片段与pUCm-T载体(TaKaRa)连接，转化大肠杆菌DH5 a ，送上海生物技术服务有限公司测 序。2. RACE反应根据试剂盒RACE (Invitrogen)的要求，以上述的核苷酸序列为对象设计3' -RACE特 异弓|物 (5'-GCCGAGAAGACCACTACCGAG-3')禾卩5' -RACE 的特异引物(5'-AACCAGAGTCTCGGTGGTGGTCTT-3')，分别进行RACE反应，其PCR扩增程序， 3'-RACE为94 。C预变性2 min; 94 。C变性30s; 55 。C退火30s; 72 。C延伸1.5 min;循 环35次；最后72 。C延伸7 min。 5'-RACE为94 'C预变性2 min; 94 。C变性30s; 72 。C， 1.5min，循环5次；94 。C变性30s， 70 。C， 1.5min，循环8次；94 。C变性30s， 68退火 30s; 71 。C延伸1.5min;循环30次；最后72 。C延伸7 min。分别将目的片段与pUCm-T载 体(TaKaRa)连接，转化大肠杆菌DH5 a ，送上海生物技术服务有限公司测序。结合3'-和5' -RACE的结果分析获得全长cDNA序列，共728 bp,其中开放阅读框位 于122-361位核苷酸，这一阅读框编码79个氨基酸残基。实施例2:同源比较用本发明的秋茄KMT的全长cDNA序列及其编码的蛋白，在GenBank+EMBL数据库中，用 BLAST程序进行核苷酸和蛋白同源检索。结果发现，在核苷酸水平上与蓖麻A i/7i^ca7m/"A (L02306)，软木橡树O;erc"s s"力er (AJ277599)，山毛榉Fagi/s sj^ra"ca (AY574281)， 豇豆K/g"a a/ 《""r/5 (AB176561)，模式植物拟南芥AraWoAsis (AY077669) 的同源性大于60%。在氨基酸水平上A:MT蛋白与上述植物金属硫蛋白的同源性分别为86%， 79%， 78%， 78%， 70% (同源比较见图1)。其蛋白序列中N-和C-端分别包含8和6个半胱氨 基酸残基，并以Cys-Cys, Cys-X-Cys和Cys-X-X-Cys形式分布，因此，MT是一种新的植 物type II金属硫蛋白。实施例3:秋茄AMT在大肠杆菌中的表达1. 重组DNA工程菌的构建实例在该实施例中，以实施例l中全长cDNA为标准，设计正向引物5'-CACCATGTCTTG CTG TGG TGG AAA CTG T -3 '和反向引物5'- TCA TTT GCA CGT GCAAGG GTC GCA -3'进行訂- 01^反应，扩增KMT的开放阅读框序列。根据试剂盒(Champion. pET Directional TOPO Expression Kits,购自Invitrog-en)的要求，将扩增的片段插入到 pETlOO-T0P0表达载体上，该质粒载体编码抗生素性(Ampr)、 一个IPTG-可调启动子/操纵子 (P/0)、 一个核糖体结合位点(RBS)、 一个6X组氨酸标记物。质粒用热激法转入100 W感 受态大肠杆菌(BL21)中并在具有Amp的LB固体培养基中37 'C培养过夜。为了确定秋茄KMT 的存在，挑选白斑菌落制备质粒，并用上述引物进行PCR，琼脂糖电泳分析，秋茄MT基因分 子大小为240 bp。2. 菌种培养及重金属抗性实例从培养皿菌落中选择具有AMT基因的菌种培养于含有Amp (100 Pg/ml)的100 ml LB培 养液，在温度为37'C的摇床中(200 rpm)培养至OD,达到0. 5-0. 8，加入IPTG诱导物(终 浓度为1.0mM)，涂布在分别含有不同浓度的Zn24、 CiA Pb2+、 Hg"和Ccf的LB固体培养基上， 在温度为25 'C的培养箱中培养2天(设对照组即不含^MT基因的菌种)。根据培养皿中菌落生长状况可以得出，对照菌种在Zn"浓度为1000 ^M的培养基中已不 能生长，而具有AMT的菌种能正常生长；对照菌种在Hg"浓度为80 的培养基中不能生长， 而具有MT的菌种能在浓度高达120 pM的培养基仍正常中生长，对Hg2+表现出强抗性。对照 菌种在CcT浓度为1000 时已不能生长，而具有AMT的菌种在浓度为2000 pM培养基中 仍能正常生长；而对重金属Cu"和Pb2+，对照菌种和具有，T的菌种的表达无差异。序列表<110>中国科学院南海海洋研究所〈120〉红树植物秋茄金属硫蛋白基因及其编码的序列<160〉2<210〉1<211>728<212>腿<213〉秋茄树(Aa"oWia ca"ofe7)〈220〉<221〉CDS<222〉 (122)…(361) 〈400>1ggacEictgac3tggELCtgaaacactcattcactctcaaacatcttatctcct60agtcctctcc3CCCCCCgCCcccaagt8a￡L3C6iaBgCcctctactgaa120aatgtcttgctgtggtggaaactgtggttgcggatcgggctgceigttgcggCElgCggCtg180tggagggtgcaagatgttcccagatetgagcttagctgagccgagactct240ggttcttggcgtggcgcccgaaaggggccaccttgaatgagccgtaaatgggcgtgccggc300cgaaaacggaggctgcgtatgcggcagcaactgcacctgcgacccttgcacgtgcaaatg360gtctgatctttttcaatccacggaccaaag420atgtcgccttgtgtcatgata t & t a t a t atgtttgttgggtgtcttgtct480acaataaaccagtaatgccttgcgtttcctgcatgagcagatcttaggatttccttccgt540ttctccaagcttttcagtgtctggtttccctgtattag犯ggatattttattactgtata 600tgaatgatcggagtgcttccgcctatttcgttcgtctaaatat已cgtggttccgactctt660tatttt"ttatgagcctaattgaaactcctttcttcteaaa720728<210〉2<211>79<212〉PRT<213〉秋茄树(kandelia candel)Met Ser Cys Cys 1Cys Gly Asn GlyPhe Ala Glu LysPro Glu Arg AlaGlu Asn Gly GlyCys Thr Cys Lys 79Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ala Ser Cys Lys510 15Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Met Gly20 25 30Thr Thr Thr Glu Thr Leu Val Leu Gly Val Gly3540 45His Phe Glu Gly Ala Glu Met Gly Val Pro Ala50 55 60Cys Lys Cys Gly Ser Asn Cys Thr Cys Asp Pro65 70 759
权利要求
1.一种从红树植物秋茄中分离的金属硫蛋白基因，所述的基因具有SEQ ID NO.1的第122位到361位碱基对。
2. 根据权利要求l所述的基因编码的金属硫蛋白，其具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列。
3. —种在大肠杆菌中表达秋茄金属硫蛋白基因的方法，其包含将权利要求l的分离的 金属硫蛋白基因DNA分子与表达载体连接，转化到宿主体屮，培养转化体，诱导表达。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述的表达载体是pET100-TOPO。
5. 根据权利要求3所述的方法，其中所述的宿主体是大肠杆菌。
全文摘要
本发明提供一种红树植物木榄金属硫蛋白及其编码的序列，该cDNA序列编码蛋白含有SEQ ID NO.1的第89位到328位碱基对，属于一种新的植物type II金属硫蛋白。本发明还涉及该核苷酸的分离方法和bMT蛋白在大肠杆菌中的表达。将编码bMT的DNA序列重组到质粒载体pET-100TOPO并转化到大肠杆菌BL21中，在分别含有不同浓度重金属的LB培养基中进行抗性研究。具有bMT的菌种能抵抗一定浓度的Zn²⁺和Cd²⁺。金属硫蛋白研究成果涉及农业、医药、生物化学、分子生物学、环境科学、卫生毒理学、食品科学、营养学、保健科学和方法学等领域；可以开发各种治疗药物、保健化妆品等外，还可以利用转基因金属硫蛋白生物进行重金属污染环境的修复。
文档编号C12N15/70GK101250533SQ200810027228
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月3日 优先权日2008年4月3日
发明者孙翠慈, 张凤琴, 王友绍 申请人:中国科学院南海海洋研究所