一种喜树碱纳米凝胶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以PLGA包裹抗银屑病药物喜树碱作为纳米系统的核，将PAMAM包裹在PLGA表面作为纳米系统的壳，采用乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米系统，并用油酸(OA)进行修饰，得到经表面改性的核壳纳米给药系统。并且进一步地，以羟丙甲基纤维素(HPMC)为基质，制备喜树碱纳米凝胶(CPT-PPO gel)。经过油酸修饰的CPT-PPO gel可以显著提高药物皮肤吸收和滞留，而不增加皮肤渗透量，从而不增加药物进入血液循环的量，能有效降低药物的全身毒性，是一种优秀的喜树碱局部治疗的新剂型。
【专利说明】一种喜树碱纳米凝胶
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种喜树碱纳米凝胶以及其制备方法，属于制药领域。
【背景技术】
[0002] 银肩病（俗称牛皮癣），是一种慢性、复发性、增殖性表皮疾患，是一公认的皮肤 顽疾。临床外用治疗常使用喜树碱及其它激素类药物，但由于皮肤吸收能力差、毒性大，往 往给患者带来极大的不便，达不到理想的治疗效果。近年来，新型给药系统特别是以纳米载 体为基础的给药系统的发展，为皮肤相关疾病的治疗提供了更多的选择和机会。建立在纳 米系统基础上的药物载体可以熟练地控制药物缓慢等时释放，建立皮肤储库在局部皮肤发 挥效应。另外，纳米粒径的药物由于粒径小，因此可以在药物停留、专一靶向性方面达到更 好的效果，可以提高给药效率降低刺激性和毒性，同时也提高了患者的依从性。如固体脂质 纳米粒（SLN)、纳米结构脂质体（NLC)以及脂质体，在研宄和实验中都表现出了很好的皮肤 渗透性。但是这些药物有限的载药量和相对稳定性的问题，导致其用于临床应用受到了限 制。而聚合物纳米粒子，如聚（ε-己内酯）、聚丙烯亚胺（PPI)、壳聚糖、聚乳酸（PLA)等 则显示出了良好的局部用药潜力。这些聚合物纳米粒子通过修饰来减少药物与皮肤直接接 触的刺激以达到可控性和持续释放的优点。PLGA是一种生物相容性好的聚合物材料，基于 PLGA的聚合物纳米粒已经被广泛的用于生物医药领域，它具有生物相容性好、毒性低、易被 水解等优点。通过表面修饰阳离子聚合物以及加入化学促渗剂可以增加纳米粒的稳定性 和透皮效果。聚酰胺胺（PAMM)是一种人工合成的阳离子聚合物，分子高度分枝，呈单分散 性，其末端氨基丰富，正电性强，并易于修饰连接生物活性物质以改变载体高分子性质，有 相关研宄表明聚酰胺胺具有良好的促进皮肤渗透的作用。通过PAMM表面修饰PLGA不仅 可以增加 PLGA包裹药物（如喜树碱）的稳定性，PAMM表面的自由氨基还可以接枝化学促 渗剂（如油酸）进一步打开皮肤角质层同道，提高皮肤递送效果。
[0003] 纳米凝胶是聚合物通过物理或化学交联的方式形成的纳米粒径的网状结构，它的 优点是可以增加皮肤的滞留时间，增加药物的有效负载。本实验将喜树碱制备成纳米凝胶 剂，以提高药物经皮渗透量及皮肤滞留量，为喜树碱新型纳米凝胶剂型的开发研宄提供实 验依据。
[0004] 本发明提供一种新型喜树碱纳米凝胶，以PLGA包裹抗银肩病药物喜树碱作为纳 米系统的核，将PAMM包裹在PLGA表面作为纳米系统的壳，采用乳化溶剂挥发法制备载喜 树碱纳米系统，并用油酸（OA)进行修饰，得到经表面改性的核壳纳米给药系统。并且进一 步地，以羟丙甲基纤维素（HPMC)为基质，制备喜树碱纳米凝胶（CPT-PPO gel)。经过油酸修 饰的CPT-PPO gel可以显著提高药物皮肤吸收和滞留，而不增加皮肤渗透量，从而不增加药 物进入血液循环的量，能有效降低药物的全身毒性，是一种优秀的喜树碱局部治疗的新剂 型。
【发明内容】
[0005] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明设计了一种新型喜树碱纳米凝胶，以PLGA 包裹抗银肩病药物喜树碱作为纳米系统的核，将PAMM包裹在PLGA表面作为纳米系统的 壳，采用乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米系统，并用油酸（OA)进行修饰，得到经表面改 性的核壳纳米给药系统。
[0006] 并且进一步地，以羟丙甲基纤维素（HPMC)为基质，制备喜树碱纳米凝胶（CPT-PP0 gel) 〇
[0007] 对其含量、理化性质和体外透皮特性进行考察，结果表明，经过油酸修饰的 CPT-PPO gel可以显著提高药物皮肤吸收和滞留，而不增加皮肤渗透量，从而不增加药物进 入血液循环的量，能有效降低药物的全身毒性，是一种优秀的喜树碱局部治疗的新剂型。
[0008] 具体而言，本发明提供一种载喜树碱纳米粒，其制备方法为：
[0009] (1)将喜树碱溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合；
[0010] ⑵由乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米粒，并用油酸（OA)进行修饰。
[0011] 所述步骤⑵的方法优选为：
[0012] 取IOmg步骤⑴获得的含有喜树碱的PLGA，将其溶解在1.5ml二氯甲烷中 得到的溶液作为有机相，将有机相加入到14. 5ml 0. 1 % (W/V) PVA、4ml0. 5 % PAMM与 1.5ml吐温80的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均浆机搅拌 151^11(35000印111)使之形成纳米乳 ；挥干有机相，加入100以11%(1/￥)三磷酸钠〇1^)交 联，然后在300rpm下搅拌2h后悬浮于磷酸盐缓冲液（pH8. 0)中，与油酸（OA)温育2h。
[0013] 本发明进一步还提供了一种喜树碱纳米凝胶，其制备方法为：
[0014] 将HPMC逐滴加入至不断搅拌的上述获得的喜树碱纳米粒水溶液中直至完全形成 凝胶，室温稳定24h备用。
[0015] 本发明所用仪器与材料：
[0016] 仪器
[0017] BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），DZF-6090真空干燥 箱（上海一恒科学仪器有限公司），F6-10超细匀浆机（规格：145W)，IKA磁力搅拌器， UPWS-I-5T超纯水器（杭州永洁达净化科技有限公司），FI-IR红外光谱仪（美国瓦里安公 司），TDL-60B低速台式离心机（上海安亭科学仪器），SHZ-B水浴恒温振荡器（上海博讯实 业有限公司医疗设备厂），ADVENCE 400M核磁共振仪（美国瓦里安公司），LC3000型高效液 相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司），2010透射电镜（日本JEOL公司），TK-12A型透皮 扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司），Zeta sizer ZS90粒度分析仪（英国Malvern 公司）。
[0018] 药品和试剂：
[0019] PLGA(济南岱罡生物工有限公司，分子量1.5万），聚乙烯醇（PVA)(常州市天怡工 程纤维有限公司），PAMM(G3. 0,威海晨源化工新材料有限公司），喜树碱标准品（中国药品 生物制品检定所），喜树碱（CPT)(梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，分子量348. 36)， 油酸（OA)(西格玛公司），羟丙甲基纤维素（HPMC，济南岱罡生物工有限公司），美国联合碳 化干型透析袋（MD34-70MW: 7000D)，除色谱用试剂为HPLC级，其他试剂均为分析纯。
[0020] 本发明喜树碱含量测定方法：
[0021] 色谱条件
[0022] 色谱柱：C18色谱柱（5 μπι，250mmX4. 6mm);流动相：甲醇 / 水（70/30, V/V);检测 波长：254nm ;流速：1. Oml · miiT1;进样体积：20 μ 1。此条件下喜树碱对照品溶液和样品溶 液的HPLC图见附图1所示。
[0023] 标准曲线的制备和方法学研宄
[0024] 对照品溶液的制备：精密称取CPT对照品3mg，置于IOOml容量瓶中，加入适量甲 醇超声溶解并稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液〇. l、〇. 2、0. 4、 0. 8、1. 2、1. 6、2. Oml置于IOml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，制得质量浓度为0. 3、 0. 6、1. 2、2. 4、3. 6、4. 8、6. 0 μ g · πιΓ1的CPT对照品溶液。将不同浓度的溶液分别进样 20 μ 1，按前述色谱条件进行测定。以峰面积（Y)为纵坐标，进样浓度（X)为横坐标，进行 回归分析，得到喜树碱的标准曲线方程Y = 594. 43X+339053，R = 0. 9999,结果表明CPT在 0.3?e.Oyg^mr1时，峰面积与进样量呈良好线性关系。精密度、重复性、稳定性试验的 RSD均小于3. 0%，符合方法学要求。
[0025] 本发明的有益之处在于：
[0026] 本发明通过改性乳化溶剂挥发法制备了载有喜树碱的纳米凝胶，此凝胶作为一种 新型药物，具有一定的载药量，可显著增加药物皮肤滞留量，减少药物经皮的渗透，从而延 长药物的作用时间，满足局部治疗的要求，是一种新型的局部外用的新剂型。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为本发明色谱条件下喜树碱对照品溶液和样品溶液的HPLC图：
[0028] . A:喜树碱对照品；B:喜树碱标准品。
[0029] 图2为CPT-PPO透射电镜照片。
[0030] 图3为CPT-PPO和CPT-PP纳米凝胶体外药物释放透曲线。
[0031] 图4为CPT，CPT-PP和CPT-PPO纳米凝胶24h药物单位累计透皮量（η = 5， mean土SD, **:ρ〈0· 01)。
[0032] 图5为CPT，CPT-PP和CPT-PPO纳米凝胶的皮肤滞留量。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1喜树碱纳米粒极其凝胶的制备：
[0034] 空白及载药纳米粒的制备：
[0035] PLGA-PAMAM-OA (PPO)纳米粒是由乳化溶剂挥发法制备，取IOmgPLGA溶解在I. 5ml 二氯甲烷中得到的溶液作为有机相，将有机相加入到14.5ml 0.1% (W/V)PVA、4ml 0.5% PAMAM与I. 5ml吐温80的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均浆 机搅拌15min(35000rpm)使之形成纳米乳。挥干有机相，加入ΙΟΟμΙΙ% (W/V)三磷酸钠 (TPP)交联，然后在300rpm下搅拌2h后悬浮于磷酸盐缓冲液（ρΗ8.0)中，与油酸（OA)温育 2h，即得到空白的纳米粒ΡΡ0,未修饰的PLGA纳米粒（PLGA-PAMAM)参照上述方法制备。
[0036] 载喜树碱载药纳米粒CPT/PLGA-PAMAM-OA (CPT-PPO)制备方法为：首先将喜树碱 溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合，后续步骤参照空白纳米粒制备方法。
[0037] CPT-PPO的电镜形态观察
[0038] 采用磷钨酸负染法，将CPT-PPO稀释至适当浓度，滴于300目铜网表面，5?6min 后用滤纸吸去多余液体，加入1滴I %磷钨酸溶液（pH 7. 0)染色5min，滤纸吸去多余液体， 晾干后将此铜网置透射电子显微镜下观测并拍照，电镜检测结果见附图2,纳米粒大部分成 规则的球形，外观圆整，大小均勾，纳米粒之间无粘连。
[0039] 包封率的测定
[0040] 取3批制备好的载药凝胶，在2000rpm · rnirT1条件下用超滤管超滤15min，将沉淀 用二氯甲烷溶解，过滤，滤液按照样品溶液处理方法制备成供试品溶液，按前述色谱条件测 定，计算3批样品中喜树碱的含量，计算得到的量代入公式（1)计算包封率。所制得的喜树 碱纳米粒包封率为78. 7±6. 9%。
[0041]
【权利要求】
1. 一种载喜树碱纳米粒的制备方法，其特征在于其步骤如下： 将喜树碱溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合； (2)用乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米粒，并用油酸进行修饰。
2. 权利要求1所述的载喜树碱纳米粒的制备方法，所述步骤（2)的方法为： 取l〇mg步骤（1)制得的含有喜树碱的PLGA，将其溶解在1. 5ml二氯甲烷中得到的溶液 作为有机相，将有机相加入到14. 5 ml 0. 1% (W/V)PVA、4 ml 0. 5%PAMAM与1. 5 ml吐温80 的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均衆机以35000 rpm的转速搅 拌15 min使之形成纳米乳；挥干有机相，加入100 W1% (W/V)三磷酸钠交联，然后在300 rpm下搅拌2 h后悬浮于pH8. 0的磷酸盐缓冲液中，与油酸温育2 h。
3. 权利要求1-2所述方法制备得到的载喜树碱纳米粒。
4. 一种喜树碱纳米凝胶的制备方法，其特征在于其步骤为： (1) 将喜树碱溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合； (2) 用乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米粒，并用油酸（0A)进行修饰； (3) 将HPMC逐滴加入至不断搅拌的步骤（2)得到的纳米粒水溶液中直至完全形成凝 月父，室温稳定24 h。
5. 权利要求4所述的喜树碱纳米凝胶的制备方法，所述步骤（2)的方法为： 取l〇mg步骤（1)制得的含有喜树碱的PLGA，将其溶解在1. 5ml二氯甲烷中得到的溶液 作为有机相，将有机相加入到14. 5 ml 0. 1% (W/V)PVA、4 ml 0. 5%PAMAM与1. 5 ml吐温80 的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均浆机搅拌15 min使之形成 纳米乳；挥干有机相，加入100K 11% (W/V)三磷酸钠交联，然后在300 rpm下搅拌2 h后悬 浮于PH8. 0的磷酸盐缓冲液中，与油酸温育2 h。
6. 权利要求4-5所述的制备方法制备得到的喜树碱纳米凝胶。
【文档编号】A61K31/4745GK104490764SQ201410725690
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】王翔, 陈杨, 张梁宇 申请人:中国人民解放军第九八医院