去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法

专利名称：去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌代谢产物，尤其是涉及一种利用新的工艺方法对菌株A-l-2-3代谢 产生的化合物去乙酰菌株环氧乙酯进行分离纯化和制备的方法。
背景技术：
菌株A-l-2-3是一株拟茎点霉(P/wwo;w&sp.)，该菌株分离于福建省漳州市九龙江口浮宫 镇草埔头村红树林生态区红树植物秋茄叶子(杨丽姗，红树植物内生菌株生物活性及菌株 A-l-2-3次级代谢产物的初步研究[D]，厦门厦门大学，2006)。菌株A-l-2-3在20。/。海水配方 马铃薯琼脂培养基(PDA)上，生长良好，菌丝纯白，无明显色素产生，不产孢子，发酵时 间为14天。

发明内容
本发明的目的在于提供一种去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法。
所述去乙酰真菌环氧乙酯是菌株A-l-2-3代谢产生的化合物，所述菌株A-l-2-3是一株拟 茎点霉(i^wno戸/ssp.)，菌株A-l-2-3为一株拟茎点霉(P/wwo戸^sp.)，该菌株已保藏于中 国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏编号为CCTCCNO: 206060。保藏询培养物名称及 注明的鉴别特征为拟茎点霉(尸/wwo/7^y sp.)，保藏日期为2006年6月26日。
所述去乙酰真菌环氧乙酯的分子式为d4Hw04，结构式为
其中，1 4为14个碳原子，该化合物含有l个酯羰基，12个次甲基，l个甲基；其中12个 次甲基包括6个不饱和次甲基，6个饱和次甲基。
该化合物分子量为246，其化学名为2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧 -3,6-二氢-27/-吡喃酮，为一白色羽状或棒状透明晶体，易溶于甲醇；其体外有较好的抗肿瘤 活性，对Raji细胞的半数抑制浓度IC5o为3.0 jig/mL。本发明所述去乙酰菌株环氧乙酯的制备方法，包括以下步骤
1) 发酵提取物的预处理菌株A-l-2-3发酵产物加入1 2倍的乙酸乙酯提取，收集提 取液，在40 45t:减压浓缩至膏状，将膏状粗提物用甲醇溶解，过滤，再次减压浓缩，得粗 提物浸膏；
2) 反相硅胶柱层析分离将歩骤l)中得到的粗提物浸膏为上样样品，进行反相硅胶柱 层析，首先用丙酮充分洗出残留在硅胶中的杂质，再用含甲醇为0 15%的甲醇-水溶液平衡， 流速为20 25ml/min;
3) 取粗提物浸膏用甲醇溶解，湿法上样，以甲醇-水溶液为流动相，进行洗脱，分管收 集洗脱液；
4) 合并洗脱液中含有去乙酰菌株环氧乙酯的组分，减压浓縮至干，进行结晶试验，采用 静态溶析结晶方法和动态溶析结晶方法对去乙酰菌株环氧乙酯进行结晶；
5) 通过过滤将晶体与结晶残液分离，用蒸馏水洗涤晶体，晶体用丙酮溶解进行重结晶， 得纯化的去乙酰菌株环氧乙酯。 在步骤l)中，所述菌株A-l-2-3发酵产物是菌株A-l-2-3在含20c/。海水的PDA培养基 上发酵14天得到的，发酵温度为28°C。
在步骤2)中，所述反相硅胶可采用德国Merck公司生产的Silica gel 60 RP-18反相硅胶， 所述用丙酮充分洗出残留在硅胶中的杂质的洗脱流速最好为20 25ml/min，洗脱的时间最好 为30 40 min。
在步骤3)中，所述甲醇-水的体积比最好为(25 : 75) (35 : 65)，所述洗脱的流速最 好为15 30ml/min。
在步骤4)中，所述静态溶析结晶方法为用丙酮溶解反相柱层析后浓縮的样品，再加入 丙酮体积一半的蒸馏水作为反溶剂，室温下静置24 48h后收集晶体。所述动态溶析结晶方 法为在搅拌速度为100~150rpm，温度为15 35。C条件下，蒸馏水以0.5 2.5 ml/h的流速 导入至含去乙酰菌株环氧乙酯的丙酮溶液中，2 4h后停止搅拌，静置24 48h后收集晶体。
在步骤5)中，所述重结晶的方法为加入丙酮体积一半的蒸馏水作为反溶剂，静置后收 集晶体。
对反相层析合并后浓縮的样品通过HPLC检测分析，通过制作去乙酰菌株环氧乙酯浓度 标准曲线计算样品的回收率和纯度。
通过薄层层析(TLC)定性和HPLC定量分析，确定分离纯化的化合物为去乙酰菌株环 氧乙酯，通过采用RP-ds直接洗脱一溶析结晶一重结晶一 (结晶残液)RP-ds分步洗脱的工艺路线，去乙酰菌株环氧乙酯的总回收率为87.7%，产品经HPLC分析纯度达到99X以上， 去乙酰菌株环氧乙酯的高效液相色谱图如图1所示，其保留时间为6.卯3min。
本发明所述工艺路线，适合去乙酰菌株环氧乙酯的大量制备，步骤简便且易操作，回收 率较高，可以实现工业化大量制备。


图1为去乙酰菌株环氧乙酯的高效液相色谱图。在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐 标为紫外吸收强度(mAU);去乙酰菌株环氧乙酯的保留时间为6.903min。
具体实施例方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。 实施例1
用丙酮充分洗出残留在硅胶中的杂质，再用甲醇为0 15%的甲醇-水溶液平衡，流速20 25ml/min。取等量三分粗体物样品各11.2g，用甲醇溶解，湿法上样。分别选择甲醇-水体积 比为(25 : 75) (35 : 65)进行实验，分管收集洗脱液，每管200 240ml。 TLC检测后合 并洗脱液中含有去乙酰菌株环氧乙酯的组分，至旋转蒸发器40 45。C减压浓縮后取样HPLC 定量分析，发现甲醇-水体积比为30 : 70对去乙酰菌株环氧乙酯的选择性较高，收率为97.9%， 纯度为65.9%。
减压浓縮后的样品进行静态溶析结晶实验，用适量丙酮溶解反相后的样品，再加入丙酮 体积一半的蒸馏水作为反溶剂，室温下静置24 48h后收集得到透明棒状晶体，取1 2mg 晶体于HPLC检测，纯度为92.2%。其余晶体用蒸馏水洗漆3 4次后按同样的方法重结晶， 重结晶24 48h后收集晶体并用蒸馏水洗涤1 2次，同样取l 2mg晶体于HPLC检测，纯 度为99.9%。结晶残液经反相柱层析分步洗脱，结晶，重结晶回收去乙酰菌株环氧乙酯。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于通过动态溶析结晶的方法对去乙酰菌株环氧乙酯进行纯化， 同时考察影响溶析结晶的各种因素。
动态溶析结晶是利用磁力搅拌器搅拌并匀导入反溶剂(蒸馏水)，搅拌速度为100 150 rpm，温度为15 35。C，反溶剂以0.5 2.5 ml/h的流速导入至含去乙酰菌株环氧乙酯的丙酮 溶液中，2 4h后停止搅拌和反溶剂的导入，室温下静置24 48h后收集晶体。实验结果发 现在搅拌速度为100rpm，温度为15"C，溶剂流加时间为3h的条件下较为适合去乙酰菌株环 氧乙酯的动态溶析结晶。
实施例3
6与实施例l相似，其区别在于选择不同进料量进行4 6次实验，进料量范围为7.9 12.6g， 湿法上样，流动相为甲醇-水体积比30: 70，分管收集洗脱液，每管200 240ml， TLC检测 后合并含去乙酰菌株环氧乙酯的组分，至旋转蒸发器40 45t减压浓縮后取样经HPLC定量 分析，发现进料量为7.9g时去乙酰菌株环氧乙酯的收率为95.0%左右，纯度达85%。
实施例4
与实施例l相似，其区别在于流动相选择4 6组流速实验，流速范围15 30ml/min， 进料量7.9g，流动相为甲醇-水体积比30 : 70， TLC检测后合并含去乙酰菌株环氧乙酯的组 分，至旋转蒸发器40 45'C减压浓縮后取样经HPLC定量分析，发现流动相流速为20ml/min 时去乙酰菌株环氧乙酯的收率为93.6%，纯度达75.0%，较为理想。
权利要求
1.去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于所述去乙酰真菌环氧乙酯是菌株A-1-2-3代谢产生的化合物，所述菌株A-1-2-3是一株拟茎点霉(Phomopsis sp.)，所述去乙酰菌株环氧乙酯的分子式为C14H16O4，结构式为其中，1～4为14个碳原子，所述化合物含有1个酯羰基，12个次甲基，1个甲基；其中12个次甲基包括6个不饱和次甲基，6个饱和次甲基；所述化合物分子量为246，其化学名为2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃酮，为一白色羽状或棒状透明晶体，易溶于甲醇；其体外有较好的抗肿瘤活性，对Raji细胞的半数抑制浓度IC50为3.0μg/mL。
2. 如权利要求l所述去去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于包括以下步骤1) 发酵提取物的预处理菌株A-l-2-3发酵产物加入1 2倍的乙酸乙酯提取，收集提 取液，在40 45'C减压浓縮至膏状，将膏状粗提物用甲醇溶解，过滤，再次减压浓縮，得粗 提物浸膏；2) 反相硅胶柱层析分离将步骤l)中得到的粗提物浸膏为上样样品，进行反相硅胶柱 层析，首先用丙酮充分洗出残留在硅胶中的杂质，再用含甲醇为0 15%的甲醇-水溶液平衡， 流速为20 25ml/min;3) 取粗提物浸膏用甲醇溶解，湿法上样，以甲醇-水溶液为流动相，进行洗脱，分管收 集洗脱液；4) 合并洗脱液中含有去乙酰菌株环氧乙酯的组分，减压浓縮至干，进行结晶试验，采用 静态溶析结晶方法和动态溶析结晶方法对去乙酰菌株环氧乙酯进行结晶；5) 通过过滤将晶体与结晶残液分离，用蒸馏水洗涤晶体，晶体用丙酮溶解进行重结晶， 得纯化的去乙酰真菌环氧乙酯。
3. 如权利要求2所述去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于在步骤l)中，所述 菌株A-l-2-3发酵产物是菌株A-l-2-3在含20%海水的PDA培养基上发酵14天得到的，发酵温度为28°C。
4. 如权利要求2所述去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述 反相硅胶采用德国Merck公司生产的Silica gel 60 RP-18反相硅胶。
5. 如权利要求2所述去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述 用丙酮充分洗出残留在硅胶中的杂质的洗脱流速为20 25ml/min，洗脱的时间为30 40 min。
6. 如权利要求2所述去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述 甲醇-水的体积比为(25 : 75) (35 : 65)，所述洗脱的流速为15 30ml/min。
7. 如权利要求2所述去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述 静态溶析结晶方法为用丙酮溶解反相柱层析后浓縮的样品，再加入丙酮体积一半的蒸馏水作 为反溶剂，静置24 48h后收集晶体。
8. 如权利要求2所述去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述 动态溶析结晶方法为在搅拌速度为100 150rpm，温度为15 35'C条件下，蒸馏水以0.5 2.5 ml/h的流速导入至含去乙酰菌株环氧乙酯的丙酮溶液中，2 4h后停止搅拌，静置24 48h后收集晶体。
9. 如权利要求2所述去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述 重结晶的方法为加入丙酮体积一半的蒸馏水作为反溶剂，静置后收集晶体。
全文摘要
去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，涉及一种菌株代谢产物。提供一种去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法。菌株A-1-2-3为一株拟茎点霉(Phomopsis sp.)。去乙酰菌株环氧乙酯的分子式为C₁₄H₁₆O₄。发酵提取物预处理，得粗提物浸膏；将粗提物浸膏为上样样品进行反相硅胶柱层析，取粗提物浸膏用甲醇溶解，湿法上样，以甲醇-水溶液为流动相，进行洗脱，分管收集洗脱液；合并洗脱液中含有去乙酰菌株环氧乙酯的组分，减压浓缩至干，进行结晶试验，采用静态溶析结晶方法和动态溶析结晶方法对去乙酰菌株环氧乙酯进行结晶；通过过滤将晶体与结晶残液分离，用蒸馏水洗涤晶体，晶体用丙酮溶解进行重结晶，得纯化的去乙酰菌株环氧乙酯。
文档编号C12P17/18GK101665814SQ20091011235
公开日2010年3月10日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者周显凤, 宋思扬, 沈月毛, 郑忠辉, 黄耀坚 申请人:厦门大学