技术领域本发明涉及脂肪干细胞应用领域，具体地，本发明提供了一种脂肪间充质祖细胞用于治疗慢性阻塞性肺疾病的用途。
背景技术：
慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)是一种严重危害人类健康的常见病、多发病，严重影响患者的生命质量，病死率高，并给患者及其家庭以及社会带来沉重的经济负担。COPD影响全世界3亿多人，2005年，全球超过300万的人死于COPD。在我国，COPD的患病率约为2.5％。我国对245名成年人进行调查，结果显示40岁以上人群中慢阻肺的患病率高达8.2％。据“全球疾病负担研究项目”估计2020年慢阻肺将位居全球死亡原因的第3位。世界银行和世界卫生组织的资料表明，至2020年，慢阻肺将位居世界疾病经济的第5位。COPD的发病机制尚未完全明了，吸入有害颗粒或气体可引起肺内氧化应激、蛋白酶和抗蛋白酶失衡及肺部炎症反应。慢阻肺患者肺内炎症细胞以肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和CD8+T细胞为主，激活的炎症细胞释放多种炎性介质，包括白三烯B4、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，这些炎性介质能够破坏肺的结构和(或)促进中性粒细胞炎症反应。慢阻肺的气流受限常呈进行性发展，伴有气道和肺对有害颗粒或慢性炎症反应的增加。急性加重和合并症影响患者整体疾病的严重程度。慢阻肺目前尚不能根治，其稳定期与急性加重期处理方法不同。COPD稳定期的处理目标是减轻当前症状，降低未来风险。处于COPD稳定期的患者可进行腹式呼吸及缩唇呼吸锻炼并服用药物，支气管舒张剂(β2受体激动剂、抗胆碱药、茶碱类药物)是控制慢阻肺症状的主要治疗措施。短期按需服用可缓解症状，长期规则应用可预防和减轻症状，增加运动耐力，但不能使所有患者的FEV1得到改善。慢阻肺患者稳定期长期应用吸入激素治疗并不能阻止其FEV1的降低趋势。COPD急性加重期患者症状加重、肺功能恶化。此期的治疗目标为最小化急性加重的影响，预防再次急性加重的发生。可以选择支气管舒张剂、激素和抗生素治疗。现有的手段大多属于对症治疗，根据COPD诊治指南，现有的可行性治疗方法包括药物治疗、氧疗、康复治疗及外科治疗，但这些治疗手段仅仅可以减轻症状，阻止病情发展，改善生活质量，尚缺乏可以从根本上逆转疾病的方法。因此，患者与医师均期待一种新型、疗效可靠、不良反应不明显及经济的治疗方法。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它在一定的环境下能分化为多种功能细胞。一直以来，骨髓都是用作造血祖细胞组织来源的金标准，但随着研究与应用越来越多，骨髓来源的干细胞在临床使用的不足之处亦越发突显，如从采集到临床使用的过程耗时过长，采集骨髓对供体本身的伤害，培养成本较高，较低的HLA配型成功率等，制约了其在临床治疗中的广泛应用。综上所述，本领域迫切需要一种能够有效治疗慢性阻塞性肺疾病的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能够有效治疗慢性阻塞性肺疾病的方法。本发明的第一方面，提供了一种脂肪间充质祖细胞的用途，所述脂肪间充质祖细胞用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物组合物。在另一优选例中，在所述药物组合物中，所述的脂肪间充质祖细胞的浓度为脂肪间充质祖细胞的浓度为0.1～10×106个/ml，较佳地为0.2～5×106个/ml，更佳地为0.5～2×106个/ml。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是传代培养的脂肪间充质祖细胞。在另一优选例中，所述的组合物中，所述脂肪间充质祖细胞的含量为1×106/ml-1×108/ml。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是通过基质血管组分培养3-10代纯化扩增获得。在另一优选例中，在所述组合物中，主要活性成分仅为脂肪间充质祖细胞。在另一优选例中，所述的治疗指慢性阻塞性肺的病理症状改善。在另一优选例中，所述的治疗指减轻或逆转慢性阻塞性肺引起的肺病理改变。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是通过SVF培养P3-P10代纯化扩增获得的细胞。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有分化为骨，软骨和脂肪的能力。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞为表达选自下组的表面标记的脂肪间充质祖细胞：CD29、CD73、CD90、CD49d。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞为不表达选自下组的表面标记的脂肪间充质祖细胞：CD34、CD45、CD14、HLA-DR、Actin。在另一优选例中，所述的药物组合物包括：脂肪间充质祖细胞，和药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体为输液剂载体和/或注射剂载体，优选地选自下组：生理盐水、葡萄糖盐水，或其组合。在另一优选例中，所述的治疗包括选自下组的一项或多项指标改善：肺功能、气道炎症、生活质量评分。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：(i)90％以上的细胞具有表面抗原CD29；(ii)90％以上的细胞具有表面抗原CD73；(iii)90％以上的细胞具有表面抗原CD49d；(iv)90％以上的细胞具有表面抗原CD90。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD29。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD73。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD49d。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD90。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：(v)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD34；(vi)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD45；(vii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原Actin；(viii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；(ix)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD14。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD34。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD45。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD34。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD45。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原Actin。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD14。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原Actin。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD14。本发明的第二方面，提供了一种用于预防或治疗慢性阻塞性肺疾病的药物组合物，所述的药物组合物包括：有效量的脂肪间充质祖细胞，以及药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的载体是输液剂载体和/或注射剂载体。在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、生理盐水、葡萄糖盐水，及其组合。在另一优选例中，所述的药物组合物中，脂肪间充质祖细胞的浓度为0.1～10×106个/ml，较佳地为0.2～5×106个/ml，更佳地为0.5～2×106个/ml。在另一优选例中，所述的注射试剂的体积为10-1000mL，较佳地为100mL。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：(i)90％以上的细胞具有表面抗原CD29；(ii)90％以上的细胞具有表面抗原CD73；(iii)90％以上的细胞具有表面抗原CD49d；(iv)90％以上的细胞具有表面抗原CD90。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD29。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD73。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD49d。在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD90。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：(v)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD34；(vi)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD45；(vii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原Actin；(viii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；(ix)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD14。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD34。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD45。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD34。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD45。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原Actin。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD14。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原Actin。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD14。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有分化为骨，软骨和脂肪的能力。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是通过SVF培养P3-P10代纯化扩增获得的细胞。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是用含血清培养基培养纯化扩增的细胞，或所述的脂肪间充质祖细胞是用无血清培养基培养纯化扩增的细胞。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞还表达细胞因子，且所述的细胞因子选自下组：TGF-β1，HGF，VEGF，或其组合。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子TGF-β1的量为1000-1300pg/ml/106细胞。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子HGF的量为9000-10000pg/ml/106细胞。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子VEGF的量为700–800pg/ml/106细胞。在另一优选例中，所述的间充质祖细胞具有成软骨、成骨及成脂分化能力。在另一优选例中，所述的药物组合物为注射制剂，较佳地为静脉注射制剂。在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述的脂肪间充质祖细胞具有分化为骨，软骨和/或脂肪的能力。本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗慢性阻塞性肺疾病的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用脂肪间充质祖细胞，或如本发明第二方面所述的药物组合物。在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为鼠、兔、牛、羊、猪等。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1脂肪间充质祖细胞分化的油红O染色、阿辛蓝染色和茜素红染色实验图；图2油红O染色对照组(阴性)；图3haMPC流式检测试验图谱。具体实施方式本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，脂肪间充质祖细胞具有极其优异的预防或治疗慢性阻塞性肺疾病的作用。具体地，给需要的对象施用本发明的含有脂肪间充质祖细胞的药物组合物，对于慢性阻塞性肺疾病有显著的预防或治疗作用。在此基础上，发明人完成了本发明。术语如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95％以上”指≥95％，“0.2％以下”指≤0.2％。如本文所用，术语“脂肪基质血管成分”和“脂肪来源的基质血管成分”可互换使用。如本文所用，术语“脂肪间充质祖细胞”、“脂肪间充质干细胞”和“脂肪来源的间充质祖细胞”，“脂肪来源的间充质干细胞”可互换使用。脂肪自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织，包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。脂肪间充质祖细胞(Humanadiposederivedmesenchymalprogenitorcells)间充质祖细胞可以分泌广谱的具有免疫调节和/或再生活性的生物因子。在本发明中，优选地采用脂肪来源的间充质祖细胞(Humanadiposederivedmsenchymalprogenitorcells,haMPCs)。其中，一种最为优选的脂肪来源的间充质祖细胞为不含CD34+的细胞，通常通过SVF培养P3-P10代纯化扩增获得。在本发明中，脂肪间充质祖细胞的制备方法可以包括步骤：洗涤脂肪组织，然后用胶原酶消化，离心分离基质血管成分，除去油脂和胶原酶，培养原代细胞，得到传代后的脂肪间充质祖细胞。脂肪间充质祖细胞的抗原检测用本发明使用的脂肪间充质祖细胞具有很高的纯度，基本上不含有其他类型的细胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。脂肪间充质祖细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等。CD34抗原是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.2％，更佳地，≤0.1％。CD45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有CD45的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.1％。CD29、CD73、CD105、CD90等主要存在于脂肪间充质祖细胞表面。带有CD29的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥90％，更佳地≥95％。带有CD73的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥80％，更佳地≥85％。带有CD49d的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥70％，更佳地≥75％。带有CD90的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥70％，更佳地≥75％。本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪间充质祖细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的脂肪间充质祖细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将脂肪间充质祖细胞和脂肪基质血管成分配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为7-8。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。在本发明的优选实施例中，所述的有效量为：10±5×106个细胞。优选地，所述的有效量细胞一次性注射完毕。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括。在本发明中，可以使用的药学上可接受的载体并没有特别的限制，可以是一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的脂肪间充质祖细胞相互掺和，而不明显降低其治疗效果。本发明药学上可以接受的载体部分例子有生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末，适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。除了上述的常规载体外，也可以根据脂肪间充质祖细胞的性质设计优化的载体。所述的载体优选为输液剂载体和/或注射剂载体。本发明的药物组合物含有安全有效量的脂肪间充质祖细胞，脂肪基质血管成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明所述脂肪间充质祖细胞和脂肪来源基质血管成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。本发明的药物组合物优选为皮下或静脉注射试剂。在另一优选例中，所述的皮下或静脉注射试剂中，脂肪间充质祖细胞的浓度为0.1～10×106个/ml，较佳地为0.2～5×106个/ml，更佳地为0.5～2×106个/ml。所述的药物组合物的注射方式没有特别限制，可以是单次注射制剂，也可以是多次注射的制剂组合。在本发明的一种优选实施例中，所述的药物组合物为单次注射剂。在本发明中，所述的药物组合物优选为静脉注射制剂。本发明的主要优点：(1)提供了一种用于治疗COPD的脂肪间充质祖细胞复合物，所述的脂肪间充质祖细胞组合物施用后可以对COPD起到一定的治疗或逆转效果。(2)脂肪间充质祖细胞来源丰富、取材方便、免疫原性低，在临床应用具有广阔前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1脂肪间充质祖细胞的培养一、试剂和耗材1.无菌手术器械及耗材(1)无菌长柄手术镊子5把(2)无菌100目滤网(3)灭菌40目滤网(4)50ml离心管2.无菌试剂：(1)DMEM(基础培养基)、StemProMSCSFMCTS培养基(life)(2)I型胶原酶(现配现用)：0.1％胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培养基中，用之前37℃进行预热。(3)氯化钠注射液二.实施方案1.洗涤脂肪组织，除去血细胞。向离心管中加入20ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液变为清澈。2.分离基质血管组分(SVF)：加入等量新配制的预热的胶原酶Ⅱ溶液，37℃，200rpm，消化40～60分钟，将消化后的组织用无菌100目滤网过滤，室温1500rpm离心5分钟，得到的沉淀即为SVF。3.细胞培养：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。适量DMEM重悬细胞，细胞培养无血清，无抗生素的培养基中培养细胞，细胞融合达80％时传代细胞。培养至3-10代收获脂肪间充质祖细胞。4.细胞回输：将收获的细胞注入生理盐水，制备成细胞悬液,以备回输使用。三.结论:1.细胞分离培养实验结果经上述方法分离的细胞得率:5×105～1×106cells/ml脂肪细胞培养后，收获P3-P7代细胞，细胞量大于5×109。2.脂肪干细胞分化的免疫染色分析成脂诱导对照及油红O染色实验以实施例1所培养的细胞作为本发明组，进行成软骨、成骨、成脂分化能力测试。体外向软骨方向分化培养3-4周后阿辛蓝染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向软骨分化的能力(图1B)；体外向骨方向分化培养3-4周后茜素红染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向骨分化的能力(图1C)；体外向脂肪方向分化培养3-4周后油红O染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向脂肪分化的能力(图1A)。3细胞的流式检测通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为1×105cells/mL，1,800r/min(120g)离心5min，弃掉上清，用4℃的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800r/min，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至1mL，加入抗体5～10μL，避光，冰上放置30min。用D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2～3次，确保将未结合抗体除净。最后，加入约200至300μL的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测。haMPC流式检测结果I型胶原酶消化方法分离、培养的P3代细胞MSCs表面抗原流式鉴定结果如图3所示，流式检测试验图谱如下表2中所示表2流式检测试验图谱结论:该结果表明：通过流式细胞仪对脂肪间充质祖细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析该细胞纯度高，大部分为脂肪间充质祖细胞，其中CD34、CD45为间充质祖细胞的阴性标记。4脂肪间充质祖细胞表达细胞因子的检测实施例1中所培养的脂肪间充质祖细胞离心后重悬，调整细胞密度接种，48h后收集上清，检测细胞因子TGF-β1，HGF和VEGF，检测结果见下表。细胞因子TGF-β1HGFVEGF结果(pg/ml/106细胞)12569663747结论：该脂肪间充质祖细胞能够表达TGF-β1，HGF和VEGF。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。