一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体的制作方法

本发明涉及一种药物偶联体，尤其涉及一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体，属于生物医药化学领域。
背景技术：
：通常病变细胞的病理及生理特征都与正常细胞有显著不同，其中之一表现为病变细胞表面具有特异性或过度表达的物质(如：抗原，化学信号，受体等)，这些物质在正常细胞中无表达或低表达。抗体药物偶联体(ADC)，多肽-药物偶联体(PDC)，就是基于这一原理对疾病进行治疗的。目前虽已有一些药物上市或进入临床研究，但由于药物设计原理的原因，ADC和PDC药物在临床应用中均具有很大的局限性。ADC目前主要应用于在肿瘤治疗领域。其所使用的靶向抗体对肿瘤细胞表面抗原具有极高的亲和力10-9～10-12(Kd，mole/Liter),因此其与目标细胞高特异性结合的同时，对含有相同靶点的正常细胞也有较高的结合能力。同时由于ADC在体内的代谢时间较长(1-3周)，因此其在体内留存的时间内会不断地杀伤正常细胞，极大的增大了药物的毒副作用。因此其所适用的病症必须是肿瘤和正常细胞表面抗原数量悬殊极大的，而目前所知满足此要求的疾病很少。PDC在临床或临床前研究中用于治疗多种疾病，例如CN104248770A、及CN102397554B中均有揭示相应的多肽药物，但这些只是简单的把化疗药物与多肽连接，或在包埋了化疗药物的纳米颗粒或高分子材料里添加多肽，这样带来的缺点是，大部分多肽由于分子量较大及带电荷的性质导致其无法进入细胞，因 此目前此类PDC大多数只适用于胞外治疗，严重限制了PDC的应用范围和药效。肿瘤细胞和其他病变细胞(如血管内皮细胞、白细胞、脑毛细血管内皮细胞)表面存在着多种特异性或过表达受体，如铁蛋白受体(TFR)、密度脂蛋白受体、叶酸受体、低、尿酸激酶受体、肿瘤坏死因子受体，ICAM，整合素受体LFA-1等。这些受体的配体可分为蛋白类(铁蛋白、载脂蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白1即LRP1等)，多肽类(胰岛素、SOR-C13、黄体生成素释放激素LHRH、生长激素抑制素SST-14等)，小分子类(叶酸及类似物，糖类化合物)。这些配体与受体结合具有特异性好、亲和力适中和生物效应明显的特性，与治疗性药物偶联形成配体-药物偶联体(LDC)可以明显提高药物的靶向性和药效，同时降低毒性。其中蛋白类配体由于分子量大不易人工合成，且稳定性差。而多肽和小分子类配体分子量较小，可化学合成，化学修饰改善特性，在体内代谢较快，同时与受体亲和力适中10-6～10-9(mole/liter,Kd)，因此其在特异性地结合病变细胞的同时，对较低水平表达目标受体的正常细胞的杀伤力大大降低。但此类配体-药物偶联体在应用过程中仍存在很多有待解决的问题，如达不到治疗窗口所需的较强的亲和力，合适的半衰期和快速的细胞内吞。因此它们偶联常规化疗药物(如多柔比星，紫杉醇)时疗效低，偶联高效药物分子(如ADC常用的药物分子MMAE,DM1,等)后毒性大，未达到肿瘤治疗有效剂量就导致动物中毒死亡。因此需要通过改造LDC，使其可以作用于病变细胞表面广泛存在的较高表达受体，拓宽靶向范围和治疗窗口，增强药效、并避免药物副作用。技术实现要素：本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体，所述药物偶联体包括药物分子及与所述药物分子偶联的连接子，所述药物偶联体至少包括两个以上能与细胞表面受体特异性结合的配体，所述配体中至少包括有一个具有介导细胞内吞功能第一配体，至少一个所述配体与第一配体之间可选择性的与所述药物分子或所述连接子偶联形成药物偶联体。优选地，所述配体为多肽、叶酸或叶酸类似物，所述第一配体为叶酸、叶酸类似物或具有介导细胞内吞功能的多肽。优选地，所述配体与所述第一配体中的叶酸类似物均包括5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亚甲基四氢叶酸。优选地，所述配体中多肽的序列为Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，命名为P10。优选地，所述第一配体中多肽的序列为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名为P11。优选地，所述第一配体中多肽的序列为Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]，命名为P12。优选地，所述第一配体中多肽的序列为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名为P13。优选地，所述连接子为二肽序列的多肽类连接子、二硫键连接子或pH依赖型连接子。优选地，所述二肽序列为包含有缬氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸序列，所述二硫键连接子为DMDS、MDS、DSDM、NDMDS，所述pH依赖型连接子为顺乌头酸酐。优选地，所述多肽为序列与P10中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。优选地，所述多肽为序列与P11中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。优选地，所述多肽为序列与P12中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。优选地，所述多肽为序列与P13中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。优选地，所述第一配体为叶酸，配体为P10，连接子为MC-Val-Cit-PAB，药物分子为MMAE时，所述药物偶联体的结构式为：当第一配体为叶酸，配体为P11，连接子为MC-Val-Cit-PAB，药物分子为MMAE时，所述药物偶联体的结构式为：当第一配体为叶酸，配体为P12，连接子为MC-Val-Cit-PAB，药物分子为MMAE时，所述药物偶联体的结构式为：当第一配体为叶酸，配体为P13，连接子为MC-Val-Cit-PAB，药物分子为MMAE时，所述药物偶联体的结构式为：以上由于配体P11、P12、P13均同样具有细胞内吞功能，故和叶 酸进行偶联后，其两者之间的协同效应将会对最后偶联体的药物性能得到更好的提高。优选地，所述一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体的应用，所述多靶向配体-药物偶联体可应用于肿瘤、免疫调节、心血管疾病的治疗。本发明的有益效果：1)靶向和内吞结构的结合，实现以任何配体靶向的多肽做为制导部分，从而拓宽了此类药物的靶向范围。2)利用双(多个)靶向配体增强药物偶联体对病变细胞的亲和性和靶向性，从而可以携带高效的毒素药物如MMAE，增强药效并拓宽治疗窗口避免药物副作用。3)连接子在细胞外部(胞间质、血液循环系统等)无法释放药物分子，保证了药物在体内循环时的稳定性，并降低药物毒性，不会对正常细胞产生毒害作用。进入靶向细胞内部后，连接子裂解释放出具有治疗作用的药物分子，可避免产生多药耐药性(MDR)。4)该偶联体可以将药物分子更换为多种化学结构中含有可以发生酰化反应的游离氨基，肿瘤、免疫治疗、心血管疾病、抗生素等药物，如美登素类(MMAE，MMAF)、DM1、SiRNA等。此偶联体不仅拓宽了LDC类药物的靶向范围和治疗窗口，而且增强了药效、避免了毒副作用。附图说明图1是两个片段的亲和性自由能关系示意图。图2是偶联体在移植肿瘤动物体内浓度变化对比图具体实施方式以下结合实施例具体说明本发明的制备方法：本发明揭示了一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体，所述药物偶联体包括药物分子及与所述药物分子偶联的连接子，所述药物偶联体还包括至少两个与细胞表面受体特异性结合的配体， 所述配体可以是多肽或小分子，其中至少一个配体同时拥有介导细胞内吞功能，如叶酸及其类似物，多肽P11，多肽P12。所述配体间可互相偶联、并与药物分子或/和连接子偶联形成药物偶联体，或分别单独与药物分子和连接子之一偶联形成药物偶联体。所述配体为叶酸或叶酸类似物。所述叶酸类似物包括5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亚甲基四氢叶酸。叶酸受体在多种癌细胞表面表达高于正常细胞，同时叶酸与受体结合后能介导偶联体的内吞。所以叶酸与叶酸类似物是一个构建双靶向配体药物偶联体的很好结构。所述作为配体的多肽序列为Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，为Soricidin蛋白碳端的13个氨基酸SOR-C13，命名为P10(US7119168，US12/886397)。所述P10上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸进行替换，在序列同源区间至少保留40％同源性。所述配体多肽序列为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黄体生成素释放激素LHRH(TrendsEndocrinolMetab,2004,15(7):300-310,ArchGynecolObstet,2012,286(2):437-442.)，命名为P11。所述P11上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸进行替换，在序列同源区间至少保留40％同源性。所述配体多肽序列为Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys],即生长激素抑制素SST-14(Science，1973，179(68)：77-79)，命名为P12。所述P12上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸进行替换，在序列同源区间至少保留40％同源性。所述配体多肽序列为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黄体生成素释放 激素LHRH类似物(TrendsEndocrinolMetab,2004,15(7):300-310,ArchGynecolObstet,2012,286(2):437-442.)，命名为P13。所述P13上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸进行替换，在序列同源区间至少保留40％同源性。所述连接子为二肽序列的多肽类连接子、二硫键连接子或pH依赖型连接子。具体的，所述二肽序列为包含有缬氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸序列，所述二硫键连接子可为DSDM、DMDS、MDS，所述pH依赖型连接子为顺乌头酸酐。以上所述连接子的具体结构式见下表1所示。表1：二硫键连接子的结构式：由于本发明中的连接子需要在细胞内通过特定的条件如低PH裂解，二硫键还原，或溶酶体酶解后才能释放所携带药物，偶连体所携带的药物在没有释放下来前是没有毒性的，使得偶联体具有较低的毒性，同时保证了本发明中药物的稳定性。所述药物分子为具有治疗作用的药物基团，包括细胞毒素(美登 素衍生物MMAE、MMAF，DM1，卡奇霉素、多卡霉素、阿多来新、安曲霉素等)、化疗药物(紫杉醇)、酶抑制剂、酶激动剂，SiRNA或其他生物活性分子。其共同特点是化学结构中含有可以发生酰化反应的游离氨基，这些游离氨基被其他化学基团修饰后，将显著降低药物的细胞毒性，并在去除化学基团后可以恢复。以下阐述本发明的作用机理：首先，多靶向配体-药物偶联体进入血液循环和细胞外部(胞间质)，由于连接子在胞外环境非常稳定无法释放药物分子，则药物分子的毒性被封闭。该偶联体是一个无细胞毒性或低毒性的药物，不会对正常细胞产生毒害作用。接着，多靶向配体-药物偶联体与病变细胞上同时有高表达的多个受体结合，其协同效应大大增加了偶联体对靶向细胞的亲和性，降低了与正常细胞结合的可能。从而可以携带高效的毒素药物如MMAE，增强药效并拓宽治疗窗口避免药物副作用。通过偶联体上同时具有内吞介导作用的配体的透膜递送功能，偶联体被靶向细胞内吞进入细胞内部。进入靶向细胞内部后，通过细胞内部环境的变化(特异性酶切、pH变化、二硫键还原等)连接子可以裂解释放出药物分子(相当于去除药物分子的修饰基团)，对肿瘤细胞产生治疗作用。同时避免了多药耐药性(MDR)相关的药物抗性。多靶向配体-药物偶联体是解决药物靶向性差，从而拓宽治疗窗口的有效方法。很多单配体药物偶联体在有疗效药物浓度时已有毒性，从而不能成药。相对于单配体，多靶向配体-药物偶联体对靶向细胞的亲和性应有很大改善。从而可以携带高效的毒素药物如MMAE，增强药效并拓宽治疗窗口避免药物副作用。其中双靶向也属于多靶向中的一种，而双靶向协同效应的具体的原理可用片段药物设计的 例子来解释，假如一个药物的两个片段结合组成，这两个片段连接后都可以正常和其受体结合部位结合，最后的化合物亲和性应该是两个片段的亲和性(Kd)的积而不是其和。这是因为Kd和结合的自由能是几何关系如以下所示，ΔGAB＝ΔGA+ΔGB，RTln(K)＝-ΔGAB，KAB＝KAxKBKA＝2x103，KB＝5x103，KAB＝1x107现实中由于连接会影响两个片段同时与其受体位点结合能力，最后化合物的亲和性往往大大小于两个片段Kd之积，但大于其之和，具体的协同关系如图1所示。以下是第一配体为叶酸，配体为P10，连接子为MC-Val-Cit-PAB，药物分子为MMAE时，具体阐述本发明的合成方法及过程：步骤一、Folate-NHS的合成将叶酸(44.1g，100mmol)溶解在2升DMSO中，然后用DCC(24.8g,120mmol)和NHS(23g，200mmol)混合，将混合物于常温下避光搅拌18小时。过滤不溶物，真空抽干，得到胶状固体。用冰乙醚洗3遍，抽干成黄色粉末，得到53.8g，无需进一步纯化，可以做下一步反应。步骤二、P10保护肽树脂的合成称取替代度为1.1mmol/g的WangResin100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30分钟；称取Fmoc-Arg(pbf)-OH142.7g(220mmol)，HOBt35.6g(264mmol)，DMAP2.7g(22mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入40.8mlDIC(264mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应3小时后，抽干，洗涤3遍。将104ml醋酸酐、88.5ml吡啶溶于500mlDMF中，混合加入以上洗涤后的树脂，室温封闭5h，DMF洗涤三次，甲醇收缩后抽干树 脂，得到Fmoc-Arg(pbf)-WangResin，检测替代度为0.53mmol/g。称取Fmoc-Arg(pbf)-WangResin(Sub＝0.53mmol/g)37.7克(20mmol)于反应柱中，用DMF清洗3次，再用DMF溶胀30分钟。然后用DBLK脱除Fmoc保护基团，再用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Pro-OH20.2g(60mmol)，HOBt9.7g(72mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入11.1mlDIC(72mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用DBLK脱除Fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Fmoc-Ser(tBu)–OH、Fmoc-Pro–OH、Fmoc-His(Trt)–OH、Fmoc-Leu–OH、Fmoc-Phe–OH、Fmoc-Glu(OtBu)–OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH,然后用DBLK脱除Fmoc保护基团，然后用DMF洗涤6次，用甲醇收缩两次，抽干，获得P10保护肽树脂85.8g。步骤三、中间体Folate-P10(Folate-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH)的合成称取Folate-NHS32.3g(60mmol)，用DMSO溶解，加入85.8g上述P10保护肽树脂，反应5分钟，滴加21ml(120mmol)DIEA，室温继续反应4h。DFM洗3遍，甲醇收缩，真空抽干，得到全保护肽树脂320.3g。将上一步得到的肽树脂80g加入到1000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液640ml，TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚＝90:5:3：2(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用100mlTFA洗涤，合并滤液，加入到4500ml无水乙醚中析出黄色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到黄色固体40.6g，粗肽收率97.1％。HPLC纯度76.3％。经HPLC纯化制备，冻干得到Folate-P1028.25g，纯度为98.6％。步骤四、中间体(Mc-Val-Cit-PAB-MMAE)的合成称取MMAE7.18g(10mmol)加入到250ml三口烧瓶中，用无水DMF溶解，N2保护室温搅拌至澄清。加入Mc-Val-Cit-PAB-PNP7.37g，HOAt72mg(2mmol),反应5分钟，再滴加3.5ml(20mmol)DIEA，继续室温反应30分钟，升温40～50度反应至20h，期间通过HPLC监测反应。真空抽干DMF，通过进一步纯化得到产品Mc-Val-Cit-PAB-MMAE10.7g，纯度为99.3％。步骤五、偶联体LDC10B的合成：称取上一步制备的得到Mc-Val-Cit-PAB-MMAE6.59g(5mmol)加入到5000ml单口烧瓶中，并加入3300ml磷酸缓冲液，搅拌，保持PH＝7.2至澄清，加入中间体10.5g(5.02mmol)Folate-P10，室温反应2h，期间HPLC监测反应。反应完全后，过滤，通过HPLC制备，冻干得到14.53gLDC10B,纯度99.2％，收率为85.02％。同理，通过以上方法可获得具有偶联体LDC11B，LDC12B，LDC13B。LDC10B，LDC11B，LDC12B，LDC13B的化学结构式分别如下表2所示：表2：LDCB系列偶联体化学结构式示意表偶联体性能测试：其中涉及的偶联体为：LDC1为Folate-(PEG)3-MC-Val-Cit-PAB-MMAELDC10A为P10-MC-Val-Cit-PAB-MMAELDC11A为P11-MC-Val-Cit-PAB-MMAE偶联体LDC10B细胞活性实验结果对照样品：MMAE，LDC1，LDC10A主要细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3。培养基：RPMI1640Medium,nofolicacid实验方法：1)人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3,细胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。2)将人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3,以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2 下培养8-12个小时。3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100uL/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150uL/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。5)在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。结果与分析：LDC10B对人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人肺癌细胞H1299，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，人乳腺癌细胞SK-BR-3等大多种瘤细胞都有杀死肿瘤细胞抑制生长，且IC50值低于LDC1，LDC10A对照。LDC10B是同时能和叶酸受体和SOR-C13受体结合的双靶向双靶向配体-药物偶联体。从表3结果可以看出其细胞毒性大于(IC50值小于)单配体偶联体LDC1或LDC10A的近10倍，从而显示出双配体的协同效应和对药效的贡献。表3:偶联体LDC10B细胞活性(IC50值)对照表单位(摩尔/升，M)细胞名称H1299K562H460SKOV3HCC1954N87SK-BR-3293AMMAE0.86×10-90.54×10-90.77×10-90.62×10-90.45×10-90.68×10-90.52×10-91.15×10-9LDC12.62×10-79.31×10-81.92×10-71.02×10-79.44×10-82.39×10-79.82×10-85.10×10-7LDC10A5.09×10-71.11×10-74.83×10-71.25×10-71.06×10-75.17×10-71.09×10-79.28×10-7LDC10B5.88×10-81.48×10-85.04×10-81.57×10-81.41×10-87.51×10-81.59×10-84.33×10-7LDC11B偶联体对相关肿瘤细胞毒性实验样品：LDC11B对照样品：MMAE，LDC1，LDC11A主要细胞株：人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3。培养基：RPMI1640Medium,nofolicacid实验方法：1)人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3,细胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。2)将人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3,以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100uL/well，并设对照)， 在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150uL/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。5)然后在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。结果与分析：LDC11B对人子宫颈鳞癌细胞SIHA，人子宫内膜癌细胞HEC-1A，人肝癌细胞hepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC-3，人胚肾细胞293A，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3等大多种瘤细胞都有杀死肿瘤细胞抑制生长，且IC50值低于LDC1，LDC11A对照，具体结果如表4所示。L11B是同时能和叶酸受体和LHRH受体结合的双靶向双靶向配体-药物偶联体。从表4结果可以看出其细胞毒性大于(IC50值小于)单配体偶联体LDC1或LDC11A的近10倍，从而显示出双配体的协同效应和对药效的贡献。表4：LDC11B偶联体对相关肿瘤细胞毒性(IC50值)对照表单位(摩尔/升，M)细胞名称H460SKOV3293AMMAE0.58×10-90.44×10-90.86×10-9LDC15.26×10-72.95×10-77.15×10-7LDC11A6.67×10-73.41×10-71.31×10-6LDC11B8.13×10-84.38×10-85.24×10-7LDC12B偶联体对相关肿瘤细胞毒性实验样品：LDC12B对照样品：MMAE主要细胞株：人肺癌细胞H460，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87。培养基：RPMI1640Medium,nofolicacid实验方法：1)人肺癌细胞H460，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，细胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。2)将人肺癌细胞H460，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87，以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100uL/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150uL/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。5)在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。结果与分析：LDC12B对人肺癌细胞H460，人胃癌细胞株GTL-16，乳腺癌细胞株HCC1954，人胃癌细胞N87等大多种瘤细胞都有杀死肿瘤细胞抑制生长，具体结果如表5所示。表5：LDC12B偶联体对相关肿瘤细胞毒性对照表细胞名称HCT-116GTL-16HEC-1ASH-SY5YN87MMAE1.27×10-86.38×10-98.74×10-92.4×10-83.83×10-9LDC12B8.26×10-76.12×10-76.31×10-73.96×10-71.2×10-6LDC13B偶联体对相关肿瘤细胞毒性实验样品：LDC13B对照样品：MMAE主要细胞株：人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87。培养基：RPMI1640Medium,nofolicacid实验方法：1)人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87，细胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。2)将人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87，以1×103个细胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培养8-12个小时。3)向铺好细胞的板中加入连续稀释好的偶联体药物(加入药物：吸出孔中培养液，将稀释好的药物样品，100uL/well，并设对照)，在37℃，5％CO2下培养半小时。半小时后，换无药物培养液培养，150uL/well。在37℃，5％CO2下培养2-3天并观察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)进行显色，在37℃，5％CO2下培养箱中1个小时。5)在本酶标仪上490nm对培养板进行读数，比较经处理和未处 理培养物的细胞存活，测定50％细胞死亡所需的LDC药物浓度(IC50值)。结果与分析：LDC13B对人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞株GTL-16，人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，人前列腺癌细胞PC-3，人胃癌细胞N87等肿瘤细胞都有杀伤作用，具体结果如表6所示。表6：LDC13B偶联体对相关肿瘤细胞毒性(IC50值)对照表单位(摩尔/升，M)细胞名称HCT-116GTL-16HEC-1APC-3N87MMAE1.27×10-86.38×10-98.74×10-91.28×10-83.83×10-9LDC13B1.07×10-67.55×10-79.4×10-71.18×10-63.26×10-7偶联体动物模型药效研究实验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解偶联体的抗肿瘤药效偶联体LDC10B对移植肿瘤抑制实验动物：裸鼠，6-8周龄，雌性；实验方法人大细胞肺癌细胞H460，人肺癌细胞A549，卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，细胞使用含10％胎牛血清IMDM培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。肿瘤产生，将7×106肿瘤细胞注射到裸鼠背部皮下，待肿瘤长到100左右，开始分组给药治疗。治疗过程：小鼠以3只为1组，用5、10mg/kg剂量，7天间隔注射4次LDC10B及对照MMAE，PBS进行治疗。监控动物的身体表现、体重和肿瘤尺寸。在实验过程中记录实验动物的死亡数。结果与讨论：LDC10B能抑制人大细胞肺癌细胞H460，人肺癌细胞A549,卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，大多肿瘤在5、10mg/kg剂量连续3次给药后萎缩消失，具体结果如表7所示。表7：LDC10B偶联体对移植肿瘤抑制的效果对照表LDC11B系列偶联体对移植肿瘤抑制实验动物：裸鼠，6-8周龄，雌性；实验方法人大细胞肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3，细胞使用含10％胎牛血清IMDM培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。肿瘤产生，将7×106肿瘤细胞分别注射到裸鼠背部皮下，待肿瘤长到100～200mm3左右，开始给药治疗。治疗过程：小鼠以3只为1组，用10mg/kg剂量，7天间隔4次注射，LDC11B进行治疗。监控动物的身体表现、体重和肿瘤尺寸。在实验过程中记录实验动物的死亡数。结果与讨论：LDC11B能抑制人大细胞肺癌细胞H460，卵巢癌细胞SKOV3,乳腺癌细胞株HCC1954，人乳腺癌细胞SK-BR-3肿瘤的生长，大多肿瘤在10mg/kg剂量连续3次给药后萎缩消失，具体结果如表8所示。表8：LDC11B偶联体对移植肿瘤抑制的对照数据表偶联体LDC10B在移植肿瘤动物体内浓度变化检测动物：裸鼠，6-8周龄，雌性；实验方法人卵巢癌细胞SKOV3，细胞使用含10％胎牛血清IMDM培养基在37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞2-3天传一次。肿瘤产生，将7×106肿瘤细胞注射到裸鼠背部皮下，待肿瘤长到100～200mm3，开始分组给药。给药：用10mg/kg剂量，给小鼠腹膜注射。采血：给药前采血设定为0，给药后20min、2h、4h、24h采血，采血后离心取血清冷冻保存。检测：采用鼠抗MMAEElisa试剂盒检测血清中MMAE，LDC10B、及其代谢物的总含量。结果与讨论：LDC10B在给药后24小时后，血液中只剩下少量药物。具体结果如表9及图2所示。表9：偶联体LDC10B在移植肿瘤动物体内浓度变化数据对照表时间浓度ug/ml给药前020min10.82h5.0354h0.5324h0.1179当前第1页1 2 3