一种提高单克隆抗体adcc活性的哺乳动物细胞培养工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体生产的哺乳动物细胞培养工艺，更具体地说，涉及在 培养过程中添加尿巧和儘离子，控制单克隆抗体糖基化水平，进而提高ADCC活性的哺乳动 物细胞流加培养工艺，属于生物制药领域。
【背景技术】
[0002] 生物技术药物尤其是单抗药物，因其治疗的祀向性、耐受性，提高患者生存质量同 时延长生命，上市后获得市场认可度高，重磅炸弹频出，如利妥昔单抗、曲妥珠单抗和英夫 利西单抗等。全球抗体药物经历了快速的发展，目前已经达到一定的规模，而国内抗体药物 进口和国产数量均有限，加之国家"十二五"规划中提出重点扶持生物技术产业，送也大大 助推了国内开发单抗药物的热情。
[0003] 抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC)是单抗药物的重要作用机制之一，单抗 革己向结合至肿瘤细胞表面分子后，效应细胞通过其表面上的Fc受体（FcyR)与单抗Fc段 结合，激活一系列的信号通路，从而释放一系列炎症或细胞毒性的免疫调节因子，包括细胞 因子、趋化因子、蛋白酶和活性氧分子等，对肿瘤细胞产生杀伤作用，从而发挥单抗药物的 抗肿瘤活性。利用该机制发挥抗肿瘤作用的代表药物有利妥昔单抗和曲妥珠单抗等。
[0004] 单抗Fc段的糖基化作为蛋白翻译后修饰的重要指标，在抗体药效（如ADCC)和药 代（半衰期）中具有非常重要的作用。糖基化修饰的影响因素较多，如培养基、宿主细胞、培 养方式、培养参数（pH、温度、D0、PcJ等。目前已报道或应用一些方法改变糖基化水平或者 类型，提高抗体的ADCC活性，如添加甘露糖巧酶抑制剂化i化nensine)使单抗的糖型变为 高甘露糖型狂hou Q，et al.，Biotechnology and Bioengineering, 2008,99 (3) :652-665), 或者通过基因工程的手段减少岩藻糖修饰（Malphettes以et al.，Biotechnology and Bioengineering, 2010,106巧）：774-783)等方法。改变糖基化类型会相应影响单抗的安全 性和有效性，如高甘露糖型会加快抗体在体内的清除，从而影响药代（缩短半衰期），并可 能产生免疫原性。基因工程的方法则需要重新构建细胞株，相当于对单抗药物进行重新开 发，延长药物的开发周期和成本。
[0005] 在目前国内外单抗药物开发激烈竞争时代的形势下，迫切需要一种简单易行的工 艺，在不改变糖基化类型的基础上，通过控制糖基化水平，改进单抗的ADCC活性而不影响 其他生物学特征，提高产品的治疗效果。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供了一种在哺乳动物细胞培养过程中有效控制单抗的糖基化 水平，提高单抗体ADCC活性的生产工艺。
[0007] 本发明提供的生产工艺，其特征在于：
[0008] -种提高单克隆抗体ADCC活性的哺乳动物细胞流加培养工艺，其特征在于在细 胞培养过程中连续流加核巧和金属离子。
[0009] 上述的工艺方法，其特征在于在细胞培养过程中连续流加尿巧和儘离子。
[0010] 上述的工艺方法，其特征在于在细胞培养过程中流加0. SmM-IOmM总量的尿巧和 1 y M-20 y M总量的儘贸子。
[0011] 上述的工艺方法，优选流加总量的尿巧和12 U M-16 U M总量的儘离子。
[0012] 上述的工艺方法，其特征在于细胞培养3-5天后，生长至2-5X l〇6cells/mL密度 时，开始开始补加流加培养基，流加时间为8-10天。
[0013] 上述的流加培养基，其特征在于单独流加，或与尿巧和儘离子混合流加。
[0014] 上述的流加方式，优选混合流加。
[0015] 上述的儘离子，其特征在于儘离子由二价儘盐提供。
[0016] 上述的二价儘盐，优选硫酸儘。
[0017] 上述的哺乳动物细胞系，优选NSO细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞系。
[001引上述的哺乳动物细胞系，优选Cffi)细胞系。
[0019] 上述的工艺方法在哺乳动物细胞生产单克隆抗体中的应用。
[0020] 上述的单克隆抗体，其特征在于本身具有ADCC活性的单克隆抗体药物。
[0021] W下实施方案按照工艺优化递进开展：
[002引在一个实施方案中，6个250mL摇瓶（Corning)培养，工作体积60mU摇床 (科耐）控制；转速为120-13化pm,温度为36. 5。C02饱和度为7%，细胞接种密度为 0. 8-1. 2Xl06cells/mU培养第3至11天，分段补加流加培养基及不同浓度的硫酸儘和尿 巧，总培养周期为13天。
[0023] 在另一个实施方案中，放大至化反应器（A卵Iikon)细胞培养，细胞接种密度为 0. 8-1. 2X 106cells/mU控制参数为；揽拌转速为80-250巧m，温度为36. 5°C，抑为7. 0,溶 氧为40% (空气饱和度），培养第3天开始，每天流加含尿巧和硫酸儘的流加培养基，培养 周期为13天。
[0024] 在另一个实施方案中，进一步放大至3批次25化反应器灯hermo 250L SUB)细胞 培养，揽拌转速为80-120巧m，抑为6. 9-7. 1，溶氧为30-50 % (空气饱和度），培养第3天 开始，补加流加培养基（含硫酸儘和尿巧），培养周期为15-16天。
[00巧]尿巧和儘离子是影响抗体糖基化修饰的重要因素。尿巧参与细胞内UTP及UDP-半 乳糖的生成，UDP-半乳糖复合物与蛋白在半乳糖基化转移酶的作用下完成半乳糖基化过 程，在半乳糖化过程中，儘离子是半乳糖基化转移酶的重要辅助因子。因此通过添加尿巧和 儘离子可W达到控制糖基化水平的效果，进而影响抗体的生物学活性，如ADCC活性。
[0026] 本发明的有益效果
[0027] 本发明的主要优点；（1)本发明通过在细胞培养过程中添加适当浓度尿巧和儘离 子，利用二者的协同作用，有效的提高了单抗半乳糖基化程度，提升了单抗的质量；（2)本 发明在控制糖基化水平的同时，显著提高了单抗的ADCC活性，使其具有更好的生物学功 能；（3)本发明的工艺成本低、易于放大、批间稳定，顺利通过了 3批次25化SUB放大培养 验证，非常适合于治疗性单克隆抗体的工业化生产。
【附图说明】
[002引图1: 3L反应器细胞生长曲线
[002引图2: 3L反应器抗体表达曲线
[0030] 图3: 3L反应器抗体ADCC检测曲线
[0031] 图4:25化反应器细胞生长曲线
[0032] 图5:25化反应器抗体表达曲线
[003引图6:25化反应器抗体ADCC检测曲线
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之 内。
[00巧]实验材料：稳定表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞株（美国Life Technologies 公司），商业基础培养基和商业流加培养基（美国Life Technologies公司），尿巧和硫酸 儘（美国Sigma公司）。
[0036] 实施例1添加不同浓度尿巧和硫酸儘的摇瓶培养
[0037] 摇瓶培养细胞接种密度为0. 8-1. 2 X 106cells/mU工作体积50mU摇床（科耐）控 巧;转速为120-130巧m，温度为36. 5°C，C02饱和度为7%，培养第3、5、7、9和11天补加流 加培养基W及不同总量的硫酸儘、尿巧），培养周期为13天。培养结束后用Protein A纯化 抗体进行质量分析。
[0038] 检测方法：
[0039] 活细胞密度检测：用Counterstar进行活细胞密度检测，结果见表1。
[0040] 抗体滴度检测：用HPLC-Protein A法检测抗体滴度，结果见表1。
[0041] ADCC活性检测；采用工程化的M92-CD16a细胞作为效应细胞，Wil2-s细胞作为革己 细胞进行ADCC活性检测，效祀比为2 ; 1，用乳酸脱氨酶检测试剂盒检测细胞裂解效果，采用 实验组的EC50值与对照组的EC50值的比较值即比活（％ )来表示，结果见表1。
[004引数据处理：
[0043] 累计细胞量 IVCD 计算公式为 IVCDi = IVCDi i+(ViXi+Vi iXi 1) (ti-ti i)/2Vi，公式中 的i指培养当天；i-1指培养前一天；IVCD指累积活细胞量（IO6Cells day/mL) ;X指细胞浓 度（cells/mL) ;V指培养体积（mL) ;t指培养时间（days);
[0044] 抗体产能化计算公式为化=抗体产量^VCD,化指细胞单产（pg/cell/day)。
[004引 结果比较：
[0046] 添加硫酸儘、尿巧与对照培养结果对比见表1，随着添加尿巧和儘离子浓度递增， 细胞生长呈现下降趋势；在尿巧浓度为IOmM,儘离子浓度为20 U M时，抗体产量下降了 19% ;在尿巧浓度高于6mM，儘离子浓度高于12 U M时，ADCC比活性显著提升2倍W上，且 随着尿巧和儘离子浓度递增呈现上升趋势。所W，通过摇瓶培养实验，综合考虑细胞生长、 表达和ADCC活性，选择添加总量为SmM的尿巧和16 U M的儘离子的工艺进行反应器工艺测 试。
[0047] 表1摇瓶培养结果汇总
[0048]
[0049] 实施例23L反应器工艺测试
[0050] 将细胞经过摇瓶扩增后接种至化玻璃反应器（荷兰Appl化on公司）进行工艺 测试，细胞接种密度为0. 8-1. 2X 106cells/mU控制参数为；揽拌转速为80-250巧m，温度 为36. 5°C，抑为7. 0,溶氧为40% (空气饱和度），培养第3天至第12天补加流加培养基 含尿巧、硫酸儘的流加培养基，培养周期为13天，尿巧流加总量为8mM，儘离子流加总量为 16 U M。对照组仅补加流加培养基。培养过程中每天取样进行生长、代谢和滴度检测。培养 结束后用亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析纯化抗体进行质量分析。
[00川检测方法：
[0052] 活细胞密度检测：用Counterstar进行活细胞密度检测，结果见图1。
[0053] 抗体滴度检测：用HPLC-Protein A法检测抗体滴度，结果见图2。
[0054] ADCC活性检测；采用工程化的M92-CD16a细胞作为效应细胞，Wil2-s细胞作为革己 细胞进行ADCC活性检测，效祀比为2 ; 1，用乳酸脱氨酶检测试剂盒检测细胞裂解效果，采用 实验组的EC50值与对照组的EC50值的比较值即比活（％ )来表示，结果见图3。
[0055] 糖型检测：参考市售2-AB标记检测试剂盒（美国Glyko公司），用内切糖巧酶 (N-Glycanase)将N-糖巧从单抗上分离，经无孔石墨小柱富集。N-糖巧经真空浓缩干燥， 将干燥后的N-糖巧用2-氨基-苯甲醜胺（2-AB)标记，应用于HPLC-FLD分离分析。通过 比较2-AB标记的N-糖巧的与糖标准品在液相色谱上的保留时间，对单抗的N-糖巧类型进 行归属；对不同类型的N-糖巧在HPLC-FLD谱图的峰面积进行归一化，对单抗的各N-糖巧 类型进行定量分析。结果见表2。
[005引 结果对比：
[0057] 生长比较；如图1，UM实验组（添加尿巧和儘离子的实验组）在培养前期生长较 快，培养后期，细胞密度和活率比对照组低约10%，整体无明显差异；
[0058] 滴度比较；如图2, UM实验组与对照组Titer随时间的变化，同时培养13天条件 下，实验组滴度为1493. 4〇111旨/1，对照组为1550. 55mg/l，该工艺对细胞表达无明显影响；
[0059] ADCC活性比较；如图3, UM实验组EC50为1. 282ng/血，对照组为3. 024ng/血，实 验组ADCC活性是对照组的2. 36倍。
[0060] 糖型比较；如表2, UM实验组的GOF比例低于对照组，而GlF和G2F比例均高于对 照组，说明尿巧和儘离子促进了抗体的半乳糖基化。半乳糖基化会影响抗体的其他生物学 活性，如补体依赖的细胞毒作用（CDC)，因而提高半乳糖基化程度有利于提高抗体的生物学 活性。UM实验组不含核必岩藻糖的GO、Gl和G2比例略高于对照组，核必岩藻糖会降低抗 体的ADCC活性，送可能是本发明ADCC活性提高的原因之一。
[0061] 表2糖型分析
[0062]
[0063] 实施例3250L SUB反应器培养工艺验证
[0064] 在25化水平上，重复3批次中式规模放大培养。
[0065] Thermo 250L SUB反应器培养；细胞接种密度为0.8-1. 2 X IO6CellsM^JS制参数 为；揽拌转速为80-120巧m，温度为36. 5°C，抑为6.9-7. 1，溶氧为30-50% (空气饱和度）， 初始工作体积15化，培养第3-4天时，补加流加培养基（含尿巧和儘离子），维持葡萄糖浓 度至2g/l，培养周期为14-16天，最终培养液中含SmM尿巧和16 U M。
[0066] 如图4和图5, 3批25化SUB反应器生长和表达均保持一致，且表达产品的ADCC 的EC50分别为1. 189ng/mL，1. 449ng/mL和1. 36化g/mL，CV<10%，具有良好的重现性。
[0067] 本发明添加氨基酸和UMG的流加培养工艺在细胞生长、细胞表达和抗体质量均达 到产品开发目标，且顺利通过了 3批25化放大培养工艺验证，该工艺稳定成熟可靠，重现性 好，本发明具有良好的产业化潜力。
【主权项】
1. 一种提高单克隆抗体ADCC活性的哺乳动物细胞流加培养工艺，其特征在于在细胞 培养过程中连续流加核苷和金属离子。2. 根据权利要求1所述的工艺方法，其特征在于在细胞培养过程中连续流加尿苷和锰 离子。3. 根据权利要求1所述的工艺方法，其特征在于在细胞培养过程中流加0. 5mM-10mM总 量的尿苷和1 μ Μ -20 μ Μ总量的锰离子。4. 根据权利要求1所述的工艺方法，优选流加总量的尿苷和12 μ Μ-16 μ Μ总 量的猛尚子。5. 根据权利要求1-4所述的工艺方法，其特征在于细胞培养3-5天后，生长至 2-5' 106cells/mL密度时，开始补加流加培养基，流加时间为8-10天。6. 根据权利要求5所述的流加培养基，其特征在于单独流加，或与尿苷和锰离子混合 流加。7. 根据权利要求6所述的流加方式，优选混合流加。8. 根据权利要求1-7所述的锰离子，其特征在于锰离子由二价锰盐提供。9. 根据权利要求8所述的二价锰盐，优选硫酸锰。10. 根据权利要求1所述的哺乳动物细胞，优选NS0细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞 系。11. 根据权利要求1所述的哺乳动物细胞系，优选CHO细胞系。12. 权利要求1-11任意一项所述的工艺方法在哺乳动物细胞生产单克隆抗体中的应 用。13. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其特征在于本身具有ADCC活性的单克隆抗体 药物。
【专利摘要】本发明公开了一种适于哺乳动物细胞培养并快速有效提高单克隆抗体ADCC活性的工艺途径，该工艺特征在于通过在培养过程中添加核苷和金属离子的方法，控制单抗的糖基化水平，提高单克隆抗体的ADCC活性。该工艺具有稳定性好，可操作性强，易于放大，批次间结果差异小的特点，可以应用于大规模哺乳动物细胞培养表达单克隆抗体，特别是工业化生产治疗性单克隆抗体。
【IPC分类】C12R1/91, C12P21/08
【公开号】CN105713946
【申请号】CN201410712306
【发明人】吴伟, 范林萍, 于鹏展
【申请人】西藏海思科药业集团股份有限公司