本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及用于增强抗原免疫应答的佐剂。
背景技术：
细菌、病毒及寄生虫感染广泛分布于人和动物，由这些感染剂引起的疾病通常对抗微生物药学疗法具有抗性，从而没有有效的治疗方法。因此，本领域更常使用疫苗学方法以控制传染，具体是通过用活的病原体、经灭活的病原体或其产物，或经基因工程手段将病原体蛋白质亚基制备成疫苗，进行疫苗接种来诱导特异性免疫。然而，当单独给予某些抗原时，不能对免疫系统产生足够的刺激作用。因此，必须加入能够使机体免疫应答增加的免疫佐剂来获得足够量的保护性抗体。
免疫佐剂是疫苗必不可少的组成部分，不仅能影响机体对疫苗免疫应答的强度，而且能针对特定病原体诱导最有效的免疫应答类型(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,et al.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416)。目前，研究的免疫佐剂类型很多，如铝胶、油佐剂、弗氏佐剂、微生物及其代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、脂质体等(Dey AK,Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses induced by immunogens.Expert review of vaccines,2011,10:227-251)，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隐患等一些不可避免的缺陷而难以实际应用(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416；Batista-Duharte A,Lindblad EB,Oviedo-Orta E.Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicology letters,2011,203(2):97-105)，导致这些佐剂远远不能满足新型疫苗发展的需求。特别地，大量的临床免疫试验认为铝胶佐剂存在一些问题：(1)对Th2介导的体液免疫反应具有很强的激发作用，而对Th1介导的细胞免疫反应的作用较弱，只适用于以抗体为主要保护性免疫的疫苗(Exley C,Siesjo P,Eriksson H.The immunobiology of aluminum adjuvants:how do they really work？Trends in immunology,2010,31:103-109)；(2)可促进IgE抗体产生，容易诱导机体产生过敏反应；(3)有局部反应，会形成肉芽肿，极个别可发生局部无菌性脓肿；(4)因其理化性质，含铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶疫苗容易变性；(5)对人、畜神经系统可能有影响(见中国专利CN101402666A)。因而，寻找安全、有效、新型的免疫佐剂是当前疫苗研究领域的一个热点(Schijins VEJC,Lavelle EC.Teends in vaccine adjuvants.Expert review of vaccines,2011,10(4):539-550)。并且，免疫佐剂研究现已被列为疫苗研究的优先领域(Harandi AM,Medaglini D,Shattock RJ.Vaccine adjuvants:A priority for vaccine research.Vaccine,2010,28(12):2363-2366；Harand AM,Brewe J,Schijn V.Conference scene:recent advancements in immunopotentiators for modern vaccines.Immunotherapy,2011,3(11):1297-1301)。
另外，目前商品化的菌苗(如猪肺炎支原体菌苗、副猪嗜血杆菌菌苗)是通过在含血清的培养基上生长所得的生物体制备而成，从而免疫物质中存在的血清组分(如免疫复合物或非免疫原性特异性蛋白)会诱导副反应发生(见中国专利CN104334186A)。而且，临床应用时发现现有的商品化疫苗免疫猪只后会出现体温升高的现象，其他现有技术所涉及的疫苗也有类似报道如中国专利CN103194413A、CN104312964A。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种疫苗用佐剂及含该佐剂的疫苗组合物和其应用。
本发明的第一方面在于提供一种疫苗用佐剂，所述佐剂包括铝胶、壳聚糖。
本发明还涉及一种疫苗用佐剂，所述佐剂包括铝胶、壳聚糖和磷脂。
本发明所述疫苗用佐剂具有成本低廉、使用方便、免疫活性强等优点，含该佐剂的疫苗组合物不仅能使动物机体产生体液免疫、细胞免疫，还不会造成体温升高、副反应发生。
本发明的另一方面在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明所述疫苗用佐剂和免疫有效量的抗原。
含本发明佐剂的疫苗组合物在抗原含量较低、单次免疫时也能使动物获得较好的免疫应答水平。
本发明还涉及本发明制备的含猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原以及疫苗用佐剂的疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌感染相关疾病的药物中的应用。
本发明的疫苗用佐剂与抗原共同免疫动物后的免疫应答水平与现有商品化疫苗的免疫应答水平相当甚至较高，抗体持续时间也较长，无体温升高、无副反应发生，效果稳定；且在抗原含量较低时也能使动物获得较好的免疫效果，免疫次数少也可使猪的应激反应减少甚至消失。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的第一方面在于提供一种疫苗用佐剂，所述佐剂包括铝胶、壳聚糖。
术语“佐剂”是指当与抗原连同投予时，使受试者对这一抗 原的免疫反应增强的化合物。
术语“铝胶”，又称铝盐或铝佐剂，是本领域众所周知的，并且如在Harlow E.与D.Lane(Antibodies:a laboratory manual gold spring harbor laboratory.1988)和Nicklas W.(Aluminum salts,research in immunology.1992,143:489-493)中描述的，可广泛应用于疫苗制备。铝胶包括但不限于氢氧化铝(Aluminium hydroxide或Amphogel，又称水化氧化铝、铝的水合物、三羟基铝、无定形氧化铝，包括一水合氧化铝、三水合氧化铝ATH)、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾、钾明矾或硅酸铝的一种或多种，优选为氢氧化铝或磷酸铝。所述铝胶还可以包括以下任一产品如HPA(General Chemical,LLC)、M9400SP(J.M.Huber Corporation)、(Merck)、(Brenntag Biosector)、Aluminum hydroxide(Sigma-aldrich、Watson、Bisely&Company Pty Ltd.、Noah thchnologies corporation或CellMark USA,LLC)、氢氧化铝凝胶(内蒙古新宏生物科技有限公司)、20％氢氧化铝胶生理盐水(中牧实业股份有限公司)。
术语“壳聚糖”(Chitosan)包括天然壳聚糖、改性壳聚糖、壳聚糖盐类、壳聚糖衍生物中的至少一种，可以从多种生产商获得，所述生产商包括KitoZyme SA、Fluka chemine AG、the NovaMatrix unit of FMC Biopolymer AS、Heppe Medical和Sigma-Aldrich Co.。壳聚糖是由葡萄糖胺单体组成的阳离子聚合物，可以有多种数均分子量，如约400-2000kDa、约10-500kDa或约10-100kDa，或如低于约50kDa数均分子量的超低分子量材料、约50-200kDa数均分子量的低分子量材料、约200-500kDa数均分子量的中分子量材料、大于约500kDa数均分子量的高分子量材料，也可通过水解作用经过壳多糖(聚-N-乙酰基-D-葡萄糖胺)的脱乙酰作用而消除N-乙酰基基团来合成。其中，所述天然壳聚糖如从虾壳、蟹壳等海产品废弃物中提取的天然多糖，是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)共聚物组成的多糖， 是甲壳素(Chitin)脱乙酰基的产物；所述改性壳聚糖为经化学改性如酰化、酯化、烷基化，或经复合改性如接枝共聚、交联、螯合、共混所得的壳聚糖；所述壳聚糖盐类包括但不限于柠檬酸盐、硝酸盐、乳酸盐、磷酸盐、氯化物和谷氨酸盐中的一种或多种；所述其衍生物为一个或多个羟基或氨基已经被改性用于改变衍生物的溶解度或黏膜粘连特性，包括硫酸醇化壳聚糖衍生物和非硫酸醇化壳聚糖衍生物，如羧甲基、乙酰化、烷基化或磺化壳聚糖(如O-烷基醚、O-酰基酯、阳离子化三甲基壳聚糖和用聚乙二醇改性的壳聚糖)，可从多种来源获得，如硫酸醇化壳聚糖可从ThioMatrix Forschungs Beratungs公司和Mucobiomer Biotechnologische forschungs-und entwicklungs公司获得，或通过壳聚糖与合适的硫醇化试剂反应制备如申请号PCT WO03/020771A1或Roldo等人(Mucoadhesive thiolated chitosans as platforms for oral controlled drug delivery:synthesis and in vitro evaluation.European Journal of Pharmaceutic and Biopharmaceutics,2004,57:115-121)、Krauland等人(Viscoelastic properties of a new in situ gelling thiolated chitosan conjugate.Drug Development And Industrial Pharmacy.2005,31:885-893)、Bernkop-schnürch等人(Bernkop-Schnürch,Thiomers:A new generation of mucoadhesive polymers.Advanced Drug Delivery Reviews.2005,57:1569-1582；Thiomers:Preparation and in vitro evaluation of a mucoadhesive nanoparticulate drug delivery system.International journal of Pharmaceutics.2006,317:76-81)的文献中所述方法制备。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂包括铝胶、壳聚糖和磷脂。
术语“磷脂”(phospholipids/phosphatides)又称磷脂类、磷脂质，是含有磷酸的脂类，包括但不限于卵磷脂、脑磷脂即磷脂酰乙醇胺磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝胺酸、磷脂酸、鞘磷脂、心磷脂中的一种或多种，可分离自天然来源或常规合成。
术语“卵磷脂”(Lecithin)又称磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)，是甘油和胆碱与脂肪酸和磷酸的混合酯类及其衍生物，包括但不限于天然卵磷脂、合成卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、合成的二棕榈酰卵磷脂、部分或完全氢化的卵磷脂及其混合物中的一种或多种，可选自植物来源如大豆、玉米、花生、向日葵籽、油菜籽，动物来源如蛋黄和动物脑组织，或各种生产商如American lecithin Company供应的Phospholipon90G。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂中，铝胶包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾、钾明矾、硅酸铝中的至少一种。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂中，铝胶包括氢氧化铝、磷酸铝中的至少一种。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂中，铝胶包括包括HPA、M9400SP、Aluminum hydroxide、氢氧化铝凝胶、20％氢氧化铝胶生理盐水中的至少一种。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂中，壳聚糖包括天然壳聚糖、改性壳聚糖、壳聚糖其盐类或壳聚糖其衍生物中的至少一种。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂中，磷脂包括卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝胺酸、磷脂酸、鞘磷脂、心肌磷脂中的至少一种。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂中，所述磷脂为卵磷脂。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明的所述疫苗用佐剂中，卵磷脂包括天然卵磷脂、合成卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、合成的二棕榈酰卵磷脂、部分或完全氢化的卵磷脂中的至少一种。
本发明的另一方面在于提供一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含本发明所述的佐剂和免疫有效量的抗原。
术语“免疫有效量”又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫原性应答的量。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“抗原”又称免疫原，是指任何刺激免疫应答的物质，是一种能够被抗体结合的分子，还能够诱导产生B-和/或T-细胞的体液免疫应答和/或细胞免疫应答，还具有一个或多个表位(B-和T-表位)。所述抗原包括杀死的、灭活的细菌，或其培养细胞制剂、上清液。其中，所述杀死的、灭活的细菌是指含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体，病原体可通过各种方法包括冻融、化学处理(如用硫柳汞或福尔马林处理)、声处理、照射、热或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中所述抗原为灭活的抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，铝胶含量为5％-30％V/V，壳聚糖浓度为0.1-10mg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，铝胶含量为5％-30％V/V，壳聚糖浓度为0.1-10mg/ml，卵磷脂浓度为0.2-8mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，铝胶含量为8％-20％V/V，壳聚糖浓度为1-5mg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，铝胶为8％-20％V/V，壳聚糖为1-5mg/ml，卵磷脂浓度为0.5-5mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述抗原包括猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、多杀巴斯德杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪葡萄球菌抗原、支气管炎博德特菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、支气管败血波氏杆菌抗原和产毒素多杀巴氏杆菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、肠炎沙门氏菌抗原、猪红斑丹毒丝菌抗原、猪鼻支原体抗原、猪滑液支原体抗原、致病性钩端螺旋体抗原中的一种或多种。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抗原包括猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、多杀巴斯德菌抗原、猪链球菌抗原、猪葡萄球菌抗原、支气管炎博德特菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、肠炎沙门氏菌抗原、猪红斑丹毒丝菌抗原、猪鼻支原体抗原、猪滑液支原体抗原、猪钩端螺旋体细菌抗原中的一种或多种。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述抗原为猪肺炎支原体抗原和/或副猪嗜血杆菌抗原。术语“猪肺炎支原体抗原”是指含有至少一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)抗原形式的任何组合物，所述猪肺炎支原体抗原可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的或亚单位的抗原，或其培养上清液。所述猪肺炎支原体抗原包括HN0613株(保藏号为CCTCC No.M2012230，参见中国专利CN103083655A)、J株(购自美国典型培养物保藏中心ATCC，ATCC编号为25934)、NJ株(保藏号为CCTCC No.M2012286，参见中国专利CN103585622A)、HDZK-Mhp57株(保藏号为CGMCC No.8096， 参见中国专利CN103484414A)、AN306株(保藏号为CCTCC No.M2012431，参见中国专利CN103740625A)、DJ-166株(保藏号为CGMCC No.4545，参见中国专利CN103184171A)和NM04/41259株(保藏号为NM04/41259株，参见中国专利CN102458462A)的一种或多种，还可以包含以下组合物的任一种抗原如哈药集团公司的瑞倍适Respisure和瑞倍适-旺RespisureOne、英特威公司的安百克M+PAC、勃林格殷格翰公司的M.hyo、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、硕腾(上海)动物保健品有限公司的瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、梅里亚动物保健公司的猪克喘SprintVac、海博莱公司的喜宜丰Mypravac Suis。
术语“副猪嗜血杆菌抗原”是指含有至少一种副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)抗原形式的任何组合物，所述副猪嗜血杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的或亚单位的抗原，或其培养上清液。所述副猪嗜血杆菌抗原包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1-15个血清型或无法测定血清型的副猪嗜血杆菌，包含至少两个血清型的混合抗原如4型(如JS株，保藏号为CCTCC No.M2011172，参见中国专利CN103083655A)和5型(如ZJ株，保藏号为CCTCC No.M2011173，参见中国专利CN103083655A)的混合抗原的一种或多种，还可以包含以下组合物的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1、海博莱公司Hipra的Hiprasuis-Glasser、中牧实业股份有限公司成都药械厂的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗和武汉科前动物生物制品有限责任公司的科富宁(4型MD0322株+5型SHO165株)。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体抗原包括HN0613株、J株、NJ株、HDZK-Mhp57株、AN306株、DJ-166株、NM04/41259株抗原， 或瑞倍适Respisure和瑞倍适-旺RespisureOne、安百克M+PAC、M.hyo、MycoGard、RespiFend MH、瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、猪克喘SprintVac、喜宜丰Mypravac Suis；以及
所述副猪嗜血杆菌抗原包括4型JS株和5型ZJ株的混合抗原，或Ingelvac HP-1、Hiprasuis-Glasser、科富宁、中牧实业股份有限公司成都药械厂的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗中的一种或多种。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物包括1×108CCU/头份的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原、1×109CFU/头份的灭活的副猪嗜血杆菌4型JS株抗原和1×109CFU/头份的灭活的副猪嗜血杆菌5型ZJ株抗原；以及10％V/V的铝胶、4mg/ml壳聚糖和2mg/ml卵磷脂。
术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，包括小猪、大母猪、小母猪、公猪等猪科的成员。
本发明第三方面在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌感染相关疾病的的药物中的应用。
术语“预防和/或治疗”在涉及细菌感染时是指抑制细菌的复制、抑制细菌的传播或防止细菌在其宿主体内定居，以及减轻细菌感染所之疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、感染症状减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中猪肺炎支原体抗原以灭活的猪肺炎支原体 HN0613株，副猪嗜血杆菌抗原以灭活的4型副猪嗜血杆菌JS株和5型副猪嗜血杆菌ZJ株为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变，对发病程度进行量化判定，包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现的实质样病变，如“肉样变”、“胰样变”。肺炎病变评分标准为：2个尖叶、2个心叶、2个膈叶、1个中间叶共计7个肺叶，每个肺叶满分为4分，共计28分。根据发生实质病变的肺叶面积所占该叶的比例，分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为0分；病变面积比例为1％-25％，记为1分；病变面积比例26％-50％，记为2分；病变面积比例为51％-75％，记为3分；病变面积比例为76％-100％，记为4分。如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对照组猪进行记分后，按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率：
本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。
本发明中所用的pH7.4PBS溶液配方为：800ml蒸馏水中加入NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.42g、KH2PO4 0.27g，调pH值至7.4，定容至1000ml，经121℃高压灭菌30分钟后使用，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐 述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1抗原的制备
1.1猪肺炎支原体抗原的制备
按照中国专利CN103083655A进行制备猪肺炎支原体HN0613株菌液及测定菌液的含量，结果：猪肺炎支原体HN0613株的含量为1×109CCU/ml；并对菌液进行灭活及检验，结果：培养基着色未发生变化，培养基pH值不降低，表明猪肺炎支原体HN0613株菌液灭活成功。
1.2副猪嗜血杆菌抗原的制备
按照中国专利CN103083655A分别制备副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌液及测定菌液含量，结果：副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株的含量均为5×109CFU/ml；并对菌液进行灭活及检验，结果：平皿中无任何细菌生长，表明副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌液灭活均成功。
实施例2佐剂的制备
铝胶：购自美国General Chemical,LLC的HPA佐剂。
壳聚糖母液：将购自青岛海汇生物工程有限公司的壳聚糖(分子量为145kD，脱乙酰度为50％)完全溶解于含1％V/V醋酸水溶液中配制成浓度为15mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用NaOH调节溶液至pH7.4，并进行过滤除菌，即得15mg/ml壳聚糖母液。
卵磷脂母液：将购自北京源华美磷脂科技有限公司的1g卵磷脂用乙醇溶解，加入PBS溶液混合均匀后进行减压蒸馏，待乙醇挥发尽后置于组织捣碎机搅拌10分钟，于115-125℃蒸汽灭菌30分钟，用超声波超声搅拌两次，10分钟/次，加入PBS溶液至100ml， 并进行过滤除菌，即得10mg/ml卵磷脂母液。
实施例3灭活疫苗组合物的制备及动物试验
3.1灭活疫苗组合物的制备
将实施例1制备的抗原、实施例2制备的佐剂使用PBS溶液稀释，使稀释后的各抗原溶液与佐剂终浓度按表1中灭活的疫苗组合物所含组分混合，以500-800转/分钟的转速搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入1％V/V的硫柳汞(购自国药集团化学试剂有限公司)溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀、分装，分装后2-8℃保存备用。
表1灭活疫苗组合物所含组分
3.2灭活疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原的动物试验
将实施例3.1所制备的疫苗组合物A1、A2、A3、A5、B1、B2、B3、B5，分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，5头/组，2ml/头，同时设置参考疫苗对照组、攻毒对照组，共10组(共50头仔猪)。免疫接种后测量体温、观察副反应至28日，并于28日按照猪肺 炎支原体抗体检测试剂盒(购自IDEXX)说明书进行抗体检测，结果见表2；同时对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株(购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CVCC354)，100MID50/头，观察28天后解剖，并观察肺部病变，按照28分法对肺部病变进行评分。攻毒前后，分别对试验组仔猪进行称重，并计算平均日增重。
攻毒后大约10天左右，攻毒对照组其中5头猪陆续出现咳嗽、气喘等症状，皮毛不光滑；参考疫苗对照组有2头猪出现了咳嗽的症状、并发生了副反应；其他免疫组的猪未出现气喘病的类似症状。攻毒前后，各试验组猪的肺炎病变平均得分和平均日增重结果见表2。
表2灭活疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原的动物试验结果
注1：参考疫苗对照组所选用的疫苗为现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)，即安百克(M+PAC)，按厂家说明书进行免疫。
注2：体温“无”表明未发生一过性体温升高，“有”表明发生一过性体温升高，其中一过性体温升高是指于二免疫后第1-2天体温会短暂呈现40.5度，并于第3天恢复正常体温。
注3：副反应“无”表明未发生过副反应，“有”表明发生过 副反应，其中副反应是指出现过短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏反应中的至少一种。
注4：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。
由表2可知：1-4组、5-8组分别使用同样含量猪肺炎支原体抗原和不同含量、成分佐剂的单苗或联苗进行免疫，免疫后的血清抗体表明含铝胶、壳聚糖佐剂的疫苗组合物及含铝胶、壳聚糖、卵磷脂佐剂的疫苗组合物的抗体水平均高于参考疫苗的抗体水平，且含铝胶、壳聚糖、卵磷脂佐剂的疫苗组合物的抗体水平高于含铝胶、壳聚糖佐剂的疫苗组合物的抗体水平；之后进行攻毒，结果显示1-4组、5-8组免疫猪均未发生一过性体温升高，也未出现副反应，并且肺炎病变减少率分别均＞67％、＞80％，平均日增重分别为0.0399-0.04016kg、0.0412-0.0414kg，虽1-4组各小组、5-8各小组之间差异不显著(p＞0.05)，但1-4组与5-8组相比差异均显著(p＜0.05)；与参考疫苗对照组相比，差异也均显著(p＜0.05)；与攻毒对照组相比，差异也均显著(p＜0.05)。表明疫苗组合物中佐剂含铝胶、壳聚糖、卵磷脂的免疫效果显著优于含铝胶、壳聚糖的。
3.3灭活疫苗组合物之副猪嗜血杆菌抗原的动物试验
将实施例3.1所制备的疫苗组合物A4、A5、B4、B5，分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，5头/组，2ml/头，同时设置参考疫苗对照组、攻毒对照组，共6组(依次命名为1、2、3、4、参考疫苗对照组1、攻毒对照组1)；同时做重复试验，共6组(命名为11、12、13、14、参考疫苗对照组2、攻毒对照组2)，详见表3。
免疫接种后测量体温、观察副反应至28日，结果见表3；并于免疫接种后28日按照副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒(购自Biovet)进行抗体检测，结果见表3。同时进行攻毒，前6组用副猪嗜血杆菌4型JS株腹腔注射3ml进行攻毒，攻毒剂量为9.0× 109CFU/头；后6组用副猪嗜血杆菌5型ZJ株腹腔注射3ml进行攻毒，攻毒剂量为6.0×109CFU/头，攻毒后观察各组猪临床表现，观察14天后剖杀进行病理观察。攻毒前后分别对试验组仔猪进行称重，以计算平均日增重，结果见表3。
表3灭活疫苗组合物之副猪嗜血杆菌抗原的动物试验结果
注1：参考疫苗对照组所用副猪嗜血杆菌病灭活疫苗为中牧实业股份有限公司成都药械厂生产的，抗原含量为4.0×109CFU/头份，按照厂家说明书进行两次免疫。
注2：体温“无”表明猪只均未发生一过性体温升高，“有”表明至少1只猪出现过一过性体温升高，其中一过性体温升高是指于二免疫后出现1-3天体温会短暂呈现40.5度及以上，并于第4天恢复正常体温。
注3：副反应“无”表明猪只均未发生过副反应，“有”表明至少1只猪发生过副反应，其中副反应是指出现过短暂性精神萎靡、 咳嗽、呼吸困难、食欲减退、过敏反应中的至少一种。
注4：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。
由表3可知：1-2、3-4、5-6、7-8组分别使用含副猪嗜血杆菌抗原和同样含量佐剂的单苗或联苗进行免疫，免疫后均未出现体温升高、也未发生副反应，所产生的血清抗体表明含铝胶、壳聚糖佐剂的自制疫苗及含铝胶、壳聚糖、卵磷脂佐剂的疫苗组合物的抗体水平高于参考疫苗的抗体水平，且含铝胶、壳聚糖、卵磷脂佐剂的疫苗组合物的抗体水平高于含铝胶、壳聚糖佐剂的疫苗组合物的抗体水平；之后进行攻毒，结果显示1-2、3-4、5-6、7-8组免疫猪只均获得完全保护，平均日增重分别为0.0324-0.0325kg、0.0336-0.0337kg、0.0324-0.0327kg、0.0338-0.0339kg。虽1-2组各小组、3-4各小组、5-6组各小组、7-8组各小组之间差异不显著(p＞0.05)，但1-2组与3-4组差异均显著(p＜0.05)、5-6组与7-8组差异均显著(p＜0.05)；与参考疫苗对照组相比，抗原含量低时免疫保护效率也较高，且平均日增重差异均显著(p＜0.05)；与攻毒对照组相比，平均日增重差异均显著(p＜0.05)。表明含铝胶、壳聚糖、卵磷脂佐剂的疫苗组合物的免疫效果显著优于含铝胶、壳聚糖佐剂的疫苗组合物的免疫效果。
综上所述，含铝胶、壳聚糖、卵磷脂佐剂的疫苗组合物的免疫效果显著优于含铝胶、壳聚糖佐剂的疫苗组合物的免疫效果，这些疫苗组合物(1)免疫动物后的免疫应答水平随佐剂含量的增加而有所升高，且与现有商品化疫苗的免疫应答水平相当甚至较高，抗体持续时间也较长，无体温升高、无副反应发生，效果确实；(2)在抗原含量较低时也能使动物获得较好的免疫效果，免疫次数少也可使猪的应激反应减少甚至消失。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任 何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。