CD146及其抗体在治疗三阴性乳腺癌方面的应用的制作方法

本发明属于免疫诊断和生物治疗领域。具体地说，本发明涉及CD146分子及其抗体在治疗乳腺癌方面的应用。更具体地，CD146单克隆抗体AA98及其功能形式的功能在于抑制三阴性乳腺癌细胞间质细胞特征及恶性特征，从而抑制肿瘤转移侵袭。

背景技术：

乳腺癌是女性中最常见且致死率最高的恶性肿瘤。全球每年有将近130万女性患上乳腺癌，并且有超过40万女性因为乳腺癌的转移复发而死亡。乳腺癌中恶性程度最高的一种亚型，称为三阴性乳腺癌，以雌激素受体(ER)阴性/黄体激素受体(PR)阴性/表皮生长因子受体(HER2)阴性为特征。三阴性乳腺癌的发病率约占乳腺癌中的17％～25％，由于缺乏抗雌激素和抗HER2靶向治疗的靶标，以及极高的概率发生转移复发，是预后最差的一种乳腺癌类型。

目前，在临床上治疗三阴性乳腺癌主要是化疗药物，例如顺铂及蒽环类药物，主要发挥预防肿瘤转移的功能。这类药物没有靶向性，对全身正常的组织器官也将造成损害，具有很强的毒副作用。另外，尽管三阴性乳腺癌在化疗早期对化疗药物比较敏感，但是预后依旧很糟糕。因此，探索三阴性乳腺癌的发病机理，并从中发掘新靶标，是三阴性乳腺癌治疗的新方向。

大量文献报道，上皮细胞向间质细胞转化的机制(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在三阴性乳腺癌的转移复发中发挥重要作用。EMT赋予肿瘤细胞侵袭转移能力，耐药性以及干细胞特征。从基因分型来说，三阴性乳腺癌属于基底样乳腺癌的类型，其肿瘤细胞更倾向于表达间质细胞的标记分子，被认为是一类已经发生EMT的乳腺癌类型，并通过EMT的机制发生远端迁移至脑部、肺部等重要脏器。由于三阴性乳腺癌细胞的间质细胞性质特征在一定程度上解释了肿瘤的恶性转移程度，抑制其间质细胞特征并发掘新的相关靶标分子将成为三阴性乳腺癌细胞治疗的潜在方向。由于很多重要的生长因子受体相关的酪氨酸激酶活化、TGF-β相关信号通路，以及整合素等细胞黏附分子相关的信号通路在诱导上皮来源的肿瘤细胞发生EMT的过程中发挥 重要作用，以这些信号通路为靶标的抗体药物、小分子抑制剂以及拮抗剂被大量证明通过抑制EMT而达到治疗肿瘤转移侵袭的效果(Targeted therapies in control of EMT in carcinoma and fibrosis.Kian-Ngiap Chua，Jing Ma，Jean-Paul Thiery.DOI：10.1016/j.ddmec.2008.06.002)。例如，cystatin C，一种丝氨酸抑制剂，在乳腺癌细胞中被发现可以作为TGF-β受体的拮抗剂，进而抑制TGF-β与其受体的结合及激活下游诱导EMT发生的信号通路。因此，cystatin C可以作为潜在的药物用于受TGF-β调节的乳腺癌治疗中。

技术实现要素：

本发明首次提出CD146是三阴性乳腺癌的新靶标，抗CD146抗体是治疗这类疾病的新型靶向药物。与传统的化疗药物相比，抗CD146抗体的副作用小，不会引起全身范围的组织器官损伤。CD146及其抗体在三阴性乳腺癌诊断和治疗中的应用是基于以下重要的科学发现：(1)CD146分子在三阴性乳腺癌病理组织中特异性高表达；(2)CD146在上皮性质乳腺癌细胞MCF-7细胞中过表达之后，诱导细胞发生EMT，赋予细胞侵袭转移能力；(3)在原位乳腺癌老鼠模型(Orthotopic Breast Cancer Mouse Model)中CD146分子的过表达促进乳腺肿瘤的形成，降低肿瘤的分化程度，以及促进肿瘤的原位侵袭及远端迁移；(4)在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中使用siRNA下调CD146分子的表达或使用CD146的功能性抗体AA98，可以抑制其间质细胞性质特征，降低细胞转移侵袭能力。

综上所述，CD146的过表达可以诱导上皮性质的肿瘤细胞发生EMT，这对三阴性乳腺癌的发生及进展具有重要作用。同时，CD146分子对维持三阴性乳腺癌的间质细胞特征及恶性程度有重要功能。我们自主研制的抗CD146功能性抗体AA98可以在体外抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移及侵袭能力。因此，我们提出CD146可以作为三阴性乳腺癌的靶标分子，其功能性抗体AA98可以通过结合细胞膜表面的CD146分子，通过抑制其下游信号通路，从而阻断其诱导EMT的功能，或者抑制恶性肿瘤细胞的间质性质特征。同时，该种抗体的特异性较好，不会引起全身范围的免疫功能性的损伤。

因此，本发明一方面涉及抗CD146的抗体或该抗体的功能形式在制备用于治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。

在本发明中，抗CD146的抗体或该抗体的功能形式可包括抗CD146的单克隆抗 体、基因工程抗体和人源化抗体。此类抗体可根据本领域大量公开的文献容易地制备。

在本发明中，抗CD146的抗体或该抗体的功能形式是抗CD146的抗体的功能耦合物，其中与抗体结合的物质可以是药物、毒素、放射活性剂、酶、细胞因子或另一种抗体。

在本发明中，抗CD146的抗体优选地是单克隆抗体AA98。

本发明又一方面涉及抗CD146的抗体或该抗体的功能形式在制备用于三阴性靶向性治疗的药物中的应用。优选地，所述抗CD146的抗体或该抗体的功能形式包括抗CD146的单克隆抗体、基因工程抗体和人源化抗体。更优选地，所述抗CD146的抗体是单克隆抗体AA98。

本说明书中使用的抗体AA98、AA4、AA1等可根据中国专利申请号99107586.2、中国专利申请号200810057260.7的描述获得。

为了更全面地理解和应用本发明，提供下列实施例。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.A：临床标本：CD146在三阴性乳腺癌病人肿瘤组织病理切片中特异性高表达；B：三阴性乳腺癌vs.非三阴性乳腺癌：88.9％vs.8.7％，p＜0.0001。

图2.CD146在MCF-7细胞中过表达，筛选出稳定克隆。其中Mock为对照，转入空载；B10和A5是CD146表达株，B10中等表达CD146，A5为高表达CD146。

图3.CD146的过表达诱导细胞发生EMT。A-B，Mock、B10和A5依次发生EMT相关的细胞形态及信号分子变化；C，Mock、B10和A5细胞迁移能力依次增强；D，Mock、B10和A5侵袭细胞数。

图4.在体内水平，CD146过表达导致增加乳腺癌肿瘤生成(A)，并减低肿瘤分化程度(B)，以及肿瘤的原位迁移(C)；

图5.在体内水平，CD146过表达促进乳腺癌远端迁移(A-D)；

图6.在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中下调CD146表达逆转其间质细胞特征。(A)Western Blot鉴定乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及Hs78T细胞EMT相关标记分子(B)CD146表达下调导致EMT相关标记分子的变化；(C)CD146表达下调导致细胞形态的逆转；(D-E)CD146表达下调导致细胞迁移及侵袭能力的下降；

图7.抗CD146功能性抗体AA98抑制三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的间质细胞特征(A-D)。

图8.Sigma公司真核表达质粒p3XFLAG-HA-cmv-14图谱。

具体实施方式

实施例一：CD146在三阴性乳腺癌病人肿瘤组织病理切片中特异性高表达；

细胞黏附分子在乳腺癌发生发挥过程中发挥重要作用。CD146分子是一个有关血管新生及肿瘤转移的重要细胞黏附分子。为了研究CD146在乳腺癌中的作用，我们对90例乳腺癌组织病理切片进行免疫组化分析，发现CD146分子在三阴性乳腺癌中特异性高表达。

主要材料：乳腺癌病人肿瘤组织石蜡切片，包括44例三阴性乳腺癌及46例非三阴性乳腺癌组织，均来源于天津肿瘤医院；

主要试剂：4％多聚甲醛，二甲苯，无水乙醇，无水甲醇，过氧化氢，PBS，小鼠抗CD146单克隆抗体AA4；本说明书中使用的抗体AA98、AA4、AA1等可根据中国专利申请号99107586.2、中国专利申请号200810057260.7的描述获得。

主要方法：石蜡切片制作：用4％多聚甲醛固定新鲜组织24小时后，石蜡包埋，以下为石蜡切片的免疫组化过程：

1)取出片子，入二甲苯溶液37℃脱蜡两次，每次30分钟；

2)入无水乙醇×2-95％-80％-70％-50％-30％和蒸馏水中水化，室温每次5分钟；

3)0.3％过氧化氢/甲醇溶液37℃避光处理30分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗三次；

4)pH6.0柠檬酸修复液100℃水浴30分钟抗原热修复，自然冷却；

5)5％的正常羊血清37℃封闭1小时；

6)加入PBS稀释的一抗(兔抗CD146多抗或AA4)，4℃孵育过夜；

7)PBS洗三次；山羊抗-兔-生物素或山羊-抗-小鼠-生物素二抗(购自中衫金桥)(1∶1000)在37℃孵育1小时，PBS洗三次；

8)亲和素-HRP(1∶1000)在37℃孵育45分钟；

9)用现配的DAB避光显色2-7分钟，再进行苏木素复染。

10)逐级脱水：50-70-80-90-100-100％乙醇-二甲苯，晾干，中性树脂封 片。

11)显微成像系统中拍片。

结果显示，如图1所示，相比于非三阴性乳腺癌组织，CD146分子在三阴性乳腺癌组织中特异性高表达。CD146表达在肿瘤细胞的细胞膜，并更倾向于表达在肿瘤迁移的边缘。

实施例二：CD146过表达诱导上皮性质乳腺癌细胞MCF-7发生EMT；

我们选择了CD146阴性的细胞系MCF-7细胞(购自上海细胞库，目录号为TCHu74)作为了细胞模型，发现CD146在恶性的三阴性乳腺癌组织中高表达具有重要意义。MCF-7是一个上皮性质的乳腺癌肿瘤细胞系，恶性程度低，分化程度高，细胞迁移能力极弱。我们在MCF-7中过表达CD146分子，构建获得了2个稳定表达株，B10和A5，其中B10中等表达CD146，A5为高表达CD146。同时，我们也在MCF-7细胞中转入空载体，构建了对照稳定株Mock。具体过程如下详述。

主要试剂：CD146 cDNA(SEQ ID NO：7)武汉三鹰生物技术有限公司购买获得(编号：BC056418，载体质粒为pCMV-SPORT6)，所编码的蛋白质序列见SEQ ID NO：8。我们选择了真核表达质粒p3XFLAG-HA-cmv-14(购买于Sigma公司，编号E4901)构建CD146真核表达质粒，原始质粒图谱见图8。CD146 cDNA通过EcoRI与BamHI两个酶切位点插入p3XFLAF-HA-cmv-14，构建后所得的目的质粒由本实验室长期保存。其中从含有CD146 cDNA的载体质粒上PCR出5’及3’端分别带有EcoRI与BamHI的CD146 cDNA片段运用的引物为：正向5’-CGGAATTCA ATG GGG CTT CCC AGG CTG-3’(SEQ ID NO：1)；反向5’-GCG GAT TCA TGC CTC AGA TCG ATG TA-3’(SEQ ID NO：2)。转染试剂为罗氏Fugene HD。G418试剂购买于Sigma。Transwell技术使用的96孔板(8μm)购买于美国康宁(Coring)。本说明书中使用的抗体AA98、AA4、AA1等可根据中国专利申请号99107586.2、中国专利申请号200810057260.7的描述获得。抗E-cadherin抗体、抗cytokeratin抗体、抗Fibronectin抗体、抗GAPDH抗体购买于Abcam，抗Vimentin抗体购买于Sigma。胰酶购买于Gibco。Matrigel购于BD biosciences公司。

主要方法：采用脂质体转染试剂转染真核细胞，并采用G418抗性筛选出单克隆，再运用Western Blot、流式细胞仪、Transwell技术等鉴定所得细胞的特性。

(1)将MCF-7细胞种在2个35mm的细胞培养皿中，使第二天转染时细胞密度 达到80％左右。

(2)根据罗氏Fugen HD转染试剂的说明，分别对两个25mm培养皿中的MCF-7细胞转染p3XFlag质粒或p3XFlag-CD146质粒，48h后分别加入G418(0.5μg/ml)进行筛选；

(3)1周后，等存活的细胞长满后，胰酶消化细胞后，用新鲜培养基稀释细胞密度至1X10⁴个/ml，种于96孔板，对多克隆进行单克隆化。

(4)96孔板的细胞长满后，扩大到35mm培养皿进行培养，并采用流式分析的方法对CD146的表达量进行检测，挑选不同表达量的CD146克隆。

(5)对挑选出的克隆继续在G418存在的情况下培养约2-3月，待克隆稳定后即可进行后续细胞形态观察、细胞迁移侵袭测试等实验。对于细胞迁徙实验，5X10³个细胞种于Tranwell板中的上孔，培养在50μl无血清的MEM培养基中，下孔中为含200μl10％血清的MEM培养基作为诱导，14-18h后，上孔中的培养基被吸干，覆盖于膜上的细胞被蘸了70％的酒精的棉球棒擦干净，膜被揭下并倒扣在在玻片上。迁移过来的细胞用4％的PFA固定并结晶紫染色，显微镜拍照并计数。每个细胞需要设计3个平行对照孔。对于细胞侵袭实验，膜上需预先覆盖2.5mg/ml的Matrigel胶，1X10⁴个细胞将用于该实验。接下步骤与上同。

如图3所示，在MCF-7稳定克隆株Mock、B10和A5这一系列中，我们观察到有关EMT的相关变化。首先，Mock细胞维持母本MCF-7细胞的典型的上皮性质细胞的形态，细胞成片生长，呈铺路石状，其紧密连接。然而，高表达CD146分子的A5细胞形态发生极大变化，细胞分散生长成梭性。中等表达CD146分子的B10细胞形态处于两种的中间状态。其次，Western Blot实验表明Mock细胞表达典型的上皮细胞的标记分子，例如E-cadherin和Cytokeratin。而A5细胞表达典型的间质细胞的标记分子，例如Vimentin和Fibronectin。(Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and Disease，Jean Paul Thiery，Hervé Acloque，Ruby Y.J.Huang and M.Angela Nieto.Cell 139，November 25，2009)。最重要的是，应用Transwell技术(Leukocyte transmigration through vascular endothelium.An in vitro method.Allavena P，Del Maschio A.Methods Mol Biol.1999；96：171-6)，我们能发现CD146在A5细胞中的高表达显著地增强了细胞迁徙及侵袭能力。

实施例三：在原位乳腺癌老鼠模型中CD146过表达促进乳腺肿瘤的形成，降低肿瘤的分化程度，并促进肿瘤的原位侵袭及远端迁移；

我们利用SCID/Beige构建了原位移植的乳腺癌小鼠模型，发现在体内水平CD146的高表达对乳腺癌的发生发展具有重要作用。

实验方法：选择20只4周大小雌性的SCID/Beige(购于维通利华)小鼠，随机分为2组。分别在乳腺脂肪组织垫注射1×10⁶个MCF-7细胞来源的克隆Mock或A5细胞重悬在50ul PBS，与50ul 2.5mg/ml的Matrigel混合。每周观察1次，测量长、宽及高，以便计算肿瘤体积。10周后，当有荷瘤鼠变得虚弱后，脱颈法处死所有小鼠，剥离肿瘤和重要脏器，4％PFA固定24小时后，石蜡包埋，切片并做免疫组化分析。

结果如图4、图5所示，Mock细胞在SCID/Beige小鼠上成瘤性差，10只小鼠中只有3只成瘤，且肿瘤体积偏小，肿瘤组织结构完整，表明分化程度高，且没有发生原位侵袭及远端迁移。而形成鲜明对比的是，CD146高表达的A5细胞成瘤容易，10只小鼠中只有8只成瘤，且肿瘤体积普遍偏大，肿瘤组织结构混乱，表明分化程度低。更重要的是，A5形成的肿瘤显著地侵袭到邻近的正常组织，例如皮肤，乳腺，肋骨等，且转移到了肺部及肝脏。

实施例四：在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231下调CD146或抗CD146功能性抗体AA98表达抑制其间质细胞特征。

主要试剂：靶向CD146的siRNA序列：正向5’-CCA GCU CCG CGU CUA CAA AdTdT-3’(SEQ ID NO：3)，反向5’-UUU GUA GAC GCG GAG CUG GdTdT-3’(SEQ ID NO：4)；靶向GFP的siRNA序列：正向5’-CUU CAG CCU CAG CUU GCC GdTdT-3_(SEQ ID NO：5)，反向5’-CGG CAA GCU GAC CCU GAA GdTdT-3’(SEQ ID NO：6).Lipofectin 2000转染试剂购于Invitrogen公司。

主要方法：(1)MDA-MB-231细胞分于2个35mm细胞培养皿中，以使第二天转染siRNA时密度达到70％左右。根据Lipofectin 2000的转染要求，分别对两个35mm培养皿的MDA-MB-231细胞转染siRNA-GFP或者siRNA-CD146，48h后使用RIPI裂解缓冲液裂解细胞，做总蛋白定量之后跑SDS-PAGE，并进行Western Blot进行相关分子的检测。确认CD146在MDA-MB-231细胞中表达下调的效果后，进一步进行细胞形态变化观察、细胞侵袭迁移能力等测试。

(2)MDA-MB-231细胞分于2个35mm细胞培养皿后，立即加入mIgG及AA98 (50mg/ml)进行刺激，48h后进行各种检测，与上同。

我们进一步选择三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(购自ATCC，编号HTB-26^TM)为研究模型，使用靶向CD146分子的siRNA(于Invitrogen合成)下调CD146的表达或抗CD146功能性抗体AA98，发现CD146对维持间质细胞特征的肿瘤细胞的恶性程度具有重要功能。

结果如图6、图7所示，靶向CD146分子的siRNA将MDA-MB-231细胞中CD146蛋白水平下调到原来的三分之一。我们观察到梭性的细胞开始部分回圆。与此同时，间质细胞的标记分子vimentin及Fibronectin表达下调，上皮细胞的标记分子E-cadherin表达上调。更重要的是，细胞迁移及侵袭能力受到了抑制。同时，抗CD146功能性抗体AA98也可以显著抑制MDA-MB-231细胞间质细胞标记分子Slug表达，上调上皮细胞标记分子E-cadherin的表达，并抑制细胞迁移能力。