专利名称：梅毒螺旋体抗体酶诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断梅毒螺旋体感染的梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂。
目前梅毒检测常见的方法有RPR、TPHA、ELISA等。RPR(即快速血清反应素环状卡片试验法)检测的是梅毒螺旋体非特异性抗体，方法的敏感度差，特异性差，有30％以上的假阴性和假阳性，由于梅毒对人类的危害性极大，而且传播力强，因此，提高其检测的特异性和敏感性同样重要。TPHA(梅毒螺旋体反向间接血球凝集试验)法虽然特异性高但敏感性不如ELISA(梅毒螺旋体抗体酶标诊断)法，而且试剂稳定性操作必须依赖手工，不能实现自动化，无法进行批量检测，因此其实用性能远远不如ELISA法，故研制使用方便、灵敏、稳定的ELISA法梅毒检测试剂盒用来代替RPR和TPHA，作为诊断梅毒的初筛和确诊试验是当务之急。
近年来，梅毒ELISA试剂的应用逐渐得到普及，常见的梅毒ELISA试剂普遍存在一个问题。由于其显色系统不稳定，通常把显色底物TMB、过氧化氢分开保存使用滴加，这使得大批量血源筛选时工作量将增大一倍，更危险的是在密密麻麻的酶标微孔中万一漏加其中一个显色底物时，造成检测结果呈假阴性，如果是梅毒阳性血清因为假阴性而造成输血传染其危害是可想而知。
TMB是ELISA试剂常用的显色剂，由于3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(简称TMB)难溶于水，通常需加大量的溶剂来增加其溶解度；和反应体系中的另一显色底物过氧化氢混合在一起使用时容易变兰色，造成临床判断失误(超出CutOff值)，对病人、医院都造成负担和浪费。
为了达到上述目的，本发明所提供的一种梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，包括用合成肽抗原或基因工程表达的抗原P15、P17、P47抗原0.1～10μg/ml包被在酶标板上、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶20～1∶100K酶标二抗稀释溶液和显色剂组合及增溶剂，所述的显色剂组合中的显色剂是TMB丙磺酸钠；所述的显色剂组合包括TMB丙磺酸钠与过氧化氢异丙苯或其衍生物的组合，也可以是TMB丙磺酸钠与羟基脲的组合。所述增溶剂可以是N-甲基-2-吡咯烷酮、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜。所述的显色剂组合含量可以是TMB丙磺酸钠0.01～0.5份，其余配合成份可以是ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.01～0.5份、哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液5-200mmol/L，缓冲液pH3～9、过氧化氢异丙苯或其衍生物0.01～0.5份、N-甲基-2-吡咯烷酮0.1～50份，乙醇1-50份。所述的显色剂TMB丙磺酸钠含量是0.01～0.5份，其余配合成份还可以是ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.01～0.5份、哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液5-200mmol/L，缓冲液pH3～9、羟基脲0.01～0.5份、羟丙基环糊精0.1～50mmol/L、二甲基亚砜1～50份。
本发明提供的梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，在应用合成肽抗原、基因工程表达的抗原基础上，使用了一种新型水溶性极好、性能稳定的TMB盐类，配合适量的增溶剂、稳定剂，使梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂获得了更好的稳定性能。其高特异性、高灵敏度、操作简便、试剂稳定，使得梅毒检测能自动化、血源批量筛选、规范化管理得到了保证。
实施例1试剂组成1、用合成肽抗原或基因工程表达的抗原P15、P17、P47抗原1μg/ml包被在酶标板上。
2、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶35K酶标二抗稀释溶液3、二合一显色剂TMB丙磺酸钠0.05份；
过氧化氢异丙苯0.05份；N-甲基-2-吡咯烷酮10份；乙醇10份；ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.05份；哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液20mmol/L pH7.0。
实施例2试剂组成1、用合成肽抗原或基因工程表达的抗原P15、P17、P47抗原1□g/ml包被在酶标板上。
2、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶35K酶标二抗稀释溶液3、二合一显色剂TMB丙磺酸钠0.05份；羟基脲0.05份；羟丙基环糊精-5mmol/L；二甲基亚砜10份；ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.05份；哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液20mmol/L pH7.0。
对照例试剂主要组成1、用合成肽抗原或基因工程表达的抗原P15、P17、P47抗原1□g/ml包被在酶标板上。
2、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶35K酶标二抗稀释溶液3、二合一显色剂TMB0.03份羟基脲0.05份丙酮20份柠檬酸缓冲液20mmol/L pH4.5检测方法样本-10μl用100μl样本稀释液在上述包被抗原的酶标板孔中混匀，置37℃30分钟后取出用洗液洗板5次，加入上述酶标抗体100μl/孔，置37℃20分钟取出用洗液洗板5次，加入上述各例中的二合一显色剂100μl/孔，37℃10分钟，取出加入终止液100μl/孔，在酶标仪450nm/650nm处读取A值。
本系统CutOff值在0.18-0.20之间
1、检测阳性标本的吸光度及试剂空白(显色剂)的稳定性表一
*试剂颜色变蓝色**试剂颜色变深蓝色从表一可以看出，实施1、2反应灵敏度与对照例没有太大差异，仍有较高的灵敏度，实施1、2的TMB显色系统非常稳定，一年仍保持空白很低，而对照例七天就明显出现兰色已超出CutOff值无法使用。
2、临床对照测定方法同上105例 梅毒血清对照结果表二
从表二可以看出本发明的实施例、对照例与国内常见的RPR方法相比有较高的特异性，是一种值得推广的新方法。
对于所选用的不同增溶剂和稳定剂，还可提供不同的梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂实施例
2、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶35K酶标二抗稀释溶液3、二合一显色剂TMB丙磺酸钠0.5份；羟基脲0.01份；N-甲基-2-吡咯烷酮50％份；ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.5份；哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液100mmol/L pH8.0。
2、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶35K酶标二抗稀释溶液3、二合一显色剂TMB丙磺酸钠0.01份；羟基脲0.5份；羟丙基环糊精50mmol/L；二甲基亚砜20份；ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.01份；哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液5mmol/L pH4.0。
权利要求
1.一种梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，包括用合成肽抗原或基因工程表达的抗原P15、P17、P47抗原0.1～10μgg/ml包被在酶标板上、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶20～1∶100K酶标二抗稀释溶液和显色剂组合，其特征是所述的显色剂组合中的显色剂是TMB丙磺酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，其特征是所述的显色剂组合包括TMB丙磺酸钠与过氧化氢异丙苯或其衍生物的组合或TMB丙磺酸钠与羟基脲的组合。
3.根据权利要求2所述的一种梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，其特征是所述的显色剂组合含量是TMB丙磺酸钠0.01～0.5份，其余配合成份是ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.01～0.5份、哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液5-200mmol/L，缓冲液pH3～9、过氧化氢异丙苯或其衍生物0.01～0.5份、N-甲基-2-吡咯烷酮0.1～50份、乙醇1-50份。
4.根据权利要求2所述的一种梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，其特征是所述的显色剂是TMB丙磺酸钠0.01～0.5份，其余配合成份是ProClin300(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)0.01～0.5份、哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)缓冲液5-200mmol/L，缓冲液pH3～9、羟基脲0.01～0.5份、羟丙基环糊精0.1～50mmol/L、二甲基亚砜1～50份。
全文摘要
本发明公开了一种用于诊断梅毒螺旋体感染的梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂。它包括用合成肽抗原或基因工程表达的抗原P15、P17、P47抗原0.1～10μg/ml包被在酶标板上、酶标二抗(IgG、IgM)含1∶20～1∶100 K酶标二抗稀释溶液和显色剂组合及增溶剂，所述的显色剂组合中的显色剂是TMB丙磺酸钠。显色剂组合可包括TMB丙磺酸钠与过氧化氢异丙苯或其衍生物的组合或TMB丙磺酸钠与羟基脲的组合。这种梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，在应用合成肽抗原、基因工程表达的抗原基础上，使用了一种水溶性极好、性能稳定的TMB盐类，配合适量的增溶剂、稳定剂，使梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂获得了更好的稳定性能。其高特异性、高灵敏度、操作简便、试剂稳定，使得梅毒检测能自动化、血源批量筛选、规范化管理得到了保证。
文档编号G01N33/571GK1405565SQ0213762
公开日2003年3月26日 申请日期2002年10月24日 优先权日2002年10月24日
发明者肖洪武 申请人:肖洪武