一种工程化牙周组织的制备方法与流程
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种用于牙周组织重建与再生的工程化牙周组织的制备方法。
背景技术：
牙周炎是一种口腔常见病，其病理特点为牙周附着的丧失及牙槽骨的退缩，病变过程累及牙龈、牙槽骨、牙周膜和牙骨质等牙齿的支持组织，最终导致牙齿的脱落，给患者带来极大痛苦。因此，探索牙周组织再生的方法，对促进牙槽骨及牙周膜的再生，具有非常重要的临床意义。
目前临床上应用的促使牙周再生的方法主要有两种，骨或生物活性材料移植以及诱导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）。然而，使用自体骨移植或者生物活性材料虽然能在骨内袋中有新骨的形成，但是组织学并未证实这些部位同时形成牙骨质和结缔组织的新附着；GTR技术是在常规牙周翻瓣并进行根面平整治疗后，利用生物膜将根面与骨膜瓣分开，防止上皮和龈结缔组织长入，从而促进牙周膜细胞分化进一步再生牙周组织，但GTR治疗后普遍反映再生牙周组织量不够。因此目前临床再生牙周组织的方法疗效不佳，均不能实现真正的牙周组织再生。
目前应用组织工程与再生医学的技术促进组织再生的研究引起越来越广泛的重视与关注。近年来，Seo等从人牙周膜组织中成功分离出牙周膜干细胞，这类干细胞具有再生牙周组织的能力，体外能够分化为成牙骨质细胞及成骨细胞，在动物体内能够形成牙骨质-牙周膜-牙槽骨复合结构，因此应用具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力的牙周膜干细胞，将可能构建出工程化的牙周组织，从而实现牙周缺损的再生。因此利用干细胞移植进行再生重建成为治疗牙周疾病的新策略。患有牙周炎的患者口腔内若存在尚未拔除的智齿，可利用其分离出自体牙周膜干细胞，可以为治疗相关疾病提供较丰富的干细胞来源。
日本学者Iwata等人通过应用多层牙周膜细胞膜片与PGA膜片复合进行牙周组织再生研究，将复合细胞膜片植入比格犬牙槽骨缺损处，6周后对牙周缺损处检测发现，移植的牙周膜细胞膜片能够促进牙槽骨及牙周膜再生，但是仍需要生物材料作为支架进行牙周组织再生，存在生物材料可能引起机体免疫排斥、材料不能完全降解等问题。
综上，目前尚未建立无生物材料工程化牙周组织用于牙周组织再生的报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于：提供一种用于牙周组织重建与再生的工程化牙周组织的制备方法。
本发明之工程化牙周组织的制备方法，系使用牙周膜干细胞，扩增培养后，形成复层化的细胞聚合体；多个牙周膜干细胞细胞聚合体层叠、塑形后形成工程化牙周组织。
本发明所制备的工程化牙周组织由牙周膜干细胞及其分泌合成的细胞外基质构成，具有制备简便、可塑性强、细胞密度适宜、细胞外基质含量丰富、无需支架材料、体外培养时间短等优点；在体内可形成牙槽骨、牙周膜及牙骨质结构，使得牙周缺损得以恢复。具体步骤包括：
步骤一、牙周膜干细胞细胞培养：将智齿的牙周膜组织剪碎，以0.1～0.5g/L的Ⅰ型胶原酶和0.1～0.4 g/L 的Dispase酶消化0.5～2小时至组织松散，过筛后得到单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入牙周膜干细胞培养液重悬细胞，置于37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液，细胞培养至90 %汇合即可传代，获得第一代牙周膜干细胞。
所述牙周膜干细胞培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.2～0.4mg/mL谷氨酰胺、75～125ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子。
步骤二、牙周膜干细胞筛选：取步骤一得到的第一代牙周膜干细胞，调整细胞密度为50～200个/mL，在37℃、5％CO2条件下培养12小时，隔日换液，待细胞扩增至70～80 %汇合后即可传代，得到筛选后的牙周膜干细胞。
步骤三、牙周膜干细胞聚合体制备：将筛选后的牙周膜干细胞调整细胞密度为1×105～5×106个/mL后接种，加入牙周膜干细胞聚合体培养液，每2～3天换液，37℃、5％CO2条件下培养，连续培养1～3周，可在培养皿底部出现乳白色膜样物质，形成牙周膜干细胞聚合体。
所述牙周膜干细胞聚合体培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.2～0.4mg/mL谷氨酰胺、75～125ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、5～10ng/mL的转化生长因子-β1、1×10-8～1×10-5M的8-异戊烯基柑橘素、1×10-5～5×10-4M蛇床子素、1×10-6～5×10-5M脱水淫羊藿素、1×10-5～8×10-4M甘草查尔酮A、50～100μg/mL维生素C、1×10-4～5×10-3M阿司匹林和1×10-7～5×10-5M白藜芦醇。
本步骤采用牙周膜干细胞聚合体培养液培养牙周膜干细胞，使牙周膜干细胞改变了常规条件下细胞的接触抑制及密度抑制的性质。在牙周膜干细胞聚合体培养液中，维生素C通过抗氧化加速细胞增殖、促进细胞外基质的合成分泌，阿司匹林维持细胞端粒酶活性，转化生长因子-β1维持细胞快速增殖过程中干细胞干性、白藜芦醇激活细胞Sirt信号抑制细胞衰老，蛇床子素、8-异戊烯基柑橘素、脱水淫羊藿素、甘草查尔酮等中药单体化合物通过激活Smad、p38、MAPK 以及Wnt信号通路促进牙髓细胞增殖大量合成、分泌细胞外基质，促进胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等分泌及致密排列，形成复层化结构，并在体外形成含细胞外基质的牙周膜干细胞聚合体，从结构及成分上与天然牙周组织接近。
步骤四、工程化牙周组织的制备：将1～5个牙周膜干细胞聚合体重叠后卷成条索状，再使用生物胶固定，然后加入诱导培养液继续培养1～3天，即获得工程化牙周组织。
所述诱导培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.292mg/mL谷氨酰胺、75～125ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、5～10ng/mL转化生长因子-β1、1×10-8～1×10-5M的8-异戊烯基柑橘素、1×10-6～5×10-4M甘草查尔酮A、1×10-4～5×10-3M阿司匹林、10～20mM β-磷酸甘油钠、5～20nM地塞米松和50～100μg/mL维生素C。
本步骤将多个牙周膜干细胞聚合体进行层叠放置，通过诱导培养，使其分化后具有成骨的能力，植入体内后可形成牙槽骨、牙周膜及牙骨质，从而修复牙周缺损。而采用的诱导培养液中，转化生长因子β1能够维持细胞状态及再造体外细胞生长微环境维持干细胞稳定；8-异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和阿司匹林能分别激活干细胞Smads、BMPs、Wnt信号通路，促进细胞骨向分化；β-磷酸甘油钠、地塞米松和维生素C能够促进细胞骨向分化和钙磷盐的沉积促进生物矿化。
本发明所制备的工程化牙周组织，其优点体现在：
（1）本发明之牙周组织，具有和天然牙周组织相似的成分与结构，因此工程化牙周组织植入体内后能够发挥牙周组织的正常功能，可分化出牙周膜细胞及成骨细胞，促进牙周组织再生，最终修复牙周缺损。
（2）本发明之牙周组织制备方法，使用牙周膜干细胞聚合体的培养技术，使得牙周膜干细胞在体外突破常规培养的限制，形成复层化结构，并大量分泌细胞外基质，作为自体分泌天然支架组装、构建起三维组织结构，保证了植入体内后的信号传导和生长因子的作用微环境。使得制备的工程化牙周组织从结构及成分上与天然牙周组织接近，避免了传统支架材料与局部微环境相容性不佳的缺点。
（3）本发明之牙周组织制备方法，具有制备简便、可塑性强、细胞密度适宜、细胞外基质丰富、无需人工合成材料，避免细胞接种材料时引起的细胞损失等优点。
附图说明
图1是采用本发明方法制备牙周膜干细胞聚合体的流程图片
图1-A是牙周膜干细胞体外培养的显微照片（低倍），图1-B是牙周膜干细胞体外培养的显微照片（高倍），图1-C是牙周膜干细胞体外培养后形成膜片的显微照片，图1-D是牙周膜干细胞形成膜片的外观照片，图1-E、F是牙周膜干细胞膜片聚合后形成细胞聚合体的照片。
图2是本发明制备的工程化牙周组织的外观照片
可见：工程化牙周组织能够方便临床应用。
图3是本发明的工程化牙周组织的HE染色与电镜照片
图3-A是工程化牙周组织的HE染色，可见工程化牙周组织由牙周膜干细胞构成，细胞外基质含量丰富，图3-B是工程化牙周组织的电镜照片，可见工程化牙周组织含大量细胞外基质。
图3-A、图3-B说明：本发明制备的工程化牙周组织由牙周膜干细胞构成，具有天然牙周组织的结构及成分。
图4是本发明制备的工程化牙周组织移植于裸鼠皮下的组织学结果
图4-A是将工程化牙周组织与脱矿骨复合植入裸鼠皮下组织的HE染色，图4-B是4-A的局部放大图；其中CBB为脱矿骨；PDL为再生牙周膜组织；黑色箭头所指为牙骨质结构，显示植入的工程化牙周组织能够在体内再生出牙周纤维的同时还能再生牙骨质结构，与脱矿骨形成良好的结合。
具体实施方式
现结合实验的实施例，对本发明作进一步说明。
以下各实施例，制备时，均先将牙周膜干细胞经扩增培养，形成复层化的牙周膜干细胞聚合体，再将多个牙周膜干细胞聚合体进行层叠放置并塑形，形成工程化牙周组织。
实施例１、工程化牙周组织的制备方法之一
其制备步骤如下：
步骤一、牙周膜干细胞培养：将小型猪乳牙的牙周膜组织剥离并剪碎，以0.2g/L的Ⅰ型胶原酶和0.1g/L的Dispase酶消化1小时至组织松散，用吸管吹打使牙周膜组织充分分散。以筛网过筛形成单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入牙周膜干细胞培养液重新悬置细胞，转入细胞培养瓶，37℃、5%CO2孵箱中培养，隔日换液，细胞培养至90 %汇合即可传代，获得第一代牙周膜干细胞。
所述牙周膜干细胞培养液A的组成为：在商用α-MEM培养液中含有10%（v/v）胎牛血清、0.2mg/mL谷氨酰胺、75ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子。
步骤二、牙周膜干细胞筛选：将第一代的牙周膜干细胞消化后，使用培养液将细胞吹悬，细胞密度调整至50～60个/mL，加入培养器皿中，经过37℃、5％CO2培养箱中培养12小时后，隔日换液，待细胞扩增至70～75 %汇合后即可传代，得到筛选后的牙周膜干细胞。
步骤三、牙周膜干细胞聚合体制备：将筛选后的生长状态良好的牙周膜干细胞以1×106个/mL接种于培养皿，并加入牙周膜干细胞聚合体培养液，每2天换液，37℃、5％CO2培养箱中培养，连续培养3周，可在培养皿底部出现乳白色膜样物质，形成牙周膜干细胞聚合体。
所述牙髓细胞聚合体培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.3mg/mL谷氨酰胺、75ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10ng/mL的转化生长因子-β1、5ng/mL 1×10-5 M蛇床子素、5×10-7M的8-异戊烯基柑橘素、1×10-6M脱水淫羊藿素、5×10-4M甘草查尔酮A、50μg/mL维生素C、1×10-3M阿司匹林和1×10-5M白藜芦醇。
步骤四、工程化牙周组织的制备：弃去牙周膜干细胞聚合体培养液，将牙周膜干细胞聚合体沿培养皿边缘分离，使用器械将3个牙周膜干细胞聚合体重叠后卷成条索状，再使用纤维蛋白胶包裹固定，然后加入诱导培养液继续培养3天，即获得工程化牙周组织。
所述诱导培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.292 mg/mL谷氨酰胺、75ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10ng/mL转化生长因子-β1、1×10-5M的8-异戊烯基柑橘素、5×10-4M甘草查尔酮A、5×10-3M阿司匹林、10mM的β-磷酸甘油钠、10nM地塞米松、50μg/mL维生素C。
本实例制备的工程化牙周组织如图1所示，图1-A是牙周膜干细胞体外培养的显微照片（低倍），图1-B是牙周膜干细胞体外培养的显微照片（高倍），图1-C是牙周膜干细胞体外培养后形成膜片的显微照片，图1-D是牙周膜干细胞形成膜片的大体照片，图1-E、F是牙周膜干细胞膜片聚合后形成细胞聚合体的照片。
实施例２、工程化牙周组织的制备方法之二
步骤一、牙周膜干细胞培养：将小型猪恒牙的牙周膜组织剥离并剪碎，以0.5g/L的Ⅰ型胶原酶和0.3g/L 的Dispase酶消化0.5小时至组织松散，用吸管吹打使牙周膜组织充分分散。以筛网过筛形成单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入专用培养液重新悬置细胞,转入细胞培养瓶，37℃、5 %CO2孵箱中培养，隔日换液，细胞培养至90 %汇合即可传代，获得牙周膜干细胞。
所述牙周膜干细胞培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有10% （v/v）胎牛血清、0.3mg/mL谷氨酰胺、90ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子。
步骤二、牙周膜干细胞筛选：将第一代的牙周膜干细胞消化后，使用培养液将细胞吹悬，细胞密度调整至100～150个/mL，加入培养器皿中，经过37℃、5％CO2培养箱中培养12小时后，检查细胞贴壁情况，标记单细胞贴壁孔，隔日换液，待细胞扩增至70～80%汇合后即可传代，常规胰酶消化、扩大培养。
步骤三、牙髓细胞聚合体制备：将筛选后的生长状态良好的牙周膜干细胞以2×106个/mL接种于培养皿，并加入专用培养液，每2天换液，37℃、5％CO2培养箱中培养，连续培养2周，可在培养皿底部出现乳白色膜样物质，形成牙髓细胞聚合体。
所述牙髓细胞聚合体培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%胎牛血清、0.2mg/mL谷氨酰胺、100ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、7.5ng/mL转化生长因子-β1、5×10-4M蛇床子素、1×10-6M的8-异戊烯基柑橘素、5×10-6 M脱水淫羊藿素、5×10-5M甘草查尔酮A、100μg/mL维生素C、5×10-4M阿司匹林和1×10-6M白藜芦醇。
步骤四、工程化牙周组织的制备：弃去专用培养液，将牙髓细胞聚合体沿培养皿边缘分离，使用器械将5个牙周膜干细胞聚合体重叠后卷成条索状，再使用胶原蛋白胶包裹固定，然后加入诱导培养液继续培养3天，即获得工程化牙周组织。
所述诱导培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.292mg/mL谷氨酰胺、125ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、6ng/mL转化生长因子-β1、1×10-8M的 8-异戊烯基柑橘素、1×10-5M甘草查尔酮A、2×10-3M阿司匹林、20 mM的β-磷酸甘油钠、15nM地塞米松、100μg/mL维生素C。
本实例制备的细胞聚合体具有一定形态及弹性，制备的工程化牙周组织如图2，3所示，该工程化牙周组织外基质丰富，可塑性强，临床应用方便快捷。
实施例３、工程化牙周组织的制备方法之三
步骤一、牙周膜干细胞培养：将小型猪乳牙的牙周膜组织剪碎，以0.1 g/L的Ⅰ型胶原酶和0.4 g/L 的Dispase酶消化1.5小时至组织松散，过筛后得到单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入牙髓细胞培养液重悬细胞，置于37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液，细胞培养至90 %汇合即可传代，获得第一代牙周膜干细胞。
所述牙周膜干细胞培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.4mg/mL谷氨酰胺、125ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子。
步骤二、牙周膜干细胞筛选：取步骤一得到的第一代牙髓细胞，调整细胞密度为150～200个/mL，在37℃、5％CO2条件下培养12小时，隔日换液，待细胞扩增至70～80 %汇合后即可传代，得到筛选后的牙周膜干细胞。
步骤三、牙周膜干细胞聚合体制备：将筛选后的牙周膜干细胞调整细胞密度为1×105个/mL后接种，加入牙周膜干细胞聚合体培养液，每3天换液，37℃、5％CO2条件下培养，连续培养3周，可在培养皿底部出现乳白色膜样物质，形成牙周膜干细胞聚合体。
所述牙周膜干细胞聚合体培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.4mg/mL谷氨酰胺、80ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、8ng/mL转化生长因子-β1、5×10-5M蛇床子素、8×10-7M的8-异戊烯基柑橘素、1×10-5M脱水淫羊藿素、1×10-4M甘草查尔酮、75μg/mL维生素C、5×10-3M阿司匹林和5×10-5M白藜芦醇。
步骤四、工程化牙周组织的制备：将2个牙周膜细胞聚合体重叠后卷成条索状，再使用生物胶固定，然后加入诱导培养液继续培养1天，即获得工程化牙周组织。
所述诱导培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.292mg/mL谷氨酰胺、100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5ng/mL转化生长因子-β1、5×10-8M的8-异戊烯基柑橘素、5×10-6M甘草查尔酮A、3×10-3M阿司匹林、15mM的β-磷酸甘油钠、5nM地塞米松和75μg/mL维生素C。
将本实例制备的工程化牙周组织复合脱矿骨移植入裸鼠皮下，组织学检测结果如图4所示，在植入三个月后，植入组织形成具有规则排列的纤维结构，同时在脱矿骨表面贴附着一层新形成的牙骨质层，说明说明制备的工程化牙周组织从结构及成分上接近天然牙周组织。
实施例４、工程化牙周组织的制备方法之四
步骤一、牙周膜干细胞培养：将乳牙或恒牙的牙周膜组织剪碎，以0.4g/L的Ⅰ型胶原酶和0.2g/L 的Dispase酶消化2小时至组织松散，过筛后得到单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入牙髓细胞培养液重悬细胞，置于37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液，细胞培养至90%汇合即可传代，获得第一代牙周膜干细胞。
所述牙周膜干细胞培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.25mg/mL谷氨酰胺、90ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子。
步骤二、牙周膜干细胞细胞筛选：取步骤一得到的第一代牙周膜干细胞，调整细胞密度为150～180个/mL，在37℃、5％CO2条件下培养12小时，隔日换液，待细胞扩增至70～80 %汇合后即可传代，得到筛选后的牙周膜干细胞。
步骤三、牙周膜干细胞聚合体制备：将筛选后的牙周膜干细胞调整细胞密度为5×105个/mL后接种，加入牙周膜干细胞聚合体培养液，每2天换液，37℃、5％CO2条件下培养，连续培养2周，可在培养皿底部出现乳白色膜样物质，形成牙周膜干细胞聚合体。
所述牙周膜干细胞聚合体培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.25mg/mL谷氨酰胺、90ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、5ng/mL的转化生长因子-β1、1×10-4M蛇床子素、5×10-6M的8-异戊烯基柑橘素、5×10-5M脱水淫羊藿素、8×10-4M甘草查尔酮A、80μg/mL维生素C、9×10-4M阿司匹林和1×10-7M白藜芦醇。
步骤四、工程化牙周组织的制备：将1个牙周膜干细胞聚合体重叠后卷成条索状，再使用生物胶固定，然后加入诱导培养液继续培养3天，即获得工程化牙周组织。
所述诱导培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.292 mg/mL谷氨酰胺、95ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、8ng/mL转化生长因子-β1、2×10-7M的8-异戊烯基柑橘素、1×10-6M甘草查尔酮A、1×10-3M阿司匹林、12mM的β-磷酸甘油钠、20nM地塞米松和90μg/mL维生素C。
将本实例制备的工程化牙周组织进行组织学观察，可见根面贴附着一层新形成的牙骨质层，其表面的成牙骨质细胞，以及周围的牙周膜及牙槽骨。说明制备的工程化牙周组织从结构及成分上接近天然牙周组织。
实施例５、工程化牙周组织的制备方法之五
步骤一、牙周膜干细胞培养：将乳牙或恒牙的牙周组织剪碎，以0.3g/L的Ⅰ型胶原酶和0.15g/L的Dispase酶消化1小时至组织松散，过筛后得到单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入牙周膜干细胞胞培养液重悬细胞，置于37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液，细胞培养至90%汇合即可传代，获得第一代牙周膜干细胞。
所述牙周膜干细胞培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.35mg/mL谷氨酰胺、80ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
步骤二、牙周膜干细胞筛选：取步骤一得到的第一代牙周膜干细胞，调整细胞密度为90～100个/mL，在37℃、5％CO2条件下培养12小时，隔日换液，待细胞扩增至70～80 %汇合后即可传代，得到筛选后的牙周膜干细胞。
步骤三、牙周膜干细胞聚合体制备：将筛选后的牙周膜干细胞调整细胞密度为5×106个/mL后接种，加入牙周膜干细胞聚合体培养液，每2天换液，37℃、5％CO2条件下培养，连续培养1周，可在培养皿底部出现乳白色膜样物质，形成牙周膜干细胞聚合体。
所述牙周膜干细胞聚合体培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.35mg/mL谷氨酰胺、115ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、6ng/mL的转化生长因子-β1、2×10-5M蛇床子素、1×10-7M的8-异戊烯基柑橘素、2×10-6M脱水淫羊藿素、1×10-5M甘草查尔酮A、60μg/mL维生素C、1×10-4M阿司匹林和5×10-6M白藜芦醇。
步骤四、工程化牙周组织的制备：将4个牙周膜干细胞聚合体重叠后卷成条索状，再使用生物胶固定，然后加入诱导培养液继续培养2天，即获得工程化牙周组织。
所述诱导培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.292mg/mL谷氨酰胺、110ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、9ng/mL转化生长因子-β1、5×10-6M的8-异戊烯基柑橘素、2×10-4M甘草查尔酮A、4×10-3M阿司匹林、18mM的β-磷酸甘油钠、8nM地塞米松和65μg/mL维生素C。
将本实例制备的工程化牙周组织进行组织学观察，可见根面贴附着一层新形成的牙骨质层，其表面的成牙骨质细胞，以及周围的牙周膜及牙槽骨。说明制备的工程化牙周组织从结构及成分上接近天然牙周组织。
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