重组伊斯法罕病毒载体的制作方法

本申请要求2014年3月1日提交的美国临时专利申请第61/946,734号的优先权，其通过引用整体地并入本文。关于联邦政府资助研究的声明本发明是在国立卫生研究院/国立变态反应与感染性疾病研究院给予的政府支持N01-AI-30027、HHSN272201000040I和HHSN2720004/D04下完成的。政府享有本发明的一定权利。关于序列表37CFR1.821-1.825要求的序列表以电子方式与本申请一起提交。序列表通过引用并入本文。
背景技术：
：重组水疱性口炎病毒(rVSV)已发展为一些人类病原体的载体平台(Finke和Conzelmann.CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology.2005,292:165-200；Jones等人.NatureMedicine.2005,11(7):786-90；Kahn等人.JournalofVirology.2001,75(22):11079-87；Kapadia等人.Virology.2005,340(2):174-82；Reuter等人.JournalofVirology.2002,76(17):8900-9；Roberts等人.JournalofVirology.1999,73(5):3723-32；Roberts等人.JVirol.1998,72(6):4704-11；Rose等人.Cell.2001,106(5):539-49)，表达HIV-1gag蛋白的优化rVSV载体已完成临床评价(HVTN090：通过万维网网址clinicaltrials.gov/可获得)。尽管有这些进展，在rVSV载体平台的发展中依然存在挑战，包括对载体蛋白质产生的潜在免疫，其可能干扰后续的用rVSV载体的加强免疫接种。当在异源初免-加强免疫接种方案中使用rVSV载体和其他免疫学上不同的载体时，该潜在问题可以被克服(Amara等人.Science.2001,292(5514):69-74；Amara等人.JVirol.2002,76(15):7625-31；Egan等人.AIDSResearchandHumanRetroviruses.2005,21(7):629-43；Hanke等人.JVirol.1999,73(9):7524-32；Ramsburg等人.JournalofVirology.2004,78(8):3930-40；Santra等人.JVirol.2007；Xu等人.JournalofVirology.2009,83(19):9813-23)。通过与不同水疱性病毒血清型交换表面G蛋白实现的rVSV载体的血清型转换也加强小鼠的初免-加强方案的免疫原性(Rose等人.JournalofVirology.2000,74(23):10903-10)。然而，针对rVSV核心蛋白的细胞免疫应答的交叉反应性可能限制该方法。鉴于这些观点和潜在的局限性，对单独使用或与rVSV载体联合使用的另外的异源载体存在需求。技术实现要素：本发明的实施方案包括与水疱性病毒有关的免疫原性组合物和方法及其作为治疗剂和/或预防剂的用途，水疱性病毒例如是单独的或与水疱性口炎病毒(VSV)组合的伊斯法罕病毒(ISFV)。一些方面包括包含编码一种或更多种异源多肽的重组水疱性病毒的方法和免疫原性组合物。“重组病毒”指与野生型病毒相同或由于在野生型病毒基因组中一个或更多个核苷酸的重排、缺失、插入或取代而与野生型病毒不同的任何病毒基因组或病毒粒子。特别地，该术语包括由人的干预产生的重组病毒。在一些方面，水疱性病毒是重组伊斯法罕病毒(rISFV)。在一些方面，rISFV是有复制能力的病毒。如用于重组病毒的，“有复制能力的”是指病毒能够细胞感染；复制病毒基因组；及生产和释放新病毒粒子；尽管这些特征中的一个或更多个不需要以与其在野生型病毒感染的相同细胞型中发生的相同速率发生，而可能以更快或更慢的速率发生。在另一方面，rISFV包含以下中的中的一个或更多个：(i)具有与SEQIDNO:2的氨基酸序列90％、95％、98％或100％一致的氨基酸序列的N蛋白，(ii)具有与SEQIDNO:3的氨基酸序列90％、95％、98％或100％一致的氨基酸序列的P蛋白，(iii)具有与SEQIDNO:4的氨基酸序列90％、95％、98％或100％一致的氨基酸序列的M蛋白，(iv)具有与SEQIDNO:5的氨基酸序列90％、95％、98％或100％一致的氨基酸序列的G蛋白，或(v)具有与SEQIDNO:6的氨基酸序列90％、95％、98％或100％一致的氨基酸序列的L蛋白。一些实施方案是涉及包含N蛋白基因、P蛋白基因、M蛋白基因、G蛋白基因和L蛋白基因中的4个或5个的rISFV。在一些方面，rISFV还包含编码异源多肽的异源多核苷酸序列。在一些实施方案中，rISFV还包含异源转录单元(TU)。转录单元指(a)两侧是转录起始信号和转录终止信号(含有多腺苷酸化序列)和(b)编码一个或更多个目标异源多肽的异源多核苷酸序列。在一些实施方案中，异源TU是病毒基因组中的第1个TU、第2个TU、第3个TU、第4个TU、第5个TU或第6个TU。在一些方面，异源TU编码两个或更多个异源多肽。在其他方面，2个异源TU被包含于病毒基因组中，其中1个异源TU插入到病毒基因组中的一个位置，第二异源TU插入到病毒基因组中的不同位置。表达异源多核苷酸序列的另一个机制是通过2A肽将异源序列连接到ISF基因。术语“2A”、“2A肽”或“2A样肽”指已成功用于从单个开放阅读框生成多种蛋白质的肽。这些肽是小的(18至22个氨基酸)且具有趋异的氨基末端序列，但在C端都含有PGP模体。通过核糖体跳读机制，2A肽阻止在肽的C端的甘氨酸和脯氨酸残基之间的正常肽键形成。这些2A序列和2A样序列是本领域已知的，且可以容易地被选择用于这种用途。参见，例如，尤其是Szymczak-Workman等人，在ColdSpringHarborProtocols2012中，doi号10.1101/pdb.ip067876；以及Friedmann和Rossi(编著)，GeneTransfer:DeliveryandExpressionofDNAandRNA,CSHLPress,冷泉港，美国纽约州,2007。一个这种2A肽是肽T2A，其是从明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)β四体病毒分离的且具有序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQIDNO:68)。在另一方面，内部核糖体进入位点(IRES)可以被包含于编码至少两种多肽的基因中，以实现下游编码区的不依赖帽的转录。多种IRES序列是已知的且可以选自在万维网iresite.org上可获得的IRESite数据库。在一些方面，rISFVG基因编码具有羧基末端截短、特别是20至25个氨基酸截短的G蛋白。在一些方面，rISFV基因组包含3’到5’的ISFV前导序列、ISFVP蛋白开放阅读框(ORF)、ISFVM蛋白ORF、ISFVG蛋白ORF、ISFVN蛋白ORF、ISFVL蛋白ORF、和ISFV尾随序列，连同在rISFV基因组中任意位置的异源多核苷酸序列或异源TU。在一些方面，异源TU位于rISFV基因组的位置5。在一些方面，异源多核苷酸编码免疫原性多肽。在其他方面，异源多核苷酸编码一种或更多种抗原。抗原可以是病毒抗原、细菌抗原、肿瘤特异性抗原或癌症抗原、寄生虫抗原或变应原。一些实施方案涉及具有相对于反义RNA的3’到5’的以下基因顺序的rISFV：N-P-M-G-L-(H)、N-P-M-G-(H)-L、N-P-M-(H)-G-L、N-P-(H)-M-G-L、N-(H)-P-M-G-L、(H)-N-P-M-G-L、P-N-M-G-L-(H)、P-N-M-G-(H)-L、P-N-M-(H)-G-L、P-N-(H)-M-G-L、P-(H)-N-M-G-L、(H)-P-N-M-G-L、P-M-N-G-L-(H)、P-M-N-G-(H)-L、P-M-N-(H)-G-L、P-M-(H)-N-G-L、P-(H)-M-N-G-L、(H)-P-M-N-G-L、P-M-G-N-L-(H)、P-M-G-N-(H)-L、P-M-G-(H)-N-L、P-M-(H)-G-N-L、P-(H)-M-G-N-L、(H)-P-M-G-N-L、P-M-G-L-N-(H)、P-M-G-(H)-L-N、P-M-G-L(H)-N、P-M-(H)-G-L-N、P-(H)-M-G-L-N或(H)-P-M-G-L-N，其中(H)是包含至少一种异源多核苷酸的TU。在一些方面，rISFV具有P-M-G-N-(H)-L基因顺序。在一些方面，rISFV基因组是在表达载体中编码的。在另一实施方案中，表达载体是DNA载体，例如质粒载体。术语“基因混编”、“混编的基因”、“混编的”、“混编”、“基因重排”和“基因易位”可交换地使用，指在病毒基因组中水疱性病毒基因顺序的改变。一些实施方案涉及编码上述重组反义RNA的表达载体。在一些方面，表达载体是DNA载体。其他实施方案涉及包含上述表达载体的宿主细胞。如本文使用的，术语“表达载体”旨在包括能够合成由载体编码的异源多核苷酸序列的质粒或病毒。在一些方面，载体可以复制和表达所编码的核酸。其他实施方案涉及包含上述重组RNA的病毒粒子。如本文使用的，“病毒粒子”是提供编码要在宿主中表达的一种或更多种多肽的多核苷酸序列的感染性实体。免疫原性组合物可以包括包含本文所述重组核酸的病毒粒子。一些方面涉及在对象中诱导免疫应答的方法，其包括施用本文所述的免疫原性组合物。本发明的方法和组合物可以包括第二治疗病毒。第二病毒可以选自重组或溶瘤腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和弹状病毒。在其他方面，组合物是药学上可接受的组合物。在一些方面，第二治疗病毒是rVSV。在另一方面，rVSV编码在相同靶细胞或有机体之中或之上存在的相同抗原或相关抗原。重组水疱性病毒(例如，本文所述的rISFV)可以施用于需要治疗性免疫应答或预防性免疫应答的对象。重组水疱性病毒组合物可以以一种或更多种重组水疱性病毒施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。施用的组合物可以具有10个、100个、1000个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个或更多个病毒粒子或噬斑形成单位(pfu)。可以通过腹膜内、静脉内、动脉内、瘤内(对于实体瘤)、肌内、皮内、皮下、经口或鼻内途径来施用。在一些方面，组合物是全身施用的，特别是通过血管内施用，其包括注射、灌注等。本发明的方法还可以包括施用第二抗癌治疗剂或抗微生物治疗剂。在一些方面，第二抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、外科手术等。在其他方面，第二抗微生物疗法是抗生素或抗病毒药物。rISFV与rVSV在血清学上和系统发生学上不同。这种不同可以用于优化免疫刺激方案的保护性疗效和免疫原性。rISFV和rVSV载体可以用于初免-加强免疫方案。第一重组水疱性病毒可以以与第二重组水疱性病毒任意数量的组合使用。术语“提供”或“施用”根据其通常含义“供应或供给以使用”来使用。在一些实施方案中，抗原通过直接施用(例如，通过肌内注射)来提供，而在其他实施方案中，抗原通过施用编码抗原的核酸来有效提供。在一些方面，本发明预期包含核酸、抗原、肽和/或表位的各种组合的组合物。在一些方面，病毒粒子、多肽或核酸可以是分离的病毒粒子、多肽或核酸。术语“分离的”可以指基本不含细胞物质、细菌物质、病毒物质、或其来源的培养基(例如，当由重组DNA技术产生时)、或化学前体或其他化学品(例如，当由化学合成时)的病毒粒子、核酸或多肽。此外，分离的化合物指可以作为分离的化合物施用于对象的化合物；换句话说，如果化合物附着于柱或包埋于琼脂糖凝胶中，则不能简单认为其是“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是并非作为片段天然存在的和/或通常不在功能状态中的核酸或蛋白质片段。贯穿本申请全文讨论了本发明的其他实施方案。关于本发明的一个方面讨论的任何实施方案也适用于本发明的其他方面，反之亦然。本文所述的每个实施方案都应理解为适用于本发明所有方面的本发明的实施方案。预期本文讨论的任何实施方案相对于本发明的任何方法或组合物是可以实施的，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可以用于实现本发明的方法。在权利要求和/或说明书中，当与术语“包含”连用时，指示物前不使用冠词可以表示“一个”，但其也与“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。贯穿本申请全文，术语“约”用于表明包括用于确定数值的装置或方法的误差的标准偏差的值。权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确表明仅指替代选择或替代选择是互斥的，虽然公开内容支持仅指替代选择和“和/或”的定义。如在本说明书和权利要求中使用的，术语“包含”(及包含的任何形式)、“具有”(及具有的任何形式)、“包括”(及包括的任何形式)或“含有”(及含有的任何形式)是包含的或开放式的，且不排除其他的、未引用的要素或方法步骤。本发明的其他目的、特点和优点会通过以下详细说明变得明显。然而，应该理解的是，尽管详细说明和具体实施例表明本发明的具体实施方案，但其仅以实例说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改通过该详细说明会对本领域技术人员会变得明显。附图说明以下附图形成本说明书的一部分，且被包括以进一步说明本发明的一些方面。通过参照这些附图中的一个或更多个结合本文提供的说明书实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。图1是基于N基因的核苷酸序列的水疱性病毒属(Vesiculovirus)的最大似然系统发生树。图2描绘了用于生成完整伊斯法罕基因组cDNA克隆的克隆策略中使用的限制性酶切位点。图3A是编码委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)E3-E2-6K-E1多蛋白的rISFV载体[也被称为rISFV-N4-G3-(VEEVZPCE3-E1)5]的图；图3B是描绘VEEV蛋白表达的蛋白质印迹(第3泳道)。图4是不同水疱性病毒的N蛋白的氨基酸序列的比对。氨基酸同源区加阴影。图5是观察到的由表达改性HIV-1gag蛋白的不同rISFV产生的噬斑尺寸的照片。图6描绘了用表达东部马脑炎病毒(EEEV)-菌株FL93E3-E1蛋白的rISFV-N4[也被称为rISFV-N4-G3-(EEEVFL93E3-E1)5]免疫、然后用EEEV-FL93致死性攻击的小鼠的存活率。图7描绘用表达VEEV-菌株ZPCE3-E1蛋白的rISFV-N4[也被称为rISFV-N4-G3-(VEEVZPCE3-E1)5]免疫、然后用VEEV-ZPC致死性攻击的小鼠的存活率。图8描绘用108pfu或107pfu的表达VEEV-ZPCE3-E1蛋白的rISFV-N4[也被称为rISFV-N4-G3-(VEEVZPCE3-E1)5]和108pfu或107pfu的表达VEEV-ZPCE3-E1蛋白的rVSV印第安纳血清型N4CT1(rVSVINN4CT1)[也被称为rVSVIN-N4-G3-(VEEVZPCE3-E1)5]免疫、然后用VEEV-ZPC致死性攻击的小鼠的存活率。图9描绘用表达EEEV-FL93E3-E1蛋白的rISFV-N4和表达VEEV-ZPCE3-E1蛋白的rISFV-N4[也共同地被称为rISFV-N4G3-(VEEVZPCE3-E1)5/rISFV-N4-G3-(EEEVFL93E3-E1)5]免疫、然后用EEEV-FL93致死性攻击的小鼠的存活率。图10描绘用表达EEEV-FL93E3-E1蛋白的rISFV-N4和表达VEEV-ZPCE3-E1蛋白的rISFV-N4[也共同地被称为rISFV-N4G3-(VEEVZPCE3-E1)5/rISFV-N4-G3-(EEEVFL93E3-E1)5]免疫、然后用VEEV-ZPC致死性攻击的小鼠的存活率。图11示出在N蛋白序列中可以改变而对生物功能没有负面影响的四种氨基酸。在BALB/c小鼠中的已知表位画有下划线。图12示出在PBS-Mu-062a研究中试验的重组病毒。图13是PBS-Mu-062a研究设计的概览。图14示出在PBS-Mu-062a研究中对HIV-1gag表位的γ干扰素(IFN-γ)ELISpot应答。图15示出在PBS-Mu-062b初免/加强研究中试验的rISFV。图16是PBS-Mu-062b研究设计的概览。图17示出在PBS-Mu-062b研究中对HIV-1Gag单显表位的IFN-γELISpot应答。图18示出在PBS-Mu-062b研究中对VSV-N的IFN-γELISpot应答。图19描绘用CHIKV的LaReunion分离株攻击后，用rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1免疫的小鼠与未免疫的小鼠相比较的体重。图20描绘用CHIKV的LaReunion分离株攻击后，用rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1免疫的小鼠与未免疫的小鼠相比较的足垫肿胀。图21描绘用CHIKV的LaReunion分离株攻击后，用rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1免疫的小鼠与未免疫的小鼠相比较的病毒血症。图22描绘用rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1免疫、然后用CHIKV的LaReunion分离株致死性攻击的小鼠的存活率。具体实施方式伊斯法罕病毒(ISFV)和水疱性口炎病毒(VSV)是弹状病毒(Rhabdoviridae)科中水疱性病毒(Vesiculovirus)属的成员。原始型的弹状病毒是狂犬病病毒(RV)和VSV。弹状病毒科是具有单链、非分段的反义RNA基因组的子弹形病毒的科。存在超过250种的已知弹状病毒，其感染哺乳动物、鱼、昆虫或植物。该科包括至少5个属：(1)狂犬病病毒属(Lyssavirus)：包括RV、其他哺乳动物病毒和一些昆虫病毒；(2)水疱性病毒属：包括VSV；(3)暂时热病毒属(Ephemerovirus)：包括牛暂时热病毒；(4)细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)：包括莴苣坏死黄化病毒；和(5)细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)：包括马铃薯黄矮病毒。弹状病毒反义病毒RNA(vRNA)基因组的长度为约11至15kb、具有约50个核苷酸的3’前导序列和约60个核苷酸的非转译5’尾随序列。弹状病毒病毒基因组RNA(vRNA)通常含有编码以下5种主要蛋白的5种基因：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)(也被称为聚合酶)。弹状病毒在每个基因的5'端具有保守的多腺苷酸化信号，在5个基因中的每个之间具有短的非转录基因间隔区。通常这些基因是病毒基因组的3’-N-P-M-G-L-5’的顺序。基因的顺序表明在受感染细胞中蛋白表达的水平。弹状病毒基因组产生传染性病毒的任何操作通常会包括编码主要病毒蛋白中的至少4个、通常5个的至少5个转录单元(TU)，以维持以高水平感染和复制的能力。I.重组水疱性病毒水疱性病毒基因组已显示适应多于一种外源基因，所述外源基因跨越至少3千碱基(kb)的另外的核苷酸序列。已充分减毒(例如，通过基因混编和/或病毒蛋白截短)的水疱性病毒载体已证明遗传稳定性，并且病毒基因组未经历可检测的重组。此外，由于病毒复制是细胞质的，因此病毒基因组的RNA病毒不并入宿主细胞基因组。另外，这些负链RNA病毒具有相对简单的、充分表征的转录控制序列，其允许稳健的外源基因表达。外源基因表达的水平可以通过改变外源基因相对于单个病毒3’转录启动子的位置来调节(参见，例如美国专利第6,136,585和8,287,878号等)。基因表达的3’到5’梯度反映了转录病毒RNA依赖型RNA聚合酶随着其沿着基因组模板前进成功穿过在基因接合点处遇到的每个转录终止/起始信号的降低可能性。因此，位于邻近3’末端转录启动子的外源基因被大量表达，而插入到更远端基因组位置的那些外源基因比这要少。在不同细胞类型的大阵列中VSV复制至高滴度，且病毒蛋白被大量表达。这不仅意味着VSV会作为有效的功能性外源基因表达载体，还意味着相关rVSV载体可以扩大到在批准用于生产人用生物制品的细胞系中的生产水平。即使面临大量的病毒复制，该有复制能力的病毒载体在健康人中几乎不产生疾病症状或病理(Tesh,R.B.等人,1969Am.J.Epidemiol.,90:255-61)。此外，人感染VSV由此预先存在对VSV的免疫力是罕见的。因此，rVSV可用作载体。虽然本领域公开了各种rVSV及其“混编”至基因组位置与野生型VSV不同的基因(参见美国专利第8,287,878号；美国专利第6,596,529号，及本文引用的参考文献)，N基因在VSV基因顺序中第4位置(N4)作为突变组合的一部分是有用的，以至于该病毒是充分减毒的。为了进一步使rVSV减毒，可以将G蛋白的胞质尾截短(G-CT)。上述rVSV的各种实施方案使用来源于VSV印第安纳血清型的VSV序列。然而，其他已知的水疱性病毒(例如，伊斯法罕病毒)或VSV血清型可以容易替换为本说明书教导提供的所述实施方案的示例性序列。用于生成本文所述载体的适当启动子可以选自组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子等等。非活性特异性的和在本发明核酸分子的表达中采用的组成型启动子的实例包括但不限于在国际专利申请WO2004/093906号和美国专利第8,287,878号中确定的那些启动子。hCMV启动子用于在反向遗传技术中表达用于rVSV拯救目的的VSV蛋白。可以使用的其他polII启动子包括尤其泛素C(UbiC)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、牛巨细胞病毒(bCMV)启动子、具有上游CMVIV增强子的β-肌动蛋白启动子(CAGGS)、以及延伸因子1α启动子(EF1A)。在一些实施方案中，使用T7RNA聚合酶启动子。本发明的一些实施方案涉及重组水疱性病毒，其包括单独的或例如在初免/加强方案中与重组水疱性口炎病毒(rVSV)组合的重组伊斯法罕病毒(rISFV)，以及编码重组水疱性病毒的载体，和使用这种重组水疱性病毒和载体的方法。重组水疱性病毒可以(1)使用cDNA转染或(2)使cDNA转染到细胞中来产生，所述细胞还用在转染中提供产生重组水疱性病毒所需要的剩余成分或活性物的拟菌病毒来感染。使用任何这些方法(例如，拟菌病毒转染、辅助细胞系转染或cDNA转染)，用于产生包装的RNA的最小成分需要含有顺式作用信号的RNA分子，用于(1)基因组RNA通过N蛋白的衣壳化，和(2)基因组RNA等同物的复制。复制元素或复制子是最少在3’和5’端包含水疱性病毒的前导序列和尾随序列的RNA的链；在反义基因组中，前导在3’端，尾随在5’端。位于这两个复制信号之间的RNA可以被复制。前导区和尾随区含有最小顺式作用因子，为了N蛋白的衣壳化和用于发起转录和复制所需要的聚合酶结合。对于在重组水疱性病毒基因组中含有的任何基因，该基因两侧可以是适当的转录起始信号和转录终止信号，其实现这些基因的表达和经编码的蛋白质产物的产生。特别地，使用异源多核苷酸，其不是由从自然分离的病毒所编码的，或包含不是在病毒中天然发现的位置、形式或环境中的编码区。在一些方面，用作治疗性组合物或免疫原性组合物的重组水疱性病毒可以包括重排病毒的基因顺序。在一些方面，将N基因从3’启动子近端位置，位置1移走。在另一方面，将N基因移至位置2、3、4或5。在一些方面，N基因在基因组中的位置4。在一些实施方案中，重组水疱性病毒包含异源多核苷酸。在一些方面，异源多核苷酸编码抗原。在其他方面，编码选定的异源免疫应答诱导抗原的异源多核苷酸或异源多基因位于基因顺序的位置1、2、3、4、5或6。A.重组水疱性病毒产生反义、单链、非分段的病毒RNA基因组的转录和复制通过作用于核糖核蛋白核心(核衣壳)的多聚蛋白复合物的酶活性来实现。病毒序列在通过N蛋白被包裹到核衣壳结构中时被识别。核衣壳结构的基因组和反基因组末端启动子序列被识别以启动转录或复制途径。因此，如本文所述的基因改性且减毒的重组水疱性病毒是根据本领域已知的以及更具体地如以下实施例描述的拯救方法来产生的。可以使用任何适当的伊斯法罕病毒、VSV菌株或血清型，包括但不限于VSV印第安纳、VSV新泽西、VSV金迪普拉(VSVChandipura)、VSV格拉斯哥等。如上所述，除了编码减毒形式的伊斯法罕病毒或VSV的多核苷酸序列，多核苷酸序列还编码异源多核苷酸序列或对选定的异源蛋白质编码的开放阅读框(ORF)。用于拯救的典型(但不一定是排他性的)情况包括适当的哺乳动物细胞，其中T7聚合酶存在于细胞质中以驱动反基因组(或基因组)单链RNA从含病毒基因组cDNA的转录载体的转录。联合转录或在其不久之后，通过核蛋白将该病毒反基因组(或基因组)RNA转录物包裹到功能模板中，并通过所需聚合酶成分来接合，所述聚合酶成分由表达所需病毒特异性反式作用蛋白的共转染质粒同时产生。这些事件和过程导致病毒mRNA的首要转录、新基因组的复制和扩增，和由此的新水疱性病毒子代的产生，即拯救。转录载体和表达载体通常是设计为在宿主细胞中表达的质粒载体。包含编码衣壳化、转录和复制所必需的反式作用蛋白的至少一种分离的核酸分子的表达载体表达来自一种表达载体或至少两种不同载体的这些蛋白。水疱性病毒基因组的克隆DNA等同物可以位于适当的DNA依赖型RNA聚合酶启动子(例如T7RNA聚合酶启动子)和自切割核糖酶序列(例如丁型肝炎核糖酶)之间，并插入到适当的转录载体(例如细菌质粒)中。该转录载体提供了容易操作的DNA模板，RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)可以由其准确地转录具有5’和3’末端的水疱性病毒cDNA的单链RNA副本。病毒cDNA副本的定向、两侧启动子和核糖酶序列决定反基因组或基因组RNA等同物是否被转录。新水疱性病毒子代的拯救所需的还有以下水疱性病毒特异性反式作用支持蛋白质，其对于将裸露的单链反基因组或基因组RNA转录物包裹到功能核衣壳模板中以及启动病毒转录和复制是必需的：病毒核衣壳(N)蛋白、聚合酶相关的磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白。简单地说，生成重组水疱性病毒的一种方法包括将包含本文所述核酸序列的病毒cDNA表达载体引入到宿主细胞中。在一些方面，表达载体包含位置1(P1)上游的T7启动子、丁型肝炎病毒核糖酶位点(HDVRz)和所选重组水疱性病毒核酸序列最后位置下游的T7终止子序列。在T7RNA聚合酶的存在下，T7启动子指导病毒RNA反基因组转录物从表达载体的合成。在一些实施方案中，该方法还包括用表达T7RNA聚合酶的质粒瞬时转染宿主细胞。在其他实施方案中，方法还涉及用表达水疱性病毒的至少病毒蛋白N、P和L(和任选的M和G)的一种或更多种质粒共转染宿主细胞。在一些实施方案中，这些水疱性病毒蛋白在宿主细胞中使用RNApolII依赖型表达系统来表达。其他实施方案包括例如在质粒DNA(pDNA)转染后热激宿主细胞的步骤，所述宿主细胞含有表达载体、T7聚合酶和重组水疱性病毒的病毒蛋白。可以将转染的宿主细胞或由转染的宿主细胞得到的上清液转移到新鲜扩展细胞的培养基中。然后可以从培养基回收组装的传染性重组水疱性病毒。在其他方面，有复制能力的重组水疱性病毒可以是使用本领域已知技术分离和“拯救的”(Ball，L.A.等人.1999J.Virol.,73:4705-12；Conzelmann,1998,Ann.Rev.Genet.,32:123-162；Roberts和Rose,1998,Virol.,247:1-6)。还参见，例如美国专利第8,287,878号；第6,168,943号和第6,033,886号；国际专利公开WO99/02657，其各自通过引用并入本文。在本领域中产生重组RNA病毒的方法被称为“拯救”或“反向遗传学”法。VSV的示例性拯救法在美国专利第6,033,886号和第6,596,529号以及PCT公开WO2004/113517中描述，各自通过引用并入本文。进行病毒如VSV拯救的另外的技术在美国专利第6,673,572号和美国公开US2006/0153870号中描述，其在此通过引用并入。在水疱性病毒拯救中使用的宿主细胞是允许由载体表达对重组水疱性病毒产生必需的必要成分的那些细胞。这种宿主细胞可以选自真核细胞，例如脊椎动物细胞。通常，宿主细胞来自人细胞，例如人胚胎肾细胞(例如293)。如上文引用的美国专利和公开申请中描述的，Vero细胞以及许多其他类型的细胞也用作宿主细胞。在一些实施方案中，添加促转染试剂以增加细胞摄取DNA。许多这些试剂是本领域已知的(例如磷酸钙、阳离子脂质(LifeTechnologies，盖瑟斯堡，马里兰州)和阳离子脂质(Qiagen，希尔登，德国)。然后，首先通过体外法对所拯救的水疱性病毒的期望表型(噬斑形态、转录和复制减毒)进行试验。还在动物神经毒力模型中对水疱性病毒进行体内试验。例如，建立用于检测神经毒力的小鼠和/或雪貂模型。简单地说，以跨越预期的LD50剂量(50％动物致死的剂量)一系列病毒浓度范围中的每一个对十只小鼠的组进行颅内(IC)注射。例如，当病毒的预期LD50是103pfu至104pfu时，使用含有102pfu、103pfu、104pfu和105pfu病毒的IC接种。病毒制剂通过在PBS中连续稀释纯化的病毒储备物来制备。然后通过颅顶对小鼠注射25μlPBS中的必要剂量。每天监测动物的体重下降、发病和死亡。然后由所试验的浓度范围内小鼠的累积死亡来计算病毒载体的LD50。为了通过检测体液免疫应答来确定免疫原性或抗原性，使用本领域已知的各种免疫测定，包括但不限于，使用诸如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心法”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹，免疫沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血凝反应测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白A测定、以及免疫电泳测定、中和测定等。在一个实施方案中，抗体结合通过检测初级抗体上的标记来测定。在另一个实施方案中，初级抗体通过测定次级抗体或试剂与初级抗体的结合来检测。在另一实施方案中，次级抗体是带标记的。在检测免疫原性的另一个实施方案中，T细胞介导的应答通过标准方法来测定，所述标准方法例如是体外或体内细胞毒性测定、四聚物测定、ELISpot测定或体内迟发型超敏反应测定。术语“分离”水疱性病毒指从细胞碎片等培养和纯化病毒粒子的过程。一个实例是获取生成水疱性病毒的细胞培养物的含病毒的上清液，并使其通过0.1微米至0.2微米孔径的过滤器(例如Millex-GS，Millipore)以去除细胞碎片。或者，病毒粒子可以使用梯度例如蔗糖梯度来纯化。然后重组病毒粒子可以丸粒化并重悬于所需的任何赋形剂或载体中。滴度可以通过标准噬斑分析或者通过使用特异于特定蛋白质的抗体的间接免疫荧光来确定。在一些方面，编码或含有一种或更多种蛋白成分(N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和/或L蛋白)和异源多核苷酸的水疱性病毒已用相对于野生型病毒或病毒蛋白的一种或更多种突变体或变异体来构建，使得病毒具有表达异源多核苷酸的期望性能，同时具有在最初分离的病毒中不存在的特性。本文描述的方法提供用于实现本发明的方法和组合物的方案的各种实例。其提供了通过使用重组DNA或核酸技术生成突变病毒或变异病毒的背景。B.伊斯法罕病毒(ISFV)构建体伊斯法罕病毒(ISFV)是弹状病毒科中水疱性病毒属的成员。1975年在伊朗，ISFV最早从沙蝇中分离(Tesh等人.TheAmericanjournaloftropicalmedicineandhygiene.1977,26(2):299-306)。ISFV似乎在地理学上局限于伊朗和一些邻国，那里存在人感染的血清学证据(Tesh等人,TheAmericanjournaloftropicalmedicineandhygiene.1977,26(2):299-306；Gaidamovich等人,VoprosyVirusologii.1978,(5):556-60)。感染ISFV尚未与人疾病联系起来，不同于原型水疱性病毒、水疱性口炎病毒(VSV)，ISFV似乎不会在家畜中循环和/或导致实验性接种动物中的水疱性损伤(Wilks和House,JHyg(Lond).1986,97(2):359-68)。ISFV在形态学上与VSV相似(Tesh等人.TheAmericanjournaloftropicalmedicineandhygiene.1977；26(2)：299-306)，并具有相似的基因组结构，包括高度保守的复制和转录调节序列(Marriott,ArchVirol.2005,150(4):671-80)。然而，两种病毒在血清学上是不同的(Tesh等人.TheAmericanjournaloftropicalmedicineandhygiene.1977；26(2):299-306)，基于病毒蛋白的氨基酸比对，水疱性病毒的系统发生分析显示大量进化趋异(图1)。伊斯法罕病毒包含约11kb的非分段负链RNA基因组，其编码缩写为N、P、M、G和L的五种主要病毒蛋白。伊斯法罕病毒基因的补体(5’至3’)的核苷酸序列提供在SEQIDNO:1中。反义RNA基因组中的3’至5’基因组顺序编码被称为核衣壳(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、跨膜糖蛋白(G)和聚合酶(L)的蛋白，即3’-N-P-M-G-L-5’。核衣壳参与基因组衣壳化。伊斯法罕病毒N蛋白的实例的氨基酸序列是如SEQIDNO:2提供的。P蛋白是参与RNA合成的磷蛋白。伊斯法罕病毒P蛋白的实例的氨基酸序列是如SEQIDNO:3提供的。M蛋白是基质蛋白。伊斯法罕病毒M蛋白的实例的氨基酸序列是如SEQIDNO:4提供的。G蛋白是糖蛋白。伊斯法罕病毒G蛋白的实例的氨基酸序列是如SEQIDNO:5提供的。L蛋白是参与RNA合成的大聚合酶。伊斯法罕病毒L蛋白的实例的氨基酸序列是如SEQIDNO:6提供的。ISFV与VSV的趋异性可以用于帮助治疗性方案和预防性方案，通过(1)用rISFV作为载体代替rVSV，从而避免VSV载体重复施用的潜在抗载体免疫力；和(2)提供第二水疱性病毒载体，从而与rVSV构建异源初免-加强方案。C.水疱性口炎病毒(VSV)构建体水疱性口炎病毒(VSV)包含约11kb的非分段负链RNA基因组，其编码缩写为N、P、M、G和L的五种主要病毒蛋白。编码VSVG、M、N、P和L蛋白的核苷酸序列是本领域已知的(Rose和Gallione,1981,J.Virol.39,519-28；Gallione等人,1981J.Virol.39:529-35)。许多VSV血清型是已知的，并经过测序的。VSV(印第安纳)的基因组序列在NCBI数据库中以登记号NC001560提供(参见SEQIDNO:7至12)，其自本申请优先权日起并入本文。包括VSV(金迪普拉)序列的VSV的其他序列可在该数据库中获得；例如，参见登记号Ay382603、Af128868、V01208、V01207、V01206、M16608、M14715、M14720和J04350，其全部自本申请优先权日起并入本文。VSV血清型例如新泽西型也可从例如马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland)的保藏单位获得(参见例如登记号VR-1238和VR-1239，其自本申请优先权日起并入本文)。其他已知的VSV序列和血清型是在本领域中描述的，或在本说明书全文引用的文献中提及的，参见例如国际专利申请WO2004/093906号和美国专利第8,287,878号，其自本申请优先权日起并入本文。II.免疫原性组合物一些实施方案涉及重组水疱性病毒组合物和当施用于哺乳动物对象时诱导对抗原的抗原特异性免疫应答的方法。在本发明中有用的免疫原性组合物是有复制能力的减毒的重组伊斯法罕病毒(rISFV)或对其编码的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含本文所述的重组水疱性病毒。一些方面涉及如本文所述的rISFV。在另一方面，rISFV包含编码一种或更多种抗原的异源多核苷酸。A.抗原在一些实施方案中，水疱性病毒(例如单独的、或在初免/加强方案中与rVSV一起的rISFV)编码异源抗原。如本文使用的，术语“抗原”或“靶抗原”指包括能够成为免疫应答靶标的复合抗原(例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞等)的任何物质。抗原可以是例如对其施用或提供本文所述免疫原性组合物的对象的细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答的靶标。术语“抗原”或“靶抗原”包括例如病毒抗原、细菌抗原、肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、寄生虫抗原、变应原等中的全部或部分。抗原能够被抗体或T细胞受体结合。抗原还能够诱导导致B淋巴细胞和/或T淋巴细胞产生的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。引发生物应答的抗原的结构方面，例如三维构象或改性(例如磷酸化)，在本文中被称为“抗原决定因子”或“表位”。抗原决定因子或表位是抗原的由抗体识别的那些部分，或在MHC环境中由T细胞受体识别的那些部分。病毒抗原包括例如来自以下的抗原：弹状病毒(例如，包括狂犬病病毒的狂犬病毒属)、甲病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒和戊肝病毒、HIV、疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹、乳头状瘤病毒、EpsteinBarr病毒、副流感病毒、腺病毒、Coxsakie病毒、小核糖核酸病毒、轮状病毒、痘病毒、鼻病毒、风疹病毒、乳多空病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒；已知病毒抗原的一些非限制性实例包括以下：来源于甲病毒的抗原，例如nsP1-nsP4、衣壳、E3、E2、6K和E1蛋白；HIV-1，例如tat、nef、gp120或gp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev或其部分和/或组合；来源于人疱疹病毒如具有抗原的HSV-2的抗原，例如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD；即刻早期蛋白，例如ICP27、ICP47、ICP4、ICP36和ICP0、VP16、US6、US8、UL7、UL19、UL21、UL25、UL46、UL47、UL48、UL49和UL50，或其部分和/或组合；来源于巨细胞病毒特别是人巨细胞病毒的抗原，例如gB或其衍生物；来源于EB病毒的抗原，例如gp350或其衍生物；来源于水痘带状疱疹病毒的抗原，例如gpL、11、111和IE63；来源于肝炎病毒的抗原，例如乙肝病毒抗原、丙肝病毒抗原或戊肝病毒抗原(例如HCV的包膜蛋白E1或E2、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、P7、或其部分和/或组合)；来源于人乳头状瘤病毒的抗原(例如蛋白L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、或其部分和/或组合)；来源于其他病毒病原体的抗原，其他病毒病原体例如是呼吸道合胞体病毒(例如F蛋白和G蛋白或其衍生物)、黄病毒(例如黄热病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)、或流感病毒(例如HA、NP、NA、或M蛋白、或其部分和/或组合)。肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原或者癌症抗原包括但不限于上皮癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这种抗原通过rISFV的表达既提供了对癌细胞的细胞介导免疫应答的诱导又提供了通过rISFV的直接癌细胞裂解。这些癌症更具体的实例包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌(kidneycancer)、肝癌、外阴癌、甲状腺癌、肝恶性肿瘤和各种类型的头颈癌、肾癌(renalcancer)、恶性黑色素瘤、喉癌、前列腺癌。癌抗原是可以潜在刺激肿瘤特异性免疫应答的抗原。虽然未必被表达，但是这些抗原中的一些由正常细胞编码。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常沉默(即不被表达)的那些抗原，只在分化的特定阶段被表达的那些抗原，和暂时表达的那些抗原，例如胚胎抗原和胎儿抗原。其他癌抗原由突变细胞基因编码，所述突变细胞基因例如是致癌基因(例如活化的ras致癌基因)、抑制基因(例如突变的p53)、由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。其他癌抗原由病毒基因编码，所述病毒基因例如是在RNA和DNA肿瘤病毒上携带的那些病毒基因。肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的一些非限制性实例包括MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素b、大肠相关抗原(CRC)的-0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MACE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-05)，肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUG家族(例如MUC-1)、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏蛋白、α联蛋白、β联蛋白和γ联蛋白、p120ctn、gp100Pme1117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2神经节苷脂和GD2神经节苷脂、病毒产物如人乳头瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、和c-erbB-2。在另一个实施方案中，利用减毒的rISFV自身作为抗癌(溶瘤的)治疗剂，其不包含异源多核苷酸序列。ISFV在体外和体内具有肿瘤细胞杀伤特性。术语“溶瘤的”通常指能够杀伤、溶解或停止癌细胞生长的试剂。关于溶瘤病毒，该术语指在癌细胞中可以复制到一定程度、导致癌细胞生长的死亡、溶解或中止，并且通常对非癌细胞具有最小毒性作用的病毒。rISFV使用本文所述的任何方法来减毒。细菌抗原包括例如来自引起结核病和麻风病的分枝杆菌、肺炎双球菌、需氧革兰氏阴性杆菌、支原体、葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、衣原体或奈瑟氏菌的抗原。其他抗原包括例如来自寄生虫的抗原以及是变应原的抗原，寄生虫例如是疟疾寄生虫、利什曼病寄生虫、锥虫病寄生虫、弓形体病寄生虫、血吸虫病寄生虫、丝虫病寄生虫。在另一个方面，ISFVG基因可以用上述异源多核苷酸序列中的一个或更多个来将其整体取代。在另一个方面，ISFVG基因可以用第二水疱性病毒的异源G基因，即假型的来取代。在一些方面，rISFV可以用来自VSV的G基因来假型化。VSVG基因可以选自以上列出的VSV血清型。根据本发明的变异体，免疫原性组合物包含至少两种靶抗原、或编码至少两种靶抗原的异源核苷酸序列、或编码至少两种靶抗原的至少两种异源核苷酸序列、或其任意组合。在一些实施方案中，异源抗原是甲病毒抗原。多数甲病毒通过蚊媒传播感染陆生脊椎动物并表现出广泛的宿主范围(Strauss等人,1994MicrobiolRev.58(3):491-562)。有时，这些传播波及到人类和家畜而引起疾病。旧世界病毒例如罗斯河病毒、基孔肯雅病毒和SINV的人感染的典型特征是发热、皮疹和多关节炎，而新世界病毒委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、东部马脑炎病毒(EEEV)和西部马脑炎病毒(WEEV)的感染可以导致致命的脑炎(Strauss等人,1994MicrobiolRev.58(3):491-562)。因此，新世界病毒是在冷战期间作为生物武器研发的，近期灵长类动物的气溶胶感染证实了其高度致衰弱性能和/或致死性能(Reed等人,2007TheJournalofInfectiousDiseases196:441-450；Reed等人,2005TheJournalofInfectiousDiseases192:1173-1182；Reed等人,2004TheJournalofInfectiousDiseases189:1013-1017；Smith等人,2009Alphaviruses,1241-1274页.InD.D.Richman,R.J.Whitley,和F.G.Hayden(编著),ClinicalVirology.ASMPress,华盛顿特区)。在高剂量气溶胶感染后EEEV对食蟹猕猴是一律致死的，并导致任意病毒感染中的最高自然人病死率(>50％)之一(Reed等人,2007TheJournalofInfectiousDiseases196:441-450)。人的VEEV感染通常不是致命的，但是该病毒是通过气溶胶最有传染性的病毒之一，并是高度致衰弱的以及抑制免疫力的(Reed等人,2004TheJournalofInfectiousDiseases189:1013-1017；Smith等人,2009Alphaviruses,1241-1274页.InD.D.Richman,R.J.Whitley,和F.G.Hayden(编著),ClinicalVirology.ASMPress,华盛顿特区；Weaver等人,2004.Annu.Rev.Entomol.49:141-174)。此外，VEEV在整个拉丁美洲导致广泛的地方性疾病，其蓄意引入可以导致马脑炎病毒扩增和蚊子传播以感染成千上万的人。这些特性使得脑炎甲病毒分类到NIAIDB类病原体列表。因为没有用于甲病毒疾病的得到许可的抗病毒治疗或免疫原性组合物，美国居民仍然容易受到3种脑炎的生物攻击、也容易受到3种脑炎的自然感染。因为通常仅在感染后约一周、前驱疾病已发展为脑炎后才进行诊断，因此有效抗病毒治疗的开发是特别具有挑战性的。因此，免疫接种是预防致命疾病的最佳方法。为了解决该未满足的需求，rISFV已被改性为表达VEEV和EEEV的E3-E1糖蛋白，用作用于两种甲病毒的单独免疫原性组合物，和/或用于与表达VEEV和EEEVE3-E1糖蛋白的rVSV载体一起的异源初免-加强免疫方案，这种免疫模式对最佳疗效应是必需的。B.重组水疱性病毒的制剂在本发明中有用的免疫原性组合物还包含免疫或药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，例如无菌水或无菌生理盐水，所述免疫原性组合物例如是单独的或在初免/加强方案中与rVSV组合物一起的rISFV。免疫原性组合物也可以与这种稀释剂或载体以传统方式混合。如本文使用的，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与对人或其他脊椎动物宿主施用相容的任何的和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。适当的载体对本领域技术人员是明显的，且会在很大程度上取决于施用途径。因此，在本发明中有用的免疫原性组合物可以包含重组的可复制的ISFV，其包含N蛋白基因、P蛋白基因、M蛋白基因、G蛋白基因和L蛋白基因中的一种或更多种；还包含异源核苷酸序列，其中所述异源核苷酸序列(a)两侧是转录启动信号和转录终止信号，(b)编码异源多肽；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。额外成分可以存在于免疫原性组合物中，包括但不限于防腐剂、表面活性剂、和化学稳定剂、悬浮剂或分散剂。通常，优化稳定剂、佐剂和防腐剂以确定在目标人或动物中的疗效最佳的制剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。可以使用的合适的稳定化成分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、苯酚红、N-Z胺、二磷酸二氢钾、乳糖、乳清蛋白水解物和奶粉。合适的表面活性物质包括但不限于弗氏不完全佐剂、醌类似物、十六胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基二-十八烷铵溴、甲氧基六癸基丙三醇和普朗尼克多元醇；多胺，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、羧乙烯聚合物；多肽，例如胞壁肽和二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽；油乳液；和矿物凝胶，例如磷酸铝等和免疫刺激复合物(ISCOMS)。rISFV和rVSV或任何其多肽成分也可以并入脂质体来用作免疫原性组合物。免疫原性组合物也可以含有适于组合物施用的所选模式的其他添加剂。本发明的组合物也可以包括冻干制剂，其可以与其他药学上可接受的赋形剂一起用于开发粉末剂型、液体剂型或悬浮液剂型。参见例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，第2卷，第19版(1995)，例如第95章气溶胶；国际专利公布号WO99/45966，其教导通过引用并入本文。这些免疫原性组合物可以含有适用于通过任何常规施用途径来施用的添加剂。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物为了以例如液体、粉末、气溶胶、片剂、胶囊、肠包衣片剂或肠包衣胶囊剂、或栓剂的形式施用于人对象而制备。因此，免疫原性组合物也可以包括但不限于，在油性介质或水性载剂中的悬浮液、溶液和乳液、糊剂、和可植入的持续释放的制剂或可生物降解的制剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方案中，活性成分是以干燥(即粉末或颗粒)形式提供的，用于在经重构的组合物的肠胃外施用之前用合适介质(例如无菌无热原的水)的重构。其他有用的可肠胃外施用的制剂包括在脂质体制剂中包含微晶形式的活性成分或作为可生物降解的聚合物体系的组分的活性成分的制剂。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。本文所述的免疫原性组合物不限于常规的、生理上可接受的载体、佐剂、或在上述类型的药物制剂中可用的其他成分的选择。这些药学上可接受的组合物由上述成分的制备在本领域技术范围内，所述组合物具有合适的pH等渗性、稳定性和其他常规特征。对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，如有必要的话该溶液应当是被适当缓冲的，并首先用足量盐水或葡萄糖使液体稀释剂成为等渗的。这些特定水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液，并将其添加至1000ml皮下灌注液体或将其注射在输液部位，(参见例如“Remington'sPharmaceuticalSciences”第15版，1035-1038页和1570-1580页)。取决于进行治疗的对象的状况，必然会发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人会决定个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应满足正在使用组合物所在的国家的政府要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。如本文使用的，“载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、载剂、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药物活性物质的这些介质和试剂的使用在本领域中是众所周知的。除非到任何常规介质或试剂与活性成分不相容的程度，其在治疗组合物中的使用是预期的。补充的活性成分也可以并入组合物。短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”指当施用于人时不产生过敏的或类似的不良反应的分子实体和组合物。包含病毒粒子作为活性成分的含水组合物的制备在本领域中是容易理解的。通常，将这种组合物制为注射剂，制为液体溶液或制为悬浮液；也可以制备在注射前适用于液体中的溶液或悬浮液的固体形式。如上所述，重组水疱性病毒的任何实施方案可以用于这些治疗方法。理想地，该组合物与上述药学上可接受的稀释剂或其他成分混合。在一个实施方案中，由病原体引起的感染的治疗或预防涉及一种或更多种有效量的本文所述重组水疱性病毒的一种或组合的施用。C.重组水疱性病毒的施用本发明的抗原组合物或免疫原性组合物通过各种途径施用于人或其他哺乳动物对象，所述途径包括但不限于肌内、瘤内、腹膜内、皮下、静脉内、动脉内、鼻内、口服、舌下、含服、阴道、直肠、肠胃外、皮内、经皮(参见例如国际专利公布WO98/20734号，其通过引用并入此文)。合适的途径是由主治医师根据所用免疫原性组合物的性质，对患者年龄、体重、性别和总体健康状况的评价，存在于免疫原性组合物的抗原和类似因素来选择的。在以下提供的实例中，免疫原性rISFV组合物和免疫原性rVSV组合物在初免/加强方案中或单独或组合经肌内(i.m.)施用。在其他实施方案中，需要通过不同途径施用rISFV组合物和rVSV组合物。例如，rISFV组合物可通过常规手段来施用，所述常规手段包括肌内施用和经鼻施用。然而，剂量和施用途径的选择不是对本发明的限制。免疫原性组合物施用的顺序和在单次施用之间的时间段可以由主治医师或本领域技术人员基于宿主的身体特征和对应用方法的明确应答来选择。预期这种优化完全在本领域技术范围内。通常，本发明的免疫原性组合物组分的适当“有效量”或剂量的选择也基于施用是只有rISFV还是与rVSV组合物一起的初免/加强，以及对象的身体状况，尤其包括免疫的对象的总体健康状况、年龄和体重。施用的方法和途径及额外成分在免疫原性组合物中的存在也可能影响rISFV和rVSV组合物的剂量和量。这种选择和有效剂量的向上或向下调整在本领域的技术范围内。没有显著不良副作用地在患者中诱导免疫应答例如保护性应答、或产生治疗效果所需的rISFV和rVSV的量根据这些因素而变化。如上所述，将合适的剂量配制在药物组合物中(例如溶于约0.1ml至约2ml生理上相容的载体)并通过任意适当手段来递送。治疗可以包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定量的治疗组合物。待施用的量、具体途径和配制在临床领域的技术范围内。单位剂量不需作为单次注射来施用，但是可以包括在设定时间段内连续输注。本发明的单位剂量可以方便地以噬斑形成单位(pfu)或病毒构建体的病毒粒子的形式来描述。单位剂量是103pfu、104pfu、105pfu、106pfu、107pfu、108pfu、109pfu、1010pfu、1011pfu、1012pfu、1013pfu或传染性病毒粒子(vp)和更高。或者，根据病毒和可达到的滴度，将1vp至100vp、10vp至50vp、100vp至1000vp、或最多约1×104vp、1×105vp、1×106vp、1×107vp、1×108vp、1×109vp、1×1010vp、1×1011vp、1×1012vp、1×1013vp、1×1014vp、或1×1015vp或更高vp递送至患者或患者细胞。将合适的剂量配制在所述的药物组合物中(例如溶于约0.1ml至约2ml生理上相容的载体)，并通过任意适当的手段给药。在一个实施方案中，rISFV的单剂量或加强剂量是相同的。这种剂量一般是1×107pfu/病毒粒子/毫升(或作为病毒粒子测量的)至1×109pfu/病毒粒子/毫升。然而，任何合适剂量是容易由本领域技术人员确定的。在本文所述方法的第二实施方案中，重组水疱性病毒(例如rISFV)的施用通过将有效量的包含第二重组水疱性病毒(例如rVSV)的初免组合物施用于哺乳动物对象来进行，所述第二重组水疱性病毒包含编码与第一病毒编码的那些的相同抗原或异源抗原的一个或更多个开放阅读框。或者，第一病毒的施用之后是第二病毒的施用。在任一方案中，可以施用多于一个剂量的第一病毒和/或第二病毒。根据本发明，例如，在显示为选定的宿主异源抗原的初免rISFV免疫原性组合物的施用之后可以将rVSV免疫原性组合物作为加强组合物施用。在免疫原性rVSV组合物前，将有效量的包含rISFV和药学可接受稀释剂的初免组合物施用于哺乳动物对象，所述rISFV包含在指导其表达的调控序列控制下编码一种或更多种异源蛋白的一个或更多个开放阅读框。当用作初免组合物时，该rISFV组合物在加强rVSV组合物之前被施用一次或多于一次。在初免/加强法的另一个实施方案中，将初免rISFV组合物在免疫原性rVSV组合物之前施用至少一次，或在免疫原性rVSV组合物之前和之后都施用。在初免/加强方案的其他实施方案中，将多个rVSV组合物作为后期加强剂施用。在一个实施方案中，在初免组合物后施用至少两种rVSV组合物。每个后续的水疱性病毒组合物可以具有不同血清型，其选自已知血清型和由水疱性病毒G蛋白的操纵提供的任意合成血清型。例如，一种rVSV可以是印第安纳血清型，而另一种可以是金迪普拉血清型或新泽西血清型。在另一个实施方案中，另外的rVSV加强剂具有相同的血清型。当用作加强组合物时，在初免rISFV免疫原性组合物之后连续施用rVSV组合物。显示减毒和免疫原性的所期望平衡的rISFV和rVSV在本发明中是有用的。在另一个实施方案中，一种或更多种rISFV免疫原性组合物的施用之后是rVSV免疫原性组合物的一次或更多次施用，然后是rISFV免疫原性组合物的一次或更多次另外的施用。在又一个实施方案中，一种或更多种rISFV免疫原性组合物的施用之前或之后是一种或更多种质粒DNA免疫原性组合物的施用，其中质粒DNA编码与rISFV免疫原性组合物相同或不同的异源多肽。III.蛋白质组合物本发明的蛋白质组合物包括病毒粒子和包含病毒粒子的组合物。在一些实施方案中，会将水疱性病毒设计为包含病毒蛋白N、P、M、G和/或L的多肽变体；和/或异源多核苷酸。如本文使用的，“蛋白质”或“多肽”指氨基酸残基的聚合物。在一些实施方案中，使用野生型版本的蛋白质或多肽，而在许多实施方案中，全部或部分的病毒蛋白质或多肽是缺失的或改变的从而使病毒对治疗更有用。“改性蛋白质”或“改性多肽”或“变异蛋白”或“变异多肽”指化学结构或氨基酸序列相对于野生型或参考蛋白质或多肽经改变的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，改性蛋白质或改性多肽具有至少一种改变的活性或功能(认识到蛋白质或多肽可以具有多种活性或功能)。改变的活性或功能可以相对于野生型蛋白质或多肽的该活性或功能、或含有这种多肽的病毒的特性以一些其他方式减少、减退、消除、增强、改善或改变。预期的是改性蛋白质或改性多肽可以在一种活性或功能方面改变，而在其他方面保留野生型或不变的活性或功能。或者，改性蛋白质可以是完全无功能的，或其同源核酸序列可以已改变从而使得多肽完全不再被表达、被截短，或由于框移位或其他改性表达不同氨基酸序列。预期的是多肽可以通过截短而改性，使其比其相应的不变形式更短，或通过融合或结构域混编而改性，这可以使改变的蛋白质更长。本发明多肽的氨基酸序列变体可以是取代变体、插入变体、或缺失变体。与野生型或不变多肽或其他参考多肽相比，编码多肽的基因突变可以影响多肽的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或更多个非连续氨基酸或连续氨基酸(即片段)。由水疱性病毒编码的各种多肽可以参考随本申请提交的序列表或本文提供的基因库登记号和相关公开数据库条目来确认。缺失变体缺少天然的、不变的或野生型的蛋白质的一个或更多个残基。可以删除个别残基，或可以删除结构域的全部或部分(例如催化域或结合域)。可以将水疱性病毒G蛋白的胞质尾截短从而使病毒减毒。例如，rISFVG蛋白可以有20至25个氨基酸的羧基末端截短，而rVSVG蛋白可以有20至28个氨基酸的羧基末端截短。另外的减毒还可以通过远离其在水疱性病毒基因组中的天然第一位置而混编N基因来实现，或通过在氨基酸位置33至51的非细胞病变(ncp)的M基因突变来实现，如美国专利第8,287,878中所述的。可以将终止密码子引入(通过取代或插入)编码核酸序列以生成截短的蛋白质。插入的突变体通常涉及在多肽非末端点的物质的添加，具体类型的插入物是包含相关蛋白的同源或相似部分取代靶蛋白的相关部分的嵌合多肽。这可以包括免疫反应性表位或仅仅一个或更多个残基的插入。也可以生成通常称为融合蛋白的末端添加物。取代的变体通常包括在蛋白质内一个或更多个位点的一个氨基酸交换为另一个，可以设计为在有或没有其他功能或性质损失的情况下调节多肽的一种或更多种性质。取代可以是保守的，也就是说一个氨基酸替换为一个类似形状和电荷的氨基酸。保守取代是本领域众所周知的，包括例如：丙氨酸改变为丝氨酸；精氨酸改变为赖氨酸；天冬酰胺改变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸改变为谷氨酸；半胱氨酸改变为丝氨酸；谷氨酰胺改变为天冬酰胺；谷氨酸改变为天冬氨酸；甘氨酸改变为脯氨酸；组氨酸改变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸改变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸改变为缬氨酸和异亮氨酸；赖氨酸改变为精氨酸；甲硫氨酸改变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸改变为酪氨酸、亮氨酸改变为甲硫氨酸；丝氨酸改变为苏氨酸；苏氨酸改变为丝氨酸；色氨酸改变为酪氨酸；酪氨酸改变为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸改变为异亮氨酸或亮氨酸。或者，取代可以是非保守的以影响多肽的功能或活性。非保守改变通常涉及用化学上不相似的残基取代残基，例如极性氨基酸或带电氨基酸改变为非极性氨基酸或不带电氨基酸，反之亦然。术语“功能上等效的密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的6个密码子，也指编码生物学上等效的氨基酸的密码子。氨基酸密码子包括：丙氨酸(Ala，A)GCA、GCC、GCG或GCU；半胱氨酸(Cys，C)，UGC或UGU；天冬氨酸(Asp，D)GAC或GAU；谷氨酸(Glu，E)GAA或GAG；苯丙氨酸(Phe，F)UUC或UUU；甘氨酸(Gly，G)GGA、GGC、GGG或GGU；组氨酸(His，H)CAC或CAU；异亮氨酸(Tle，I)AUA、AUC或AUU；赖氨酸(Lys，K)AAA或AAG；亮氨酸(Leu，L)UUA、UUG、CUA、CUC、CUG或CUU；甲硫氨酸(Met，M)AUG；天冬酰胺(As，N)AAC或AAU；脯氨酸(Pro，P)CCA、CCC、CCG或CCU；谷氨酰胺(Gln，Q)CAA或CAG；精氨酸(Arg，R)AGA、AGG、CGA、CGC、CGG或CGU；丝氨酸(Ser，S)AGC、AGU、UCA、UCC、UCG或UCU；苏氨酸(Thr，T)ACA、ACC、ACG或ACU；缬氨酸(Val，V)GUA、GUC、GUG或GUU；色氨酸(trp，W)UGG；和酪氨酸(Tyr，Y)UAC或UAU。还会理解的是，氨基酸和核酸序列可以包含额外的残基，例如额外的N-末端氨基酸或C-末端氨基酸，或5’序列或3’序列，但仍基本上如本文所述，包括具有一定生物活性。末端序列的添加特别适用于例如可以包括在编码区5’或3’部分两侧的各种非编码序列的核酸序列，或可以包括已知在基因中存在的各种内部序列即内含子的核酸序列。以下是基于本文所述蛋白质氨基酸的改变以产生等同的、或甚至改善的分子的讨论。例如，在蛋白质结构中一些氨基酸可以取代为其他氨基酸而没有可观察到的与结构的相互结合能力的损失，该结构例如是抗体的抗原结合区或在受体分子上的结合位点。由于决定蛋白质的生物功能活性的是该蛋白质的相互作用能力和性质，因此一些氨基酸取代可以在蛋白序列和其基础多核苷酸序列中进行，并仍然产生具有类似性质的蛋白质。因此发明人预期各种改变可以在水疱性病毒的核酸序列或经编码的异源多核苷酸中进行，且没有可观察到的所关注生物效用或活性的损失。在进行这些变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质生物学功能中的重要性在本领域中是普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982)。应接受的是，氨基酸的相对亲水特征促成所生成蛋白质的二级结构，这反过来限定蛋白质与其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。本领域还理解的是相似氨基酸的取代可以在亲水性的基础上有效地进行。通过引用并入本文的美国专利第4,554,101号指出蛋白质的由其相邻氨基酸的亲水性支配的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物特性相关联。如美国专利第4,554,101号中详细描述的，已将下列亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸*-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解的是，氨基酸可以取代为具有相似亲水性值的另一氨基酸，且仍然产生生物学等同的和免疫学等同的蛋白质。在这些变化中，优选其亲水性值在±2内的氨基酸的取代，特别优选在±1内的氨基酸的取代，甚至更特别优选±0.5内的氨基酸的取代。如以上概述的，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷和尺寸等。考虑到各种前述特征的取代的实例对本领域技术人员是熟知的，其包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在做出这种改变时，可以考虑功能上相关的蛋白质的系统发生分析(参见图11，如图中描绘的，在rISFVN蛋白中进行的4个氨基酸改变)。IV.核酸分子一些实施方案涉及包含能够表达全部或部分的异源蛋白或多肽的多核苷酸的组合物和方法。在一些实施方案中，使全部或部分的病毒基因组突变或改变以生成具有一定性质和/或特性的病毒、病毒多肽、异源多核苷酸或异源多肽。多核苷酸可以编码含有全部或部分的病毒氨基酸序列或异源氨基酸序列的肽或多肽，或设计以使其不编码病毒多肽或编码具有至少一个功能或活性添加、提高、减少或去除的病毒多肽。如本文所用的，术语分离的“RNA、DNA或核酸片段”指已经从总基因组DNA或其他污染物中分离的RNA、DNA或核酸分子。在一些实施方案中，已将多核苷酸分离为不含其他核酸。“水疱性病毒基因组”、或“VSV基因组”、或“ISFV基因组”指在辅助病毒或提供其他反式因子的互补编码区的存在下或在其不存在下，可以提供给宿主细胞以得到病毒粒子的多核苷酸。术语“互补DNA”或“cDNA”指用RNA为模板制备的DNA。有时可以优选全部或部分基因组序列。同样地，编码多肽的多核苷酸指包括基本与其他天然存在的基因或蛋白质编码序列分离的编码序列和在一些方面调节序列的核酸片段。在这方面，为简单起见，术语“基因”用于指编码蛋白质、多肽或肽的核酸单元(包括适当转录、转译后改性、或定位所需的任何序列)。如本领域技术人员会理解的，该功能术语包括表达、或可以适用于表达蛋白质、多肽、结果域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、cDNA序列和较小的设计核酸片段。无论编码序列本身的长度，在本发明中使用的核酸片段可以与其他核酸序列结合以使其总长度可以显著变化，其他核酸序列例如是启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码片段等。因此预期可以使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选受限于在预期的重组核酸方案中制备和使用的简易性。预期本发明的核酸构建体可以编码任何来源的全长多肽或编码多肽的截短版本或改性版本，例如异源肽片段。核酸序列可以编码具有另外的异源编码序列的全长多肽序列，例如以允许多肽的纯化、转运、分泌、转译后改性，或实现治疗益处，例如靶向或疗效。可以添加标记或其他异源多肽至编码多肽的序列。术语“异源的”指与改性多肽、多核苷酸不同的多肽、多核苷酸或其片段，或被发现为与天然存在病毒相关的或由天然存在病毒编码的多肽、多核苷酸或其片段。在非限制性实例中，可以制备包含与特定病毒片段相同或互补的核苷酸的连续延伸段的一个或更多个核酸构建体，特定病毒片段例如是水疱性病毒N、P、M、G或L基因。本发明中使用的核酸片段包含编码改性多肽的改性核酸。这种序列可以作为密码子冗余和功能等同的结果出现。在考虑到待交换氨基酸性质的基础上，功能上等同的蛋白质或肽可以通过重组DNA技术的应用来产生，其中可以设计蛋白质结构中的变化。由人设计的改变可以通过位点定向突变形成技术的应用来引入，例如引入免疫原性的提高或其缺乏。蛋白质可以改性为减少蛋白质的体内毒性作用，或增加涉及蛋白质或包含这种蛋白质的病毒的任何治疗的疗效。重组水疱性病毒载体可以使用包括插入突变、点突变、删除和基因混编的各种技术来操作。可以将重组水疱性病毒设计为在感染病毒的细胞中通过混编N(核衣壳蛋白)基因到基因组中远离天然3’转录启动子的位置(远端)来减少NmRNA合成。由于VSV不被认为是人病原体，对VSV已有的免疫力在人类种群中是少见的，因此来源于VSV的载体的开发已经在例如免疫原性组合物和基因治疗的领域成为焦点。例如，研究已经确定VSV可以作为免疫原性组合物的有效载体，表达流感病毒血凝素(Roberts等人,1999J.Virol,73:3723-3732)、麻疹病毒H蛋白(Schlereth等人,2000J.Virol,74:4652-57)和HIV-1包膜蛋白和HIV-1gag蛋白(Rose等人,2001Cell,106:539-549)。在一些其他实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和重组载体，在其序列中包含来源于本文确认的(和/或通过引用并入本文的)序列中所示的那些的连续核酸序列。还会理解的是，本发明并不限于这些经确认序列的特定的核酸序列和氨基酸序列。因此重组载体和分离的核酸片段可以多样性地包括水疱性病毒编码区、在基础编码区中具有选定变化或改性的编码区，或其可以编码仍然包含水疱性病毒编码区的较大多肽，或者可以编码生物学功能等同的蛋白质或具有变体氨基酸序列的肽。在各种实施方案中，水疱性病毒多核苷酸和/或异源多核苷酸可以改变或突变。改变或突变可以包括插入、删除、取代、重排、倒位等，可能导致一些蛋白质或分子机制的调变、激活和/或灭活，以及改变基因产物的功能、位置或表达。其中使用的，多核苷酸的突变形成可以通过各种标准的突变形成过程(Sambrook等人，2001)来实现。突变是生物体或分子的功能或结构发生变化的过程。突变可以涉及单个基因、基因块或整个基因组的核苷酸序列的改性。单个基因的改变可以是涉及DNA序列中单个核苷酸碱基的去除、添加或取代的点突变的结果，或者其可以是涉及大量核苷酸的插入或删除的改变的结果。插入突变形成基于通过插入已知核苷酸或核酸片段的基因改性。因为其涉及一些类型的核酸片段的插入，产生的突变通常是功能缺失的，而不是功能获得的突变。但是，存在产生功能获得的突变的实例。插入突变形成可以使用标准的分子生物学技术来实现。结构导向的位点特异性突变形成代表用于蛋白质-配体相互作用的解析和设计的有力工具(Wells,1996；Braisted等人,1996)。通过将一个或更多个核苷酸序列改变引入到选定DNA中，该技术提供了序列变体的制备和试验。如本文使用的，“G-CT”指突变的VSVG基因，其中编码的G蛋白在其胞质域(羧基末端)也被称为G蛋白的“胞质尾区”中截短或删除一些氨基酸。G-CT1被截短其末尾羧基末端的28个氨基酸，导致仅保留来自29个氨基酸的野生型胞质域的1个氨基酸的蛋白产物。其他G基因截短例如G-CT9在美国专利第8,287,878号中确认，其相对于野生型缺失胞质域的末尾20个羧基末端氨基酸残基。在国际公开WO99/32648号和Rose,N.F.等人.2000J.Virol.,74:10903-10中描述的技术在改变rVSV的G蛋白的已知方法中。术语“表达载体”指含有编码能够转录的基因产物的至少部分的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子转译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，例如在反义分子或核糖酶的生成中，不转译这些序列。表达载体可以包含多种“控制序列”，其指对于在具体宿主生物体中可操作连接的编码序列的转录和可能的转译必需的核酸序列。除了控制转录和转译的控制序列，载体和表达载体可以包含还起到其他功能的核算序列，并在下文进行描述。“启动子”是为其中起始和转录速率被控制的核酸序列区域的控制序列。其可以包含结合调节蛋白和分子，例如RNA聚合酶和其他转录因子的遗传因子。短语“可操作定位的”、“可操作偶联的”、“可操作连接的”，“控制下的”和“转录控制下的”意味着启动子相对于核酸序列在正确的功能位置和/或方位以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以结合或可以不结合“增强子”来使用，所述增强子指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列。特定的起始信号对于编码序列的有效转译也可能是必需的。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的异源转译控制信号。转译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达的效率可以通过包含适当转录增强子因子来增强。在本发明的一些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)因子的使用被用于创建多基因信使或多顺反子信使。IRES因子能够绕过5'甲基化帽依赖型转译的核糖体扫描模型，在内部位点开始转译(Pelletier和Sonnenberg,1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的两个成员的IRES因子(Pelletier和Sonnenberg,1988)，以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow,1991)。凭借IRES因子，每个开放阅读框可以进入核糖体来有效转译。载体可以包括多克隆位点(MCS)，其是包含多个限制性酶位点的核酸区域，限制性酶切位点中的任一个可以联合标准重组技术用于消化载体。(参见Carbonelli等人,1999,Levenson等人,1998,和Cocea,1997，通过引用并入本文)。“限制性酶消化”指用酶催化切割核酸分子，所述酶仅在核酸分子的特定位置起作用。许多这些限制性酶是可商购的。可以使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或者片段化，使得异源序列能够连接到载体的。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，其可以是或可以不是彼此连续的。载体或构建体可以包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与RNA转录物通过RNA聚合酶的特异性终止的核酸序列组成。因此，在一些实施方案中，预期终止RNA转录物产生的终止信号。终止子可以在体内对实现期望的信使水平是必需的。预期用于本发明的终止子包括本文描述的转录的或本领域技术人员已知的任何已知终止子，包括但不限于，例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在一些实施方案中，例如由于序列截短，终止信号可以缺少可转录序列或可转译序列。多腺苷酸化信号可以用于影响转录物的适当多聚腺苷酸化。不认为多腺苷酸化信号的性质对于本发明的成功实践是关键的。实施方案包括SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号。多腺苷酸化可以提高转录物的稳定性或可以促进细胞质转运。在本发明的一些实施方案中，含有本发明的核酸构建体的细胞可以通过在表达载体中包含标记物来体外或体内确认。这种标记物会赋予细胞可确认的改变，允许包含表达载体的细胞易于确认。通常，可选择标记物是赋予允许选择的特性的标记物。阳性可选择标记物是该标记物的存在允许其选择的标记物，而阴性可选择标记物是其存在阻止其选择的标记物。阳性可选择标记物的实例是药物抗性标记物。通常包含药物选择标记物协助转化子的克隆和确认，例如赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素和组氨醇抗性的基因是有用的可选择标记物。除了赋予允许基于实施条件辨别转化子的表型的标记物，还预期包括可筛选标记物例如基础是比色分析的GFP的其他类型的标记物。或者，可以使用可筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也会知道如何使用免疫标记物，可能与FACS分析结合。如果使用的标记物能够与编码基因产物的核酸同时被表达，那么其不被认为是重要的。可选择标记物和可筛选标记物的其他例子是本领域技术人员所熟知的。V.与重组水疱性病毒相关的试剂盒在另一个实施方案中，本发明提供了准备好施用免疫原性、预防性或治疗性方案的药物试剂盒。该试剂盒被设计用于在哺乳动物或脊椎动物对象中诱导高水平的抗原特异性免疫应答。试剂盒可以包含含有如本文所述的rISFV组合物的至少一种免疫原性组合物。例如，在试剂盒中提供rISFV免疫原性组合物的多个预包装剂量用于多次施用。试剂盒还包含含有如本文所述的rVSV免疫原性组合物的至少一种免疫原性组合物。在一个实施方案中，在试剂盒中提供rVSV免疫原性组合物的多个预包装剂量用于多次施用。试剂盒还包含用于在如本文所述的初免/加强法中使用的免疫原性组合物的使用说明。试剂盒还可以包括用于实施特定分析、各种载体、赋形剂、稀释剂、佐剂等的说明，以及用于组合物施用的设备，例如注射器、电穿孔装置、喷雾装置等。除组合物之外，其他组件可以包括一次性手套、去污染说明、涂药棒或涂药容器。VI.实施例包括以下实施例及附图以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，在实施例或附图中公开的技术表示发明人发现的在本发明的实践中作用良好的技术，因此可以视为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解在不脱离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中可以做出很多改变仍得到相似或类似结果。实施例1伊斯法罕病毒(ISFV)的分析与回收已经开发出用于从编码ISFV基因组cDNA的质粒DNA回收重组伊斯法罕病毒(rISFV)的系统。在高度敏感的4至5周龄NIH瑞士韦伯斯特小鼠颅内神经毒力模型中研究野生型(wt)rISFV和减毒变体rISFVN4ΔCT25gag1的安全性。与具有<10PFU的LD50的wtVSVIN对比，未改性的rISFVwt表现出LD50>103PFU。与具有104的LD50的rVSVINN2CT1对比，rISFVN4ΔCT25gag1表现出LD50>107。这些结果表明rISFV与VSVIN相比从根本上是较低致病性的，可以不需要使用多种减毒策略(N混编，G蛋白胞质尾的截短)以实现如rVSVIN载体的类似安全性和免疫原性。伊斯法罕系统发生分析。水疱性病毒属的可用序列从GenBank下载。使用MUSCLE算法(Gouy等人,2010,MolecularBiologyandEvolution27:221-24；Edgar,2004.NucleicAcidsResearch32:1792-97)将N基因序列在SeaView(PBIL(Bio-InformatiqueLyonnais)，法国)中比对。序列通过从开放阅读框(ORF)推导氨基酸序列，然后返回核苷酸序列用于之后的分析来进行比对(Gouy等人,2010,MolecularBiologyandEvolution27:221-24；Edgar,2004.NucleicAcidsResearch32:1792-97)。使用PHYLIP软件包进行最大似然(ML)分析(Felsenstein,1989,Cladistics5,164–1663)。通过100次复制的引导重采样来评价ML系统发生的稳健性。分析显示该属中两种主要的簇(图1)。第一种簇由VSVIN及其亚型和VSVNJ组成，而第二种簇由ISFV、金迪普拉和皮理(Piry)病毒组成。这些数据与先前血清学分析一致以确定ISFV在属内的关系，共同表明ISFV与VSVIN关系较远(Tesh等人,AmJTropMedHyg.1977,Mar26(2):299-306)。伊斯法罕cDNA克隆的产生。低组织培养传代的ISFV分离株从德克萨斯大学医学部的新兴病毒和虫媒病毒世界参考中心(WorldReferenceCenterforEmergingVirusesandArboviruses)获得。病毒基因组RNA分离自培养物上清液，跨越完整ISFV基因组的cDNA片段通过逆转录(RT)和PCR扩增(RT-PCR)产生(图2)。将RT-PCR产物(片段3至5)分步克隆到含有VSV新泽西的全长基因组cDNA的质粒(pVSVNJN4CT1HIVgag1)中(图2)。将剩余片段(1至2)克隆到pBlueScript质粒(Invitrogen)中。表达单个ISFV蛋白(N、P、M、G和L)的用于拯救的支撑质粒通过将各自的开放阅读框(ORF)克隆到pVSVINP质粒的NcoI和SacI位点来产生(Witko等人,JVirolMethods.2006年7月，135(1):91-101)。与NcoI相容的黏性末端通过BspHI(N和M基因)、PciI(P基因)和BsmBI(G和L基因)来产生。L基因ORF通过连接两个cDNA片段：片段#1(BsmBI至AvrII)和片段#2(AVRII至SacI)来组装。所有产生的拯救支撑质粒通过核苷酸序列分析来核实。编码甲病毒包膜基因的rISFV和rVSVIN构建体。将EEEV菌株FL93和VEEV菌株ZPC738的包膜基因(包含E3-E2-6K-E1)克隆到pPBS-ISFV-38中(其结构在下文描述)。此外，将VEEV-ZPCE3-E1基因克隆到pVSVINN4CT1HIVgag5中。在每种情况下，使用限制性酶切位点XhoI和NotI使甲病毒属基因在载体基因组的第5位置插入，以该方式使插入基因处于rISFV或rVSV转录酶的控制下(图3A)。全部载体通过全长核苷酸序列分析核实，通过蛋白质印迹确认甲病毒蛋白质的表达(图3B)。文献充分记载了水疱性病毒(Ball和White,PNAS.1976,73(2):442-6；Villarreal等人,Biochemistry.1976，15(8)：1663-7)和其他反义RNA病毒(Conzelmann,Annualreviewofgenetics.1998,(32):123-62)在基因表达中的3’至5’梯度。因此，靶抗原的最大表达通过将转基因插入到基因组第1位置中来实现，所述第1位置紧临单个强3’转录启动子。然而，一些抗原的高表达水平可以对rVSV复制有毒，导致转基因不稳定性和抗原表达的损失(未公开的)。通过将转基因进一步移离3’转录启动子，毒性抗原例如HIV-1包膜蛋白的表达的向下调节已成功从在rVSV平台中迄今试验的一些不同病原体中保持包膜表达和全部靶抗原的遗传稳定性。考虑到如果以非常高的水平表达，E2/E1糖蛋白可能对rVSV和rISFV复制有毒的可能性，生成从基因组中第5位置表达E2/E1的减毒rVSV和rISFV载体。全长重组伊斯法罕病毒pDNA的生成.用于构建全长伊斯法罕病毒(ISFV)的原料由编码以下的两种亚克隆质粒组成：UTMB质粒#1(改称pPPBS-ISFV-001)：将T7启动子、VSV前导、ISFV前导、N、M、P、G的核酸序列和L的部分序列通过XhoI/KpnI位点插入到BluescriptIISK+中。将序列以3’至5’方向插入。UTMB质粒#2(改称pPBS-ISFV-002)：将ISFVL的部分3’序列的核酸序列和终止子通过XhoI/RsrII位点插入到VSVNJN4CT1主链中。除了以上，还提供在T7启动子控制下编码单个ISFV基因(M、P、N、G和L)的支撑质粒。包含全长ISFV基因组cDNA的pPBS-ISFV-008的构建ISFVL缺失序列的插入。将ISFVL的缺失2.4kb核酸序列插入到pPBS-ISFV-001和pPBS-ISFV-002中。缺失片段通过使用引物ISF_59-GTGCGTGGAAGACCGGTACCTCCCATTTGG(SEQIDNO:13)/ISF_60-TAATGTTATTGCCGGCGAATTCGAAACTGAATAAATC(SEQIDNO:14)和作为模板的pT7-IRES-ISFVL支撑质粒的PCR来生成。所用的PCR循环是：95℃，2分钟；(95℃，30秒变性/50℃，30秒退火/72℃，2.5分钟延伸)40个循环；72℃，2分钟。为确保序列的最高保真性，使用Pfx50DNA聚合酶(Invitrogen)。然后，将PCR产物用限制性酶KpnI和NgoMIV沿着pPBS-ISFV-001消化。将该限制性消化产物连接以生成pPBS-ISFV-003。还通过使用引物ISF_62-AATAACATTACTCGAGTTCGGTACCTCCCATTTGG(SEQIDNO:15)/ISF63-CAACTTTAAATTCGAAACTGAATAAATCTATC(SEQIDNO:16)和作为模板的pT7-IRES-L支撑质粒的PCR生成2.4kb，并分别通过XhoI和BstBI将其插入到pPBS-ISFV-002中以生成pPBS-ISFV-005。将全长ISFVL通过经XhoI/KpnI限制性位点结合pPBS-ISFV-001和pPBS-ISFV-005来修复以生成pPBS-ISFV-006。临近ISFV前导的T7启动子的构建。为了生成用于ISFV拯救的适当构建体，须将T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG(SEQIDNO:17))置于紧跟ISFV前导序列(ACGGAGAAAAACAAACCAATTCACGC(SEQIDNO:18))的上游的位置。因此，临近ISFV前导序列的T7启动子的PCR扩增使用引物ISF_65-TTGAGCACCTGGTACAGGTATGAATTGATGTGACAC(SEQIDNO:19)/ISF_66-GCGTGAATTGGTTTGTTTTTCTCCGTCCTATAGTGAGTCGTATTAGCCGGCCTCGAGTAAATTAATT(SEQIDNO:20)和作为模板的pPBS-ISFV-001来实现。得到的PCR扩增生成作为使用引物ISF_65-TTGAGCACCTGGTACAGGTATGAATTGATGTGACAC(SEQIDNO:21)/ISF_67-CGTATTAGCCGGCCTCGAGTAAATTAATT(SEQIDNO:22)的第二轮扩增的模板的片段以产生EcoNI/NgoMIV限制性位点。然后将PCR产物通过EcoNI/NgoMIV限制性位点插入到pPBS-ISFV-001中以生成pPBS-ISFV-007。含有全长伊斯法罕病毒cDNA的pDNA的构建。通过用限制性酶NgoMIV/SanDI消化pPBS-ISFV-006和pPBS-ISFV-007以构建具有核酸序列5’-N1-P2-M3-G4-L5-3'的pPBS-ISFV-008和邻近ISFV前导序列的T7启动子来生成含有全长ISFV基因组cDNA的pDNA。rISFV拯救过程pDNA的制备。对于每个电穿孔，在无菌条件下在微量离心管中将如表1列出的下列质粒DNA组合：*全部病毒蛋白由野生型核苷酸序列表达并在T7启动子控制下转录**对一次电穿孔计算pDNA的量用无菌、不含核酸酶的水将DNA体积调节至300μL。然后，添加60μl的3M醋酸钠和900μl的100％乙醇，将混合物在-20℃保存过夜。通过在4℃以14000rpm离心30分钟使DNA形成丸粒。将上清液吸出，将DNA丸粒风干并再悬浮于50μl无菌、不含核酸酶的水中用于每个电穿孔。Vero细胞的制备。将如表2列出的以下培养基用于ISFV的拯救：每个电穿孔需要来自约1.3几乎融合的T-150烧瓶或者1个融合烧瓶的细胞。将每个T150烧瓶的细胞单层用不含Ca2+或Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)冲洗。将DPBS吸出，用5ml胰蛋白酶-EDTA溶液进行胰蛋白酶化，然后在37℃下培养最多5分钟。在通过敲击烧瓶取出细胞后，将10mL拯救培养基1添加至每个烧瓶以使细胞悬浮，将2个烧瓶各自转移到含有10mL拯救培养基1的50mL锥形管中。将细胞在4℃下以1200rpm离心5分钟。将上清液吸出，用每50mL锥形管10mL拯救培养基2使细胞再悬浮，然后在4℃下以1200rpm离心5分钟。舍弃洗液，使细胞丸粒再悬浮于0.7mL的拯救培养基2。将细胞悬浮液转移到以50μl质粒DNA溶液等分的微量离心管中，轻轻混合，然后将细胞/DNA转移至电穿孔小容器中。电穿孔。在如下BTX820电穿孔仪中对细胞进行电穿孔：模式：低压电压：140V脉冲数：4脉冲长度：70毫秒脉冲间隔：500毫秒在电穿孔后，将全部样品在室温下放置10分钟，然后将1mL拯救培养基1添加至小容器中轻轻混合以使电穿孔细胞再悬浮。然后将细胞悬浮液从小容器转移至含有10mL拯救培养基1的15mL离心管中，在4℃下以1200rpm离心5分钟。将培养基吸出，使细胞再悬浮于10mL拯救培养基1中，并转移到含有20mL拯救培养基1的T-150烧瓶中。将烧瓶在37℃(5％的CO2)下培养3小时，然后在43℃(5％的CO2)下热激3至5小时，然后恢复至32℃长期培养。过夜培养后，用25mL新鲜拯救培养基1替换上清液。在5至10天后，阳性rISFV拯救显示细胞病变效应(CPE)，其特征是聚拢细胞的区域。收集拯救上清液；速冻于乙醇/干冰浴中，将单个病毒克隆通过噬斑挑取来分离，接着在Vero细胞中两轮扩增以产生病毒工作储备物。ISFV/水疱性病毒核蛋白氨基酸比对将ISFV核蛋白的氨基酸序列与其他水疱性病毒核蛋白序列进行比对(表3)。匹配百分比基于与ISFV核蛋白序列的氨基酸一致性。序列中详细的同源性可以见于图4。氨基酸同源性区域加阴影。表3核蛋白序列来自与ISFV相比的匹配％VSV印第安纳血清型51VSVNJ血清型51金迪普拉(Chandipura)58皮理(Piry)60科卡尔(Cocal)50阿拉戈斯(Alagoas)51鲤春病毒血症病毒43水疱_梭子鱼苗45实施例2使用基因混编构建减毒rISFV载体和ISFVG胞质尾截短rISFV-N4G5-MCS1的构建。质粒pPBS-ISFV-008包含核酸序列5’-N1-P2-M3-G4-L5-3’[rISFV的反基因组]。下标数字表明每个ISFV基因、P(编码磷蛋白)、M(编码基质蛋白)、G(编码附着蛋白)、N(编码核衣壳蛋白)和L(编码聚合酶蛋白)的基因组位置。质粒pPBS-ISFV-009包含核酸序列5’-MCS1-N2-P3-M4-G5-L6-3’(在位置1具有额外转录盒的rISFV的反基因组)。根据该式，MCS(多克隆位点)是在rISFV反基因组中紧挨ISFVN上游的位置1的空转录单元(TU)。下标数字表明每个ISFV基因、P(编码磷蛋白)、M(编码基质蛋白)、G(编码附着蛋白)、N(编码核衣壳蛋白)和L(编码聚合酶蛋白)的反基因组位置。首先，出于克隆目的，将ISFVL中的内部NheI位点去除：用引物ISF_68–AATCTGGAcgcgtctcGCTAGtCAGGCTGATTATTTGAGG(SEQIDNO:23)/ISF_48–TTGATATTTCCCCAACTCTAC(SEQIDNO:24)并使用pPBS-ISFV-008为模板来生成PCR片段，其通过AfeI/BsmBI和AfeI/NheI限制性酶切位点分别插入到pPBS-ISFV-008中以生成pPBS-ISFV-010。用引物ISF_73–CGCATGCCGTCTCCTTATGTTGATTG(SEQIDNO:25)/ISF28–AGCATTCATTATAAGTATGAC(SEQIDNO:26)并使用pPBS-ISFV-008为模板来生成含有部分ISFVM–ISFVG–部分ISFVL序列的第二PCR片段。将该片段通过SphI/AGEI限制性酶切位点插入到改性pT7Blue克隆载体(Novagen)中以生成pPBS-ISFV-011。从pPBS-ISFV-011开始，使用引物对ISF_71–GCTTTTCACAGATGAAGCTAGCTGAAAGTATGAAAAAAACG(SEQIDNO:27)/ISF_72–GTTTTTTTCATACTTTCAGCTAGCTTCATCTGTGAAAAGCTTG(SEQIDNO:28)和ISF_69–AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG(SEQIDNO:29)/ISF_70–GAATAAAACTGAAGTCATTTTGACACGCGTTTGACCTCTGTTAAT(SEQIDNO:30)来进行两个连续突变形成反应以生成pPBS-ISFV-013。然后用BsmBI/AGEI限制性酶消化pPBS-ISFV-013，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFV-009的相应载体片段连接。因此所得构建体pPBS-ISFV-014包含核酸序列5’-MCS1-N2-P3-M4-G5-L6-3’，但不同于pPBS-ISFV-009，ISFVG基因两侧是MluI/NheI限制性酶切位点，使得与包含例如ISFVG胞质尾截短的ISFVG变体容易交换。为了将N基因混编到位置4中并因此使rISFV减毒作为载体，用引物ISF_84–CAGCTGGCGGCCGCTAGGAATTCAAATCAACATATATGAAAAAAATCAACAGAGATACAACAATG(SEQIDNO:31)/ISF20-ACATAGTGGCATTGTGAACAG(SEQIDNO:32)并使用pPBS-ISFV-008为模板生成PCR片段，其通过HindIII/NotI限制性酶切位点插入到改性pT7Blue克隆载体(Novagen)中来生成pPBS-ISFV-017。通过将来自pPBS-ISFV-017的BsmBI/NotI插入物交换到pPBS-ISFV-014的相应载体片段中使pPBS-ISFV-017和pPBS-ISFV-014结合以生成PPBS-ISFV-019。同时，通过用引物ISF_73–CGCATGCCGTCTCCTTATGTTGATTG(SEQIDNO:33)/ISF_82–AGTCATACCGGTCTCGTTAATTTTTTTCATATCTTTCTTCTGCATGTTATAATTC(SEQIDNO:34)和用pPBS-ISFV-008作为模板的片段的PCR扩增来生成pPBS-ISFV-015，其通过SphI/AgeI限制性酶切位点插入到改性pT7Blue克隆载体(Novagen)中。用ISF_80–TCGAGAACGCGTTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATATATGTTGATTTGAATTC(SEQIDNO:35)/ISF_81–ATTCCAACGCGTCTCGTTAACAGGGATCAAAATGACTTCTGTAGTAAAG(SEQIDNO:36)并用pPBS-ISFV-008为模板生成第二PCR片段，其分别通过BsmBI/MluI限制性酶切位点和BsaI/MluI限制性酶切位点插入到pPBS-ISFV-015中以生成pPBS-ISFV-016。最后，通过将来自pPBS-ISFV-016的BsmBI/MluI插入物交换到pPBS-ISFV-019的相应载体片段中使pPBS-ISFV-016和pPBS-ISFV-019结合。因此得到的构建体pPBS-ISFV-020包含核酸序列5’-MCS1-P2-M3-N4-G5-L6-3’，与pPBS-ISFV-014相比，其中N基因被混编至rISFV的位置4。rISFV-N4G3-MCS5的构建。从pPBS-ISFV-013开始，用引物ISF_90–GCTTTTCACAGATGAAGCTAGCGCATGCGGCCGCTGAAAGTATGAAAAAAACG(SEQIDNO:37)/ISF_91–GTTTTTTTCATACTTTCAGCGGCCGCATGCGCTAGCTTCATCTGTGAAAAGCTTG(SEQIDNO:38)进行突变形成反应以生成pPBS-ISFV-022。然后将由ISF_92–CTAGCTGAAAGTATGAAAAAAATTAACAGAGGTCAAACTCGAGGATATCGGTACCGAAGGCGCGCCCAGCTGTGCGGCC(SEQIDNO:39)和ISF_93–GGCCGCACAGCTGGGCGCGCCTTCGGTACCGATATCCTCGAGTTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATACTTTCAG(SEQIDNO:40)生成的寡核苷酸连接体与pPBS-ISFV-022的NheI/NotI载体片段连接以生成pPBS-ISFV-023。用引物ISF_98-GAATTCCTCGAGTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATATATGTTGATTTGAATTC(SEQIDNO:41)和ISF_99-GATGAAGCTAGCTGAAAGTATGAAAAAAATTAACAGGGATCAAAATGACTTCTGTAG(SEQIDNO:42)并用pPBS-ISFV-016为模板生成PCR片段，其通过XhoI/NheI限制性酶切位点插入到pPBS-ISFV-023中以生成pPBS-ISFV-024。另外，用引物ISF16-ATCATTCCTTTATTTGTCAGC(SEQIDNO:43)和ISF_100-TATATGGCTAGCGAAGACAGAGGGATCAAAATGTCTCGACTCAACCAAAT(SEQIDNO:44)并用pPBS-ISFV-017为模板生成PCR片段，其通过BsmBI/NheI限制性酶切位点插入到pPBS-ISFV-017中以生成pPBS-ISFV-025。然后将由ISF_101–CTAGCCCGGCTAATACGACTCACTATAGGACGGAGAAAAACAAA(SEQIDNO:45)/ISF_102–TTGGTTTGTTTTTCTCCGTCCTATAGTGAGTCGTATTAGCCGGCG(SEQIDNO:46)和ISF_103–CCAATTCACGCATTAGAAGATTCCAGAGGAAAGTGCTAAC(SEQIDNO:47)/ISF_104–CCCTGTTAGCACTTTCCTCTGGAATCTTCTAATGCGTGAA(SEQIDNO:48)分别生成的两个寡核苷酸连接体与pPBS-ISFV-025的NheI/BbsI载体片段连接(以生成pPBS-ISFV-026)。为了生成pPBS-ISFV-030，即包含核酸序列5’-P1-M2-N3-G4-L5-3’的质粒，将pPBS-ISFV-026用BsmBI/NgoMIV限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFV-020的相应载体片段连接。最后，通过将来自pPBS-ISFV-024的BsmBI/AgeI插入物交换到pPBS-ISFV-030的相应载体片段中使pPBS-ISFV-024和pPBS-ISFV-030结合。因此得到的构建体pPBS-ISFV-031包含核酸序列5’-P1-M2-G3-N4-MCS5-L6-3’，与pPBS-ISFV-014相比，其中N基因被混编至rISFV的位置4。rISFV-N*4G5-MCS1的构建。尽管rISFV和rVSVN蛋白的氨基酸序列比对显示仅总共52％的同源性，但是该比对证明对于强的、已知的H2d限制型表位(MPYLIDFGL；参见图11)的非常接近的同源性。因此将来自其他水疱性病毒的另外的N蛋白的进一步比对用于消除或至少减少rISFV和rVSV之间对于该段氨基酸的同源性。从pPBS-ISFV-016开始，使用引物ISF_127–GAAAGACAAGAAGTGGACCAGAGCGATTCCTACATGCCTTACATGATTGATATGGGGATCTCAACCAAATC(SEQIDNO:49)/ISF_128–GGTTGAGATCCCCATATCAATCATGTAAGGCATGTAGGAATCGCTCTGGTCCACTTCTTGTCTTTCTTTC(SEQIDNO:50)进行突变形成反应以生成含有在ISFVN中的下列氨基酸改变的pPBS-ISFV-033：K271Q、A272S、L279M、F282M(ISFVN*)(参见图11)。用SanDI/BsrGI限制性酶消化pPBS-ISFV-033，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFV-024的相应载体片段连接以生成pPBS-ISFV-037。最后，通过将来自pPBS-ISFV-037的NheI/Agel插入物交换到pPBS-ISFV-031的相应载体片段中使PBS-ISFV-037和pPBS-ISFV-031结合。因此得到的构建体pPBS-ISFV-038包含如同pPBS-ISFV-031的反基因组核酸序列5’-P1-M2-G3-N4-MCS5-L6-3’，然而，编码的ISFVN蛋白携带四个氨基酸改变K271Q、A272S、L279M、F282M(ISFVN*)。表达模型抗原HIV-1gagSDE的减毒rISFVN载体。质粒pPBS-HIV-055是包含称为HIV-1gagSDE的截短HIV-1gag基因(单显性表位)的标准克隆载体。HIV-1gagSDE的氨基酸序列如下：1MVARASVLGGELDRWEKEEERPGGKKKYKLKEEEWASRELERFAVNPGLETSEGCRQ60I-192GGHQAAMQMLKETINEEA210A-333ILKALGPAATLEEMMTACQGVGGYPYDVPDYAPGHKARV363L(SEQIDNO:51)。数字表明在天然HIV-1gag蛋白中的氨基酸位置。肽“AMQMLKETI”(SEQIDNO:52)被发现为BALB/c小鼠中T细胞应答的强诱导物，因此将HIV-1gagSDE用作试验不同载体设计的免疫原性的模型抗原。首先，将pPBSHIV-055用XhoI/NotI限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFV-014的相应载体片段连接。因此得到的构建体pPBS-ISFVHIV-013包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-N2-P3-M4-G5-L6-3’，并用于生成相应的rISFV。将质粒pPBSHIV-055用XhoⅠ/NotI限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFV-020的相应载体片段连接。因此得到的构建体pPBS-ISFVHIV-014包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-P2-M3-N4-G5-L6-3’。因此，相应的rISFV病毒包含单一减毒标记物-混编到rISFV的位置4中的ISFVN。用引物ISF_83–TTTTTTGCTAGCTTCACCTGCATAATAGTGGCAAC(SEQIDNO:53)/ISF_69–AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG(SEQIDNO:54)并用pPBS-ISFV-HIV-014为模板生成PCR片段，其通过MluI/NheI插入到pPBS-ISFV-HIV-014以生成pPBS-ISFVHIV-015，其当前包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-P2-M3-N4-(GΔCT25)5-L6-3’。因此相应的rISFV病毒包含两个减毒标记物：(1)使ISFVN混编到rISFV反基因组的位置4，和(2)截短ISFVG胞质尾(CT)远端的25个氨基酸。CT的确切长度和ISFVG蛋白的跨膜(TM)域尚未如VSVIN的那些那样被充分表征，但预测邻近羧基末端的约18个氨基酸(aa)疏水域是ISFVG蛋白TM锚。剩余的下游33个氨基酸残基表示G蛋白CT。此外，将pPBS-ISFV-033用BsmBI/MluI限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFVHIV-015的相应载体片段连接。因此得到的构建体pPBS-ISFVHIV-018包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-P2-M3-N*4-(GΔCT25)5-L6-3’。与rISFV-HIV-015相比，在BALB/c小鼠的已知的强T细胞表位内，在相应rISFV-HIV-003中经编码的ISFVN基因携带四个氨基酸改变K271Q、A272S、L279M、F282M。将质粒pPBS-ISFVHIV-015用MluI/NheI限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFVHIV-013的相应载体片段连接。因此得到的构建体pPBS-ISFVHIV-017包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-N2-P3-M4-(GΔCT25)5-L6-3’。因此，相应的rISFV病毒包含单一减毒标记物-ISFVG胞质尾的截短。最后，生成减毒的rISFV载体，其中截短的ISFVGΔCT25基因替换为VSVNJGCT1基因，所述VSVNJGCT1基因编码来自NJ血清型的具有在28个氨基酸的胞质尾相似截短的改性VSVG。为了生成pPBS-ISFVHIV-016[包含核苷酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-P2-M3-N4-(VSVNJGCT1)5-L6-3’]，将pPBS-VSV-HIV-054(含有两侧是MluI/NheI限制性酶切位点的VSVNJGCT1基因的rVSV克隆载体)用MluI/NheI限制性酶消化。然后将分离的插入物与来源于pPBS-ISFVHIV-015的相应载体片段连接。因此得到的构建体pPBS-ISFVHIV-016包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-N2-P3-M4-(VSVNJGCT1)5-L6-3’，并用于拯救相应的rISFV。通过噬斑分析对表达HIV-1gagSD的全部rISFV的减毒进行体外试验。观察到的噬斑尺寸如下(图5)：rISFV-HIV-013＝rISFV-HIV-14>rISFV-HIV-15＝rISFV-HIV-017≥rISFV-HIV-018＝rISFV-HIV-016。除了上述rISFV构建体，将由以下质粒生成的两个减毒rVSV载体用于初免-加强免疫接种实验：pPBS-VSV-HIV-106包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-P2-M3-N4-(GCT1)5-L6-3’，全部载体基因(P、M、N、GCT1和L)来源于VSV印第安纳血清型。将来源于该质粒的rVSVIN用于图16描绘的研究。pPBS-VSVHIV-122包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-P2-M3-N4-(GCT1)5-L6-3’，载体基因(P、M、N、和L)来源于VSV印第安纳血清型，载体基因GCT1来源于VSV新泽西血清型。将来源于该质粒的rVSVNJ用于图16描绘的研究。稳定ISFVG胞质尾的截短。使包含ISFVGΔCT25基因的大量减毒rISFV(例如rISFV-HIV-015和rISFV-HIV-018)在Vero细胞培养物中大量传代以确定该减毒标记的稳定性。在第10代，几乎全部rISFV的胞质尾延长了两个氨基酸以基本包含rISFVGΔCT23基因。由此，试验的rISFV将ISFVGΔCT25基因的终止密码子改变为氨基酸的密码子，然后在两个密码子远的下游使用终止密码子框中的替代物。因此检测ISFVGΔCT25-L基因结合的两个操作在rISFV中使减毒标记物ISFVGΔCT25稳定的能力：A)将包含ISFVGΔCT25的转录盒的转录(下划线)终止信号和译(粗体)终止信号结合：ISFVGΔCT25的最后氨基酸从精氨酸改变为缬氨酸。B)将存在于原型rVSVIN-N4CT1载体中的VSVINGCT1的3’-NCR用作ISFVGΔCT25表达盒的3’-NCR：结果表明，在Vero细胞培养中，仅方法(B)在相应的rISFV病毒(例如rISF-HIV-020)的大量传代期间稳定了ISFVGΔCT25减毒标记物。方法A-构建为了操作ISFVGΔCT25-L基因连接，将pPBS-ISFVHIV-018用MluI/NheI限制性酶消化，并将其插入到来源于改性pT7Blue克隆载体的相应载体片段(Novagen)中以生成pPBS-ISFV-049。首先，用引物ISF_140–CTATTATGCGTATGCGAGACGCGTCTCGTATGAAAAAAACGAATCAACAGAG(SEQIDNO:58)/ISF_141–CTGTTGATTCGTTTTTTTCATACGAGACGCGTCTCGCATACGCATAATAGTG(SEQIDNO:59)对pPBS-ISFV-049进行突变形成反应，以生成pPBS-ISFV-051。另外，用引物ISF_146-AATTAACGTCTCAGAGATTGCAGCGAACCCCAGTGCGGCTGCTGTTTCTTTC(SEQIDNO:60)/ISF_69–AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG(SEQIDNO:61)并用pPBS-ISFV-031为模板生成PCR片段。与由ISF_144-TCTCTGTGATCCTGATCATCGGACTGATGAGGCTGCTGCCACTACTGTGCAGGTGAG(SEQIDNO:62)和ISF_145–CTAGCTCACCTGCACAGTAGTGGCAGCAGCCTCATCAGTCCGATGATCAGGATCACA(SEQIDNO:63)生成的寡核苷酸连接体一起，将PCR片段(MluI/BsmBI)通过MluI/NheI插入到pPBS-ISFV-049中以生成pPBS-ISFV-056。与pPBS-ISFV-049相比，已经将在pPBS-ISFV-056中编码ISFVGΔCT25跨膜区的核苷酸序列沉默改性以降低A/T丰富度。用引物ISF_147–CTAGGCGCGTCTCGCATACGCACAGTAGTGGCAG(SEQIDNO:64)/ISF_69–AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG(SEQIDNO:65)并用pPBS-ISFV-056为模板生成PCR片段，其通过MluI/BsmBI插入到pPBS-ISFV-051中以生成pPBS-ISFV-059。将质粒pPBS-ISFV-059用MluI/AGEI限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFVHIV-018的相应载体片段连接。因此得到的构建体pPBS-ISFVHIV-021包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-N*2-P3-M4-G5-L6-3’，具有在ISFVGΔCT25跨膜区的沉默核苷酸改变以相比天然序列而降低A/T丰富度，ISFVGΔCT25的终止密码子是ISFVGΔCT25-L基因连接中转录终止的部分。方法B-构建将质粒pPBS-ISFV-056用MluI/NheI限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-VSVHIV-020的相应载体片段连接，其含有从第一个转录盒表达HIV-1gag的减毒rVSV载体(N4CT1)的反基因组序列。因此得到的构建体pPBS-ISFV-057包含核酸序列5’-(HIV-1gag)1-VSVP2-VSVM3-VSVN4-ISFVGΔCT255-VSVL6-3’，由此将VSVGCT1的3’-NCR连接到编码ISFVGΔCT25的开放阅读框。用引物ISF_148–TGTTAGCGTCTCTCATAAAAATTAAAAACTCAAATATAATTG(SEQIDNO:66)和ISF_69–AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG(SEQIDNO:67)并用pPBS-ISFV-057为模板生成PCR片段，其通过MluI/BsmBI插入到pPBS-ISFV-051中以生成pPBS-ISFV-058。最后，将pPBS-ISFV-058用MluI/AGEI限制性酶消化，将分离的插入物与来源于pPBS-ISFVHIV-018的相应载体片段连接。因此得到的构建体pPBS-ISFVHIV-021包含核酸序列5’-(HIV-1gagSDE)1-N*2-P3-M4-G5-L6-3’，具有在ISFVGΔCT25跨膜区的沉默核苷酸改变以相比天然序列降低A/T丰富度，和包含在ISFVGΔCT25–L基因连接中的VSVGCT1的3’-NCR。实施例3动物研究进行了一系列小鼠研究以研究包含表达甲病毒蛋白的rISFV载体的免疫原性组合物的相对安全性和功效。由于水疱性病毒和相关病毒的已知神经毒力特性，将小鼠颅内(IC)LD50模型用于载体安全性的初步评价(Olitsky等人,JournalofExperimentalMedicine.1934,59:159–71；Frank等人,AmJVetRes.1945,Jan:28–38；Sabin等人,JournalofExperimentalMedicine.1937,66:15–34；Rao等人,Lancet.2004,364(9437):869–74)。在严格的VEEV和EEEV攻击模型中评价功效。rISFV载体的神经毒力。进行初步研究以研究未改性rISFV和表达HIV-1gag的高度减毒变体(rISFV-N4GΔCT25HIVgag1)的神经毒力特性。具有从先前研究已知的LD50的rVSVINN2CT1载体用作阳性对照(Clarke等人,JVirol.2007,Feb；81(4):2056-64)。将10只五周龄的、雌性瑞士韦伯斯特小鼠的组通过颅内(IC)途径用25μL的连续稀释10倍的每种病毒进行接种IC，观察动物致死性21天。将PBS用作注射过程的对照(表4)。在注射rISFV载体的动物中观察到有限的致死性，因此无法确定LD50(表4)。相反地，rVSVINN2CT1确实引起致死性，确定与先前研究中确定的LD50相似的LD50(104pfu)(表4)。这些数据显示，rISFV比rVSVIN是固有地具有较低神经毒性的，这证明了在其未改性形式中5至10个噬斑形成单位(PFU)的LD50(Clarke等人,JVirol.2007,Feb；81(4):2056-64)。表4.在瑞士韦伯斯特小鼠中rISFV和rVSVIN载体的LD50滴度rISFV载体的保护功效。进行一系列研究以研究rISFV作为防止甲病毒感染和疾病的载体的可能性。对于这些研究，将4至6周龄的雌性CD-1小鼠通过肌内途径用50μL剂量体积进行免疫。然后用皮下注射的104PFU的VEEV-ZPC或EEEV-FL93来对小鼠进行攻击。全部动物护理和流程符合机构动物护理和使用委员会指南。对抗VEEV和EEEV攻击的短期保护。为了确定在第五位置编码VEEV-ZPC的E3-E1或EEEV-FL93的rISFV-N4G3载体是否可以防止VEEV和EEEV的致死性攻击，将CD-1小鼠群用108PFU的载体进行免疫，然后在免疫接种后攻击3至4周(表5)。免疫接种后，在用rISFV-N4G3-(EEEV-FL93E3-E1)5免疫的小鼠中容易检测到中和抗体应答，而在用rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC)5免疫的动物中几乎检测不到中和抗体(表6、7)。无论抗体应答与否，全部动物受到保护免受致死性EEEV-FL93和VEEV-ZPC攻击(图6和图7)。表5.VEEV-ZPC和EEEV-FL93攻击研究的研究设计表6.用rISFV-N4G3-(EEEV-FL93E3-E1)5免疫的小鼠的中和抗体应答表7.用rISFV-N4G3-(VEEV-ZPCE3-E1)5免疫的小鼠的中和抗体应答剂量滴定和长期免疫力研究。将动物用108PFU或107PFU的rISFV-N4G3-(VEEV-E3ZPC-E1)5或rVSVINN4G(CT-1)3-(VEEV-ZPCE3-E1)5进行免疫(表8)。免疫接种后，在以两种剂量免疫接种rISFV-N4G3-(VEEV-ZPCE3-E1)5的多数动物中都可以检测到VEEV中和抗体应答(表9)。在用rVSVINN4G(CT-1)3-(VEEV-ZPCE3-E1)5免疫的全部动物中都检测到更稳健的中和抗体应答(表10)。然而，如在先前研究中观察到的，无论对VEEV的中和抗体应答与否，全部动物受到保护免受以下致死性攻击(图8)。表8.剂量滴定和长期免疫研究设计表9.用rISFV-N4G3-(VEEV-ZPCE3-E1)5免疫的小鼠的中和抗体应答表10.用rVSVIN-N4G(CT-1)3-(VEEV-ZPCE3-E1)5免疫的小鼠的中和抗体应答混合免疫原性组合物的疗效。因为免疫原性组合物应该提供针对多于一种甲病毒的保护，所以研究设计为研究同时用rISFV-N4G3-(VEEV-E3ZPC-E1)5和rISFV-N4G3-(EEEV-FL93E3-E1)5免疫的动物是否可以受保护免受EEEV-FL93和VEEV-ZPC两者的致死性攻击(表11)。如在先前研究中的，在几乎全部小鼠中检测到对EEEV-FL93和VEEV-ZPC两者的中和抗体(表12和表13)，经免疫的全部动物受到保护免受致死性EEEV-FL93(图9)或VEEV-ZPC(图10)攻击。这些结果证明，混合免疫原性组合物可以针对多种甲病毒提供保护免受致死性攻击。表11.混何免疫接种研究设计*第1组动物用108pfu的每种病毒免疫表12.用rISFV-N4G3-(EEEV-FL93E3-E1)5和rISFV-N4G3-(VEEVZPCE3-E1)5免疫的小鼠对EEEV-FL93的中和抗体应答表13.用rISFV-N4G3-(EEEV-FL93E3-E1)5和rISFV-N4G3-(VEEVZPCE3-E1)5免疫的小鼠对VEEV-ZPC的中和抗体应答实施例4在BALB/c小鼠中用rVSV和rISFV载体对PBS-Mu-062的初免/加强研究进行一系列小鼠研究以评价在Balb/c小鼠中使用编码HIVGag单一显性表位(SDE)的rVSV和rISFV的初免/加强方案。这些研究设计为达到两个研究目标：(a)PBS-Mu-062a：研究小鼠中两种新rISFV-HIVgagSDE载体的免疫原性，挑选用rVSVINN4CT1Gag的将来的初免/加强研究的优选候选，和(b)PBS-Mu-062b：比较由使用rVSVNJ/rVSVIN和rISFV/rVSVIN的初免/加强组合引起的免疫应答。PBS-Mu-062a：对于该研究，以使免疫原性最强的构建体进入到基于rVSVIN的HIVgag表达载体的将来的初免/加强研究中为目标，将两种候选基于rISFV的HIVgag表达载体进行比较。PBS-Mu-062a研究设计的概述在图13中提供。对于该研究，通过肌内注射107pfu的在图12中概述的HIVgag表达载体对BALB/c小鼠(n＝5只/组)进行免疫，十天后，收集脾细胞并通过ELISpot分析来试验HIVgagSDE和rVSVINN肽池特异性的IFN-γ分泌(图14)。在该研究中，使用rISFVHIV-016(rISFV)的免疫接种导致236±74SFC/106个脾细胞的平均HIVgagSDE特异性干扰素γELISpot应答，应答不显著区别于由其他rISFV-HIVgag候选rISFV-HIV-018(rISFVN*)引发的HIVgagSDE特异性ELISpot应答(147±32SFC/106个脾细胞)(图14左侧)。重要地，相比编码野生型病毒N基因的rISFV-HIVgag候选rISFV-HIV-016(140±59SFC/106个脾细胞)，编码在已知H2d限制型表位中具有一系列突变的病毒N蛋白的载体rISFV-HIV-018显示引发抗载体rVSVINN肽池特异性ELISpot应答的降低趋势(45±15SFC/106个脾细胞)(图14右侧)。基于这些结果，选择rISFVN*(rISFV-HIV-018)用于后续的rVSV/rISFV初免/加强实验。PBS-Mu-062b:对于该实验，比较了仅使用基于rVSV的载体相对使用基于rISFV和rVSV的载体组合的不同初免/加强免疫方案的相对免疫原性。PBS-Mu-062b研究设计的概述在图16中提供。对于该实验，通过肌内注射107pfu的在图15中概述的rISFVHIVgagSDE表达载体结合rVSVINHIVgagSDE构建体来对BALB/c小鼠(n＝5只/组)进行免疫(图12)。将小鼠按照0和4周的时间表进行免疫。在最终免疫接种后一周，收集脾细胞并通过ELISpot分析来试验HIVgagSDE特异性(图17)和rVSVINN肽池特异性(图18)的IFN-γ分泌。在该研究中，用rVSVNJ/rVSVIN初免/加强方案免疫的小鼠证实HIVgagSDE特异性ELISpot应答(2330±412SFC/106个脾细胞)，其显著低于(P<0.05)在用异源rISFVN*/rVSVIN初免/加强方案免疫的小鼠中所见的应答(4758±183SFC/106个脾细胞)(图17)。HIVgagSDE特异性IFN-γELISpot应答相比用rVSVNJ/rVSVIN免疫的小鼠的这种显著的两倍增加不受转换异源方案顺序的影响(rVSVIN/rISFVN*；5870±1258SFC/106个脾细胞)或不受rISFV载体中野生型病毒N基因存在的影响(rISFV/rVSVIN；5061±890SFC/106个脾细胞)(图17)。如图18所示，与rVSVNJ/rVSVIN(2794±456SFC/106个脾细胞)或rISFV/rVSVIN(1459±238SFC/106个脾细胞)方案相比，异源rISFVN*/rVSVIN和rVSVIN/rISFVN*初免/加强方案引起显著更低的(P<0.05)平均rVSVINN肽池特异性IFN-γELISpot应答(分别为451±67和408±55SFC/106个脾细胞)。上述研究清楚证明，与rVSVNJ/rVSVIN免疫接种方案相比，小鼠中异源rISFV/rVSVIN和rVSVIN/rISFV初免/加强免疫接种方案引起显著更高的IFN-γELISpot应答。此外，rISFVN*突变降低了对rVSVN的交叉反应应答，虽然这没有导致HIVgagSDE特异性IFN-γELISpot应答的增加。实施例5在A129小鼠中表达基孔肯雅病毒糖蛋白的rISFV载体的研究基孔肯雅病毒(CHIKV)是披膜病毒科(Togaviridae)中甲病毒属中由蚊子传播的病毒。人的CHIKV感染导致高烧、头痛、呕吐、皮疹和疼痛性关节炎。可以持续数月甚至数年的关节炎(Powers和Logue.J.Gen.Virol.2007,88:2363-2377)是普遍地自限性CHIKV感染的标志。然而，在印度次大陆和印度洋岛的影响超过150万人的近期流行病中，一些人表现出了更严重的症状，包括脑炎、出血性疾病和死亡(Schwartz和Albert.NatureRev.Microbiol.2010,8:491-500)。在加勒比群岛和美洲中CHIKV的更近期的和更迅速的传播(Powers.J.Gen.Virol.2015,96:1-5)已经产生了对于针对CHIKV的免疫原性组合物的甚至更迫切的需求。CHIKV有单一、正义、11.8kb的RNA基因组，其编码四个非结构蛋白(nsP1-4)和五个结构蛋白(C、E3-E2-6K-E1)。结构蛋白从前体切割以生成衣壳和包膜糖蛋白(Strauss和Strauss.Microbiol.Rev.1994,58:491-562)。E2蛋白和E1蛋白形成稳定的异质二聚体，E2-E1异质二聚体相互作用以形成在病毒表面发现的刺突。E2形成为切割成E2和E3的、被称为PE2或p62的前体。存在作为E2和E1之间的连接体产生的、被称为6K的小疏水肽。当加工E3-E2-6K-E1多蛋白时，产生E2糖蛋白和E1糖蛋白，其然后形成E2-E1糖蛋白异质二聚体(Strauss和Strauss.497-499页)。用于构建表达E2-E1糖蛋白的减毒rISFV载体的起点是表示为pVSVΔG-CHIKV的质粒，其从JohnRose博士(耶鲁大学)处获得(Chattopadhyay等人.J.Virol.2013,(87):395-402)。在rVSV基因组cDNA中，该质粒包含优化的基孔肯雅E3-E2-6K-E1基因序列(Genscript,Inc.)替代VSVG基因。通过PCR使用以下引物来扩增CHIKV-E3-E2-6K-E1序列：引物Alpha_001：GGGGCCCACTCGAGAACATGAGCCTGGCCATCCCCGTG(含有XhoI位点和Kozak序列)(SEQIDNO:69)引物Alpha_002：61/(含有NotI位点和NheI位点)(SEQIDNO:70)将所得PCR产物用XhoI/NotI限制性酶消化并克隆到rVSVN4CT1载体cDNA中。然后将该载体cDNA扩增并用XhoI/NotI限制性酶消化，将编码CHIKV-E3-E2-6K-E1蛋白的释放插入物克隆到经XhoI/NotI消化的pPBS-ISFV-HIV-015中(在以上实施例2中描述)。然后将编码CHIKV-E3-E2-6K-E1蛋白的重组ISFV(rISFV)从如以上实施例1中描述的该pDNA拯救。结果是从rISFV基因组中的第一位置表达CHIKV-GP的表示为pPBS-ISF-Alpha-003病毒的rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1，其中CHIKV-GP表示CHIKV-E3-E2-6K-E1。将拯救的病毒噬斑纯化，并在VeroE6细胞单层(ATCCCCL-81)上扩增。对于动物研究，通过靠10％蔗糖缓冲的离心将病毒载体从受感染的BHK-21(ATCCCCL-10)细胞上清液纯化。将经纯化的病毒重悬于pH7.0的PBS中，与蔗糖磷酸盐(SP)稳定剂(7毫摩尔的K2HPO4、4mM的KH2PO4、218mM的蔗糖)混合，在乙醇/干冰中快速冷冻，并在-80℃保存备用。进行研究以研究包含从第一位置表达CHIKV-GP的上述rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1载体的免疫原性组合物的安全性和有效性。在其左足垫用1×107pfu的rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1对缺乏1型干扰素受体的编号11至21的小鼠(A129小鼠)进行免疫。右足垫未经注射以作为对照。编号1至10的A129小鼠未经免疫以作为其他对照。将全部21只小鼠在左足垫注射10μl剂量的1×104pfu的CHIKV的LaReunion分离株，并测量肿胀。还测量右足垫高度作为内部对照。在注射当天不采集左足的足垫高度。先前数据显示左右足的尺寸是相同的。如图19所示，用rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1免疫的小鼠11至21号在攻击后维持其体重，而直到攻击后的第4天未免疫的小鼠体重减轻。如图20所示，免疫的小鼠11至21号到第3天有轻微左足垫肿胀，其到第5天复原。相反地，未免疫的小鼠1至10号有左足垫肿胀，其继续增长至第4天。两组小鼠都没有右足垫肿胀。如图21所示，免疫的小鼠11至21号在第1天或第2天没有表现出血液中的病毒血症[低于100pfu/mL的检测极限]。相反地，未免疫的小鼠1至10号在第1天有病毒血症迹象，其到第2天增加至接近1×107pfu/mL。到第3天，全部未免疫的小鼠表现出患病迹象，包括足垫肿胀、皱皮和嗜睡。相反地，全部免疫的小鼠外观和行为正常。如图22显示的，到第5天，全部10只未经免疫的小鼠死于疾病。相反，全部11只免疫的小鼠存活，没有疾病迹象。如表14所示，根据通过免疫后第1天、第7天和第21天采取的血清的噬斑减少中和滴度(PRNT80)确定，用rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKVGP)1免疫的全部小鼠到第21天血清转化(粗体数字表示阳性结果)：表14.在用表达基孔肯雅糖蛋白的rISFV免疫的小鼠中对CHIKV的中和抗体应答。小鼠编号第1天第7天第21天111/201/201/40121/1601/401/80131/201/401/40141/401/201/4015<1/20<1/201/4016<1/201/201/40171/40<1/201/40181/201/201/40191/401/401/80201/3201/801/80211/401/401/40当前第1页1 2 3