修饰的VIP3多肽的制作方法
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相关申请信息
本申请要求于2014年8月29日提交的美国临时专利申请序列号62/043,922的权益和优先权，将其披露特此通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明涉及被修饰为包含异源碳水化合物结合模块的植物杀虫蛋白质(Vip)以及其使用方法。
发明背景
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)是遍存的土壤寄居革兰氏阳性产芽孢细菌。Bt产生蛋白毒素，它们具有口服活性，且对各个昆虫目和种具有高度特异性(K.范弗兰肯胡曾(K.van Frankenhuyzen)，无脊椎动物病理学杂志(J.Invertebr.Pathol.)101,1-16(2009))。因此，从20世纪20年代开始，已将Bt蛋白和产生它们的杆菌用在农业中以用于控制昆虫有害生物(J.洛德(J.Lord)，无脊椎动物病理学杂志89,19-29(2005)。为便于田间施用和靶向不易通过叶面施肥保护的植物组织，从20世纪90年代开始已将选定蛋白质以转基因方式广泛表达于作物中。
Bt产生三类已知的杀虫蛋白毒素：晶体杀虫蛋白质(Cry)、溶细胞杀虫蛋白质(Cyt)和植物杀虫蛋白质(Vip)。Cry蛋白质作为具有微观晶体形态的伴孢胞内包涵体产生。Cyt蛋白质与Cry蛋白质没有序列同源性，但是在芽孢形成期间与包涵体产生的类似。Vip蛋白质是来自Bt的可溶性毒素，它们在细菌的整个植物生命周期内产生(A.布拉沃(A.Bravo)等人，昆虫生物化学与分子生物学(Insect Biochem Mol Biol.)41(7):423-31(2011))。
生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物多肽的苏云金杆菌菌株，已经应用至作物植物中，产生了令人满意的结果，因而提供化学杀有害生物剂的替代物或补充物。转基因植物中Cry蛋白质的表达已经提供了有效的抵抗某些昆虫有害生物的保护，并且表达此类蛋白质的转基因植物已经商业化，允许农民减少或消除化学昆虫控制剂的施用。
Vip3是一类具体的植物杀虫蛋白质，具有抵抗鳞翅目有害生物物种的广谱毒性，且适合转基因植物表达(J.伊斯次(J.Estruch)等人，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)93,5389-94(1996))。第一种含有Vip3的产品是以品牌名称AGRISURE VIPTERATM由先正达(Syngenta)在2011年销售的基因修饰的玉米(还可参见先正达美国专利号7,378,493和7,244,820)。然而，与大量业内评述的关于Cry蛋白质的文献相比，有关Vip3蛋白质的报道相对很少。Vip3蛋白质与Cry或Cyt蛋白质没有同源性。Vip3通过BLAST不与nr蛋白质数据库中的任何其他确认的蛋白质匹配，期望值小于1.0。当前报道的序列指示，与针对Cry蛋白质观察到的变异相比，Vip3蛋白质之间的序列变异极少。
Vip3蛋白质的大小为约88kDa，并在营养生长阶段期间通过芽孢杆菌属(Bacillus)产生并分泌(植物杀虫蛋白质，Vip)。Vip3A蛋白质具有抵抗广谱鳞翅目有害生物的杀虫活性，包括但不限于小地老虎(BCW，小地老虎)、秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、烟草夜蛾(TBW，烟芽夜蛾)和玉米穗虫(CEW，美洲棉铃虫)，但没有抵抗欧洲玉米螟(ECB，玉米螟)的活性。因此，Vip3A蛋白质展现出独特的杀虫活性谱。最近，已发现，表达Vip3A蛋白质的植物能抵抗半翅类昆虫有害生物引起的摄食损伤(美国专利号6,429,360)。已经鉴定出Vip3类蛋白的其他成员(参见例如，WO 03/075655、WO 02/078437、WO 98/18932、WO 98/33991、WO 98/00546和WO 99/57282)。
众多商业上有价值的植物，包括普通的农作物，易受昆虫有害生物的攻击的影响，导致作物产量和品质的实质性降低。例如，玉米(玉蜀黍)的种植者面临着对抗有害生物侵染的主要问题。昆虫，包括鳞翅目以及鞘翅目昆虫，在美国每年破坏估算的15％的农作物并且在发展中国家甚至占更大的百分比。此外，与杂草以及寄生和腐生植物的竞争说明甚至更多的潜在的产量损失。每年，仅在美国，此类有害生物导致在作物损害中超过1000亿美元。
在对抗有害生物侵染的努力中，已经使用了各种方法以减少或消除在特定样地中的有害生物。这些努力包括将玉米与不是用于特定有害生物的宿主的其他作物轮作，并且将杀有害生物剂施用至作物的地上部分，将杀有害生物剂施用至受影响的作物的根系统之中以及周围的土壤。传统地，农民已经非常依赖于化学杀有害生物剂以对抗有害生物损害。
农作物需要替代性杀虫剂。例如，合并了转基因基因(该转基因基因导致玉米植物产生杀虫蛋白质，提供针对目标有害生物的保护)的玉米植物是另一种控制有害生物的途径。因此，仍需要发现新型且有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益。特别需要的是靶向更广谱的经济上重要的昆虫有害生物并具有抵抗昆虫有害生物的高度特异性活性的控制剂，这些有害生物对现有的昆虫控制剂是有抗性的或可以变得有抗性。
发明概述
在一些实施例中，提供包含异源碳水化合物结合模块(CBM)的被修饰的Vip3多肽。在一些方面，异源CBM取代Vip3多肽的结构域III的全部或部分。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽包含Vip3多肽的结构域I和/或结构域II的全部或部分。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽包含Vip3多肽的结构域IV的全部或部分，或可替代地，缺少Vip3多肽的结构域IV的全部或部分。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽具有针对例如昆虫(例如像秋粘虫)的杀生物害虫性。在一些实施例中，如本文描述的修饰的Vip3多肽证实具有针对Vip3抗性秋粘虫菌落(例如像Vip3A抗性秋粘虫菌落)的杀虫活性。
在另一方面，提供组合物，该组合物包含在农业上可接受的载体中的本发明的修饰的Vip3多肽。
在一些实施例中，本发明提供了编码本发明的修饰的Vip3多肽的核酸分子和/或核苷酸序列，以及包含编码本发明的修饰的Vip3多肽的核酸分子和/或核苷酸序列的表达盒和重组载体。
在其他方面，提供了一种来自本发明的转基因种子或转基因植物的提取物，其中该提取物包括本发明的核酸分子和/或被修饰的Vip3多肽。因此，在一些实施例中，提供包含所述提取物的组合物。在另一个实施例中，该组合物可包含在农业上可接受的载体中的所述提取物。
在一些实施例中，提供了一种为农民提供控制植物有害生物的方式的方法，该方法包括为该农民提供植物材料或细菌，所述植物材料或细菌包含编码根据本发明的修饰的Vip3多肽的核酸分子。
在一些方面，提供了一种产生本发明的修饰的Vip3多肽的方法，该方法包括以下步骤：(a)用包含编码修饰的Vip3多肽的核苷酸序列的重组核酸分子转化宿主细胞；并且(b)在宿主细胞表达重组核酸分子的条件下培养步骤(a)的宿主细胞，从而产生该修饰的Vip3多肽。在一些实施例中，提供了一种产生修饰的Vip3多肽的方法，该方法包括用一种核酸分子转化宿主细胞，该核酸分子包含可操作地连接至编码本发明的修饰的Vip3多肽的核苷酸序列的启动子；在允许表达该修饰的Vip3多肽的条件下培养该宿主细胞；并且回收该修饰的Vip3多肽。在一些实施例中，提供了一种产生修饰的Vip3多肽的方法，该方法包括在允许表达该修饰的Vip3多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；并且回收该修饰的Vip3多肽。
在一些实施例中，提供了一种减少转基因植物中由植物有害生物引起的损伤的方法，该方法包括种植包含表达本发明的修饰的Vip3多肽的核酸分子的转基因植物种子，从而减少有害生物对由转基因植物种子培养的转基因植物造成的损伤。
在一些实施例中，本发明提供一种控制有害生物的方法，该方法包括提供本发明的转基因植物，并向植物或种子施用作物保护产品。在一些实施例中，有害生物是秋粘虫。
在一些实施例中，提供一种控制有害生物的方法，该方法包括使有害生物接触杀有害生物有效量的本发明组合物。在一些实施例中，提供一种保护植物和/或植物繁殖材料的方法，该方法包括使该植物和/或植物繁殖材料接触有效量的本发明组合物。在一些实施例中，该方法包括一种控制秋粘虫菌落的方法。
在其他方面，提供了一种提高植物、植物部分或植物细胞中的杀有害生物活性的方法，该方法包括将编码本发明的一种或多种修饰的Vip3多肽的一种或多种核酸分子引入植物、植物部分或植物细胞中，以产生表达该一种或多种核酸分子的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中该一种或多种核酸分子编码包含杀有害生物活性的多肽，从而相比于对照增加转基因植物、植物部分或植物细胞中的杀有害生物活性。
在一些实施例中，如本文所述的修饰的Vip3多肽和/或组合物具有对抗Vip3抗性秋粘虫菌落(例如像Vip3A抗性秋粘虫菌落)的活性和/或杀虫性。
在一些实施例中，提供了包含编码本发明的修饰的Vip3多肽的核酸分子和/或核苷酸序列的转基因宿主细胞(包括细菌和植物细胞)、植物和植物细胞(包括种子)，以及由此产生的作物、和经收获和加工的产物。
在下文本发明的描述中更详细地阐述本发明的这些方面和其他方面。
附图简要说明
图1示出表达各种Vip3D结构域III CBM交换的经裂解大肠杆菌的可溶部分的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶。分析的样品在表1中，从左往右为：分子量梯阶、1OF3、1PMH、1WKY、2BGP、2ZEZ、CenC、gp21、PsHGF7。
图2示出CBM结构的带状图。顶部行从左往右：Vip3D结构域III、2ZEZ、2BGP。中间行：1OF3、2ZEX、1PMH。底部：1WKY。示出钙(描绘成球体)。共晶体结构的糖配体示出于它们的结合沟槽中(棒状结构)。多肽链上的克隆接合点被指示为棒状物。
图3示出基于与2ZEX的氨基酸序列相似性进行的三种结构域交换的序列对比。这些序列具有84％共有性和8％一致性。
图4示出诱导的Vip3A-CBM嵌合体的可溶性大肠杆菌粗提物的十二烷基硫酸钠(SDS)PAGE凝胶(泳道号在括号中)：Vip3A(1)、2ZEX(2)、2ZEZ(3)、1OFE(4)、1PMH(5)、2GBP(6)、CENC(7)、GP21(8)和PSHGF7(9)
图5A-5C示出Vip3中的CBM取代的示意图。图5A示出氨基酸残基541和668被标记的Vip3D P021序列的一部分，以及Vip3D P021氨基酸残基542至667与2ZEX CBM和2ZEZ CBM的交换；图5B示出Vip3D P021氨基酸残基542至667与10FE CBM、1PMH CBM和2BGP CBM的交换；图5C示出Vip3D P021氨基酸残基542至667与GP21CBM、CENC CBM、PsHGF7CBM或1WKY CBM的交换。
序列表的序列的简要说明
SEQ ID NO:1是Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是Vip3的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是P021的氨基酸序列(10His-Vip3D-AAPF)。
SEQ ID NO:7是其中结构域III交换为2ZEX的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是其中结构域III交换为2ZEZ的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是其中结构域III交换为10FE的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是其中结构域III交换为1PMH的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是其中结构域III交换为2BGP的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是其中结构域III交换为GP21的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是其中结构域III交换为CenC的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是其中结构域III交换为PSHGF7的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是其中结构域III交换为1WKY的P021的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是其中结构域III交换为2ZEX的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是其中结构域III交换为2ZEZ的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是其中结构域III交换为10FE的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是其中结构域III交换为1PMH的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是其中结构域III交换为2BGP的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是其中结构域III交换为gp21的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是其中结构域III交换为CenC的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是其中结构域III交换为PsHGF7的Vip3A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是2ZEX结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是2ZEZ结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是10FE结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是1PMH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是2BGP结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是gp21结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是CenC结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是PsHGF7结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是1WKY结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是其中结构域III交换为2ZEX的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是其中结构域III交换为2ZEZ的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是其中结构域III交换为10FE的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是其中结构域III交换为1PMH的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是其中结构域III交换为2BGP的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是其中结构域III交换为GP21的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是其中结构域III交换为CenC的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是其中结构域III交换为PSHGF7的Vip3D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是其中结构域III交换为2ZEX的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是其中结构域III交换为2ZEZ的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是其中结构域III交换为10FE的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是其中结构域III交换为1PMH的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45是其中结构域III交换为2BGP的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46是其中结构域III交换为GP21的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是其中结构域III交换为CenC的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是其中结构域III交换为PSHGF7的Vip3B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是其中结构域III交换为2ZEX的Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50是其中结构域III交换为2ZEZ的Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是其中结构域III交换为10FE的Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52是其中结构域III交换为1PMH的Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是其中结构域III交换为2BGP的Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54是其中结构域III交换为GP21的Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55是其中结构域III交换为CenC的Vip3C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56是其中结构域III交换为PSHGF7的Vip3C的氨基酸序列。
详细说明
现在将参考在其中展示本发明的实施例的附图和实例在下文中描述本发明。本说明不旨在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入一些实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。另外，鉴于本披露内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，在此所使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此的本发明的说明中使用的术语仅仅是出于描述具体实施例的目的并且不旨在限制本发明。
在此引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文结合在此。
除非上下文另外表明，明确地预期的是本文所述的本发明的不同特征可以按任何组合使用。而且，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，本文提出的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果该说明书陈述包含组分A、B和C的组合物，它明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。
如在本发明的说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外表明。
还如本文使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及所有所有可能组合，连同当以替代方案(“或”)解释时组合的缺乏。
如本文使用的术语“约”当是指一个可测量的值如剂量或时间段等时是指±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、或甚至±0.1％的指定量的变化。
如本文使用，短语例如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”应该理解为包括X和Y。如本文使用，短语例如“在约X和Y之间”是指“在约X和约Y”之间，并且短语例如“从约X至Y”是指“从约X至约Y”。
如本文使用，术语“包括(comprise、comprises和comprising)”指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、和/或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。
如本文使用的，过渡短语“基本上由……组成”意指一项权利要求的范围将被解释为包括该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的一个或多个基本特征和新特征的那些材料或步骤。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在被解释为等同于“包括(comprising)”。
如本文使用，“嵌合的”是指其中至少两种组分衍生自不同来源(例如，不同有机体、不同编码区域)的核酸分子或多肽。
如本文使用的“互补”可意指与比较核苷酸序列具有100％互补性，或者可指小于100％互补性(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等的互补性)。
如本文使用的，术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”是指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配对发生天然结合。例如，序列“A-G-T”结合至互补序列“T-C-A”。两单链分子之间的互补性可以是“部分的(partial)”，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。
如本文使用，“接触”(“contact”、“contacting”、“contacted”)和它们的语法变型是指将期望反应的组分一起放在适合实施该期望反应(例如，整合、转化、定点裂解(切割、裂解)、扩增、感兴趣的多肽的定点靶向等)的条件下。本领域中熟知实施此类反应的方法和条件(参见例如，加西乌纳斯(Gasiunas)等人(2012)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)109:E2579-E2586；M.R.格林(M.R.Green)和J.萨姆布鲁克(J.Sambrook)(2012)分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)第4版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约州)。
“控制”有机体(例如，昆虫有害生物)指通过毒性作用抑制有机体(例如，昆虫有害生物)存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力或者限制作物植物中与有机体活动有关的损害或损失。“控制”有机体可以是或可以不是意指杀死有机体，尽管它优选意指杀死有机体。
“杀有害生物有效量”、“有效有害生物控制量”或“有效昆虫控制量”分别意指多肽通过毒性作用抑制有害生物或昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力的，或限制有害生物或昆虫相关的损害或作物植物损失的浓度或量。“杀有害生物有效量”、“有效有害生物控制量”或“有效昆虫控制量”可以是或可以不是分别意指杀死有害生物或昆虫，尽管它优选意指杀死有害生物或昆虫。
如本文使用的“杀有害生物”、“杀虫”等是指修饰的Vip3多肽控制有害生物有机体的能力，或者可以控制如在本文所定义的有害生物有机体的修饰的Vip3多肽的量。因此，杀有害生物的修饰的Vip3多肽可以杀死或抑制有害生物有机体(例如，昆虫有害生物)存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽可以是杀有害生物的或杀虫的。
本发明的核苷酸序列或氨基酸序列的“片段”或“部分”将理解为指相对于参考核酸、核苷酸序列或氨基酸序列而言长度减少(例如，减少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸)，且包含与该参考核酸、核苷酸序列或氨基酸序列一致或几乎一致的(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致的)连续核苷酸的核苷酸序列组成的核苷酸或氨基酸序列、基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明，在适宜的情况下，这种片段或部分可以包含于它作为组分的较大多核苷酸或多肽内。
因此，例如，Vip3多肽的片段可用于实施本发明的一些实施例。在一些实施例中，术语“Vip3多肽”是指Vip3多肽的全长和部分或片段。一般来讲，此类片段的长度为至少20或30个连续氨基酸残基。在一些实施例中，Vip3多肽的片段的长度可为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575或更多个连续氨基酸残基。在一些实施例中，Vip3多肽的片段的长度可小于约20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575或更多个连续氨基酸残基。该片段可包含Vip3多肽结构域I、结构域II、结构域III和/或结构域IV中的至少一个、两个、三个或四个，任选地具有1、2、3、5、7、10、12、20、30、40、50、100或更多个另外的连续N-端和/或C-端氨基酸残基。Vip3片段可包含结构域I、II、III或IV中的全部或部分。片段的长度(即，连续氨基酸残基的数量)可为全长Vip3多肽的约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。该片段可包含与Vip3多肽的相应部分一致或几乎一致(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致)的连续氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成和/或由其组成。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽可包含Vip3多肽的至少两个片段。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽可包含Vip3多肽的第一片段和第二片段，其中所述第一片段可包含约100个氨基酸残基至约600个氨基酸残基、及其中的任何数值或范围，且所述第二片段可包含约100至约300个氨基酸残基、及其中的任何数值或范围。
在一些实施例中，碳水化合物结合模块(CBM)的片段可用于实施本发明的一些实施例。在一些实施例中，术语“碳水化合物结合模块”(CBM)是指全长CBM以及CBM的部分或片段。一般来讲，此类片段的长度为至少50个连续氨基酸残基。在一些实施例中，CBM的片段的长度可为至少约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多个连续氨基酸残基。在一些实施例中，CBM多肽的片段的长度可小于约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575或更多个连续氨基酸残基。该片段可任选地包含1、2、3、5、7、10、12、20、30、40、50、100或更多个另外的连续N-端和/或C-端氨基酸残基。片段的长度(即，连续氨基酸残基的数量)可为全长CBM的约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。该片段可包含与来自碳水化合物活性酶的CBM相同或几乎一致(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致)的连续氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成和/或由其组成。
任选地，CBM片段包含金属结合结构域(和/或任何其他已知的功能结构域)。
在一些实施例中，CBM片段可包含具有N和/或C端截短的CBM，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，CBM可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸残基等或其中任何范围或变数的C-端截短。在一些实施例中，CBM可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸残基等或其中任何范围或变数的N-端截短。在一些实施例中，本发明可使用的CBM可以是在N-末端和C-末端均截短。
如本文使用的，术语“基因”指能够用来产生mRNA、反义RNA、miRNA、抗-微RNA反义寡脱氧核苷酸(AMO)等的核酸分子。基因可以能或不能使用来产生功能蛋白或基因产物。基因可以包括编码区域与非编码的区域(例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5’以及3’非翻译区域)。基因可以是“分离”的，其意指一种核酸，该核酸基本上或实质上不含正常情况下与天然状态下的该核酸结合的组分。此类组分包括其他细胞物质、来自重组生产的培养基和/或在化学合成所述核酸时所用的各种化学品。
“异源”或“重组”核苷酸序列是不与引入它的宿主细胞天然关联的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多个拷贝和以非天然存在形式(例如，可操作地连接至并非与该核苷酸序列一起天然存在的一种或多种调节序列)引入宿主细胞中的核苷酸序列。
具有同源性的不同核酸或蛋白质在此被称作“同源物”。术语同源物包括来自相同物种和不同物种的同源序列以及来自相同物种和不同物种的直向同源序列。“同源性”是指就位置一致性(即，序列相似性或一致性)百分比而言，两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性或一致性水平。同源性也是指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法可包括本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。如在此使用的“直向同源”是指在物种形成过程中由共同的祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的核苷酸序列的同源物与本发明的所述核苷酸序列具有实质序列一致性(例如，至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％)。因此，例如，本发明可使用的CBM的同源物可与本文提供的任一CBM序列具有至少约70％同源性或更高同源性，其中CBM序列同源物具有结合一种或多种碳水化合物的功能。在一些实施例中，CBM序列同源物具有结合纤维素和/或葡甘露聚糖的功能。在一些实施例中，CBM序列同源物具有内在地结合到聚糖链上的功能。在一些实施例中，本发明可使用的Vip3多肽的同源物可与本文提供的任一Vip3多肽序列具有约70％同源性或更高同源性，其中该同源物具有杀有害生物活性。
因此，Vip3多肽的同源物包括但不限于：(1)序列水平上与同样保留杀有害生物活性的Vip3类多肽的成员至少约70％至至少约90％(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)一致的多肽；(2)与以免疫学方式识别Vip3类多肽的成员的抗体具有交叉反应性的多肽，(3)与Vip3类多肽的成员的受体具有交叉反应性且保留杀有害生物活性的多肽，和(4)序列水平上与Vip3类多肽的成员的毒性核心区域至少约70％至至少约90％(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)一致、同时还保留杀有害生物活性的多肽。Vip3同源物已经披露在WO 98/18932、WO 98/33991、WO 98/00546和WO 99/57282中。图1中提供Vip3A与Vip3D多肽的比对，且示出二级结构的实质相似性。
因此，在本发明的一些实施例中，这些多肽在序列水平上与Vip3类多肽的成员和/或Vip3类多肽的成员的毒性核心区域是至少70％一致的，同时还保留杀有害生物活性。在本发明的一些实施例中，这些多肽在序列水平上与Vip3类多肽的成员和/或Vip3类多肽的成员的毒性核心区域是至少80％一致的，同时还保留杀有害生物活性。在一些实施例中，这些多肽在序列水平上与Vip3类多肽的成员和/或Vip3类多肽的成员的毒性核心区域是至少90％一致的，同时还保留杀有害生物活性。
如本文使用，杂交(hybridization、hybridize、hybridizing)和它的语法变型是指两个完全互补的核苷酸序列或其中存在一些错配碱基对的基本上互补的序列的结合。杂交条件是本领域中所熟知的，且根据核苷酸序列的长度和核苷酸序列间的互补程度变化。在一些实施例中，杂交条件可以是高严格的，或者可以是中严格或低严格的，这取决于互补的量和待杂交的序列的长度。构成用于核苷酸序列之间杂交目的的低、中和高严格的条件是本领域内所熟知的(参见例如，加西乌纳斯等人(2012)美国国家科学院院刊109:E2579-E2586；M.R.格林和J.萨姆布鲁克(2012)分子克隆：实验手册第4版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)。
如本文使用，术语“增加”(increase、increasing、increased)、“增强”(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)(以及它们的语法变型)描述如与对照相比至少约25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的提高。
“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指一种天然存在的或內源性的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型Vip3”是天然存在于有机体中的或对有机体来说是內源性的Vip3。
相比之下，“异源”核酸或多肽是不与引入它的宿主细胞天然关联，或以并非天然见于引入它的细胞中的形式引入的核酸或多肽。
还如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指线状或分支、单链或双连的RNA或DNA，或其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。当合成地产生dsRNA时，较少见的碱基，如肌苷，5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其他也可以用于反义、dsRNA和核酶配对作用。例如，已经显示含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA并且是基因表达的强力反义抑制剂。也可以作出其他修饰，如修饰磷酸二酯主链或RNA的核糖基团中的2’-羟基。本披露的核酸构建体可以是DNA或RNA，但优选地为DNA。因此，虽然本发明的核酸构建体可以按DNA形式描述和使用(这取决于预期用途)，但它们也可以以RNA形式描述和使用。
如本文使用，“合成”核酸或核苷酸序列是指在自然界中未发现，但通过人工构建且因此并非天然产物的核酸或核苷酸序列。
如本文使用，术语“核苷酸序列”指一种核苷酸异聚体或来自一种核酸分子的5’至3’端的这些核苷酸的序列并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成(例如，化学合成)DNA、质粒DNA、mRNA以及反义RNA，其中的任一项都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”也在本文中可互换用来指核苷酸的杂聚物。除另外说明以外，本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在此以5’至3’方向从左至右呈现，并且使用代表核苷酸字符的标准代码表示，如美国序列规则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所述。如本文使用，“5’区域”可指最接近5’端的多核苷酸区域。因此，例如，多核苷酸的5”区域中的元件可位于从位于多核苷酸的5’端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何地方。如本文使用，“3’区域”可指最接近3’端的多核苷酸区域。因此，例如，多核苷酸的3’区域中的元件可位于从位于多核苷酸的3’端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何地方。如在此使用的，术语“序列一致性百分比”或“一致性百分比”是指在最佳比对两个序列时，与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中的相同核苷酸的百分比。在一些实施例中，“一致性百分比”可以是指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
如本文使用，术语“修饰”(modify、modifying和/或modification)(以及它们的语法变型)，就Vip3多肽和编码这些Vip3多肽的多核苷酸而言是指改变野生型或参考Vip3多肽以及其相应核苷酸序列，以包括异源碳水化合物结合模块。在一些实施例中，所产生的修饰的Vip3多肽的毒性相对于野生型或参考Vip3多肽的毒性有所变化。“毒性的变化”包括但不限于关于任何具体靶有机体的毒性增加和/或减小，和/或靶向的一种或多种有机体中的变化(例如，修饰的Vip3多肽现在相比于野生型或参考Vip3多肽具有针对一种或多种另外的有机体的杀有害生物性)，包括最大活性的变化、LC50的变化和/或达到毒性的时间变化。
如本文使用，术语“减少”(reduce、reduced、reducing、reduction)、“减小”、“抑制”和“降低”(以及它们的语法变型)描述例如与对照相比降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％等、或其中的任何数值或范围。在一些实施例中，减少可导致无或基本上无(即不显著量，例如少于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。因此，在一些实施例中，包含表达修饰的Vip3多肽的核酸分子的转基因植物可相比于对照(例如，不含表达该修饰的Vip3多肽的所述核酸分子的植物)减少植物有害生物引起的损伤至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％等、或其中的任何数值或范围。
如在此使用，“一个或多个调节序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)，影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列包括但不限于，启动子、增强子、外显子、内含子、翻译前导序列、终止信号、以及多腺苷酸化信号序列。调节序列包括自然序列以及合成序列、连同可以是合成序列与自然序列的组合的多个序列。“增强子”是一个核苷酸序列，它可以刺激启动子的活性，并且可以是该启动子或插入的异源元件的一个固有元件以增强启动子的水平或组织特异性。一级序列可以存在于双链DNA分子中的任一个链上，并且甚至当放置在启动子的上游或下游时能够发挥功能。术语“启动子”的意思可以包括“启动子调节序列”。
如在此使用的“序列一致性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口内不变的程度。“一致性”可通过已知方法简单计算，这些方法包括但不限于描述在以下文献中的那些：计算分子生物学(Computational Molecular Biology)(莱斯克,A.M.(Lesk,A.M.)编)牛津大学出版社，纽约(1988)；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)(史密斯,D.W.(Smith,D.W.)编)学术出版社，纽约(1993)；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data),第I部分(格里芬,A.M.(Griffin,A.M.)和格里芬,H.G.(Griffin,H.G.)编)胡马纳出版社，新泽西(1994)；分子生物学的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)(冯海因里奇G.(von Heinje,G.)编)学术出版社(1987)；和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)(格博斯科夫M.(Gribskov,M.)和德弗罗J.(Devereux,J.)编)斯托克顿出版社，纽约(1991)。
如本文使用的，在两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白质序列背景下的短语“实质上一致”或“实质上一致性”是指当比较并比对最大对应性时具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、和/或100％核苷酸或氨基酸残基一致性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。在本发明的一些实施例中，在至少约50个残基至约750个残基长度的序列区域上存在实质上一致性。因此，在一些实施例中，在至少约50个残基至约250个残基长度、约75个残基至约225个残基长度、约100个残基至约200个残基长度、约125个残基至约175个残基长度、约200个残基至约400个残基长度、约300个残基至约450个残基长度、约400个残基至约500个残基长度、约500个残基至约550个残基长度、约550个残基至约650个残基长度、和/或约650个残基至约750个残基长度、或其中任何值或范围的序列区域上存在实质上一致性。
对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用一种序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(若有必要，则指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，这种序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参考序列的序列一致性百分比。
用于比对一个比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员所熟知的并且可以由以下工具实施：如史密斯和沃特曼(Waterman)的局部同源性算法、尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)的同源性比对算法、皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)的相似性搜索方法，并且任选地由这些算法的计算机化实现方式来实施，如作为Wisconsin(材料科学软件公司(Accelrys Inc.),圣地亚哥(San Diego),加利福尼亚州)的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。测试序列和参考序列的已比对区段的“一致性分数”是由两个已比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即，完整的参考序列或参考序列的更小限定部分)中组分的总数目。序列一致性百分比被表示为一致性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是相对于全长多核苷酸序列或其一部分，或相对于较长的多核苷酸序列。出于本发明的目的，也可以使用针对翻译的核苷酸序列的2.0版BLASTX和针对多核苷酸序列的2.0版BLASTN测定“一致性百分比”。
用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开地获得。这种算法涉及首先通过识别查询序列中具有长度W的短词而识别得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库的序列中具有相同长度的一个词(word)进行比对时匹配或满足某个阳性值的阈值分值T。T被称为邻近字码得分阈值(阿尔丘尔(Altschul)等人，1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现包含它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算该累积得分。当累积的比对得分从它所达到的最大值降低了数量X，由于一个或多个负得分的残基比对使的积累使累积的得分降至0或0以下时，这些词的命中记录在每个方向的延伸停止，或者到达了各自序列的末端。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了该比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认设置(参见赫尼科夫(Henikoff)&赫尼科夫(Henikoff),美国国家科学院院刊89:10915(1989))。
除了计算百分比序列一致性之外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性或一致性统计分析(参见例如，卡林(Karlin)&阿尔丘尔(Altschul),美国国家科学院院刊90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性或一致性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生一个匹配的概率的一个指示。例如，如果在一个测试核苷酸序列与一个参考核苷酸序列的比较中的最小概率总和是小于约0.1至小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相似的。因此，在本发明的一些实施例中，在测试核苷酸序列与参考核苷酸序列的比较中的最小概率总和是小于约0.001。
当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时这两个核苷酸序列也可以被认为是基本上互补的。在一些实施例中，被认为基本上互补的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。
在核酸杂交实验(如DNA和RNA杂交)的背景下“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见于蒂森(Tijssen)的生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第2章第I部分“杂交原理和核酸探针测定策略综述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)”,爱思唯尔(Elsevier),纽约(1993)。总体上，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。
Tm是50％的目标序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。极严格条件被选定为等于具体探针的Tm。用于互补核苷酸序列(它们在DNA或RNA印迹中在滤器上具有超过100个互补残基)的杂交的严格杂交条件的一个实例是在42℃下含有1mg肝素的50％甲酰胺，其中杂交是进行过夜的。高严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃下以0.2x SSC洗涤15分钟(参见萨姆布鲁克，以下针对SSC缓冲液的说明)。经常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的中严格洗涤的一个实例是在45℃下以1x SSC进行15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的一个实例是在40℃下以4﹣6x SSC进行15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度典型地是至少约30℃。还可以通过加入去稳定剂(如甲酰胺)来实现严格条件。一般而言，在特定的杂交测定中相比于不相关的探针观察到的高出2倍(或更高)的信噪比表明检测到一个特定杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核苷酸序列所编码的蛋白质是实质上一致的，则这些核苷酸序列仍然是实质上一致的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性来生成核苷酸序列的一个拷贝时，这种情况可能发生。
以下是可以用于克隆同源核苷酸序列的杂交/洗涤条件的设置的例子，这些同源核苷酸序列是与本发明的参考核苷酸序列实质上一致的。在一个实施例中，一个参考核苷酸序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中与该“测试”核苷酸序列杂交，同时在50℃下在2X SSC、0.1％SDS中洗涤。在一些实施例中，该参考核苷酸序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中与该“测试”核苷酸序列杂交，同时在50℃下在1X SSC、0.1％SDS中洗涤；或者在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，同时在50℃下在0.5X SSC、0.1％SDS中洗涤。在一些实施例中，该参考核苷酸序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中与该“测试”核苷酸序列杂交，同时在50℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤；或者在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，同时在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤。
本发明的任何核苷酸序列和/或重组核酸分子可经过密码子优化以在感兴趣的任何物种中表达。密码子优化在本领域中是已知的并且涉及针对密码子使用偏好性使用种特异性密码子使用表来修饰核苷酸序列。基于感兴趣物种的最高度表达的基因的序列分析而产生了密码子使用表。当核苷酸序列在核中表达时，基于感兴趣物种的高度表达的核基因的序列分析而产生了密码子使用表。通过将种特异性的密码子使用表与在天然的多核苷酸序列中存在的密码子比较，确定核苷酸序列的修饰。如本领域中所理解的，核苷酸序列的密码子优化产生与天然核苷酸序列具有小于100％一致性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、等)的核苷酸序列，但是该核苷酸序列仍然编码与由原始的天然核苷酸序列编码的多肽具有相同功能的多肽。因此，在本发明的一些实施例中，本发明的核苷酸序列和/或重组核酸分子可以针对在具体感兴趣的物种(例如，植物如玉米、大豆、甘蔗、甜菜、水稻或小麦)中表达进行密码子优化。
在一些实施例中，本发明的这些重组核酸分子、核苷酸序列以及多肽是“分离的”。“分离的”核酸分子、“分离的”核苷酸序列或“分离的”多肽是通过人工从其天然环境中分开而存在的一种核酸分子、核苷酸序列或多肽并因此不是自然产物。分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可以纯化形式存在，即与天然存在的有机体或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与该多核苷酸有关的其他多肽或核酸)至少部分地分开。在一些实施例中，分离的核酸分子、分离的核苷酸序列和/或分离的多肽是至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更大纯度的。
在一些实施例中，分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可以存在于非天然环境中，例如像重组宿主细胞。因此，例如，就核苷酸序列而言，术语“分离的”意指它从其天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出来。如果将一种多核苷酸从其天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出并且然后将其插入它并不天然存在于其中的遗传背景、染色体、和/或细胞(例如，不同的宿主细胞、不同的调节序列、和/或与自然中发现的不同的基因组位置)中，则该多核苷酸也是被分离的。因此，这些重组核酸分子、核苷酸序列以及它们所编码的多肽是“分离的”，因为它们通过人工方式从其天然环境中分开而存在并因此不是自然产物，然而，在一些实施例中，它们可以被引入到一个重组宿主细胞中并存在于该重组宿主细胞中。
在本文描述的任一实施例中，本发明的核苷酸序列和/或重组核酸分子可以与多种启动子和其他调节元件可操作地关联以用于在各种有机体的细胞中表达。因此，在一些实施例中，本发明的重组核酸可进一步包含一种或多种可操作地连接至一种或多种核苷酸序列的启动子。
如此处使用的“可操作地连接”或“可操作地关联”意指所指定的元件是彼此功能上相关的，并且还通常是物理相关的。因此，如此处使用的术语“可操作地连接的”或“可操作地关联的”是指在功能上关联的一个单一核酸分子上的核苷酸序列。因此，可操作地连接至一个第二核苷酸序列的一个第一核苷酸序列是指当该第一核苷酸序列被放入与该第二核苷酸序列的功能关系中时的情况。例如，如果启动子影响核苷酸序列的转录或表达，则该启动子与所述核苷酸序列可操作地关联。本领域普通技术人员将理解，控制序列(例如启动子)不需要和与其可操作地关联的核苷酸序列邻接，只要该控制序列能发挥指导其表达的功能。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以存在于启动子与核苷酸序列之间，并且该启动子仍可以被认为“可操作地连接到”该核苷酸序列上。
“启动子”是控制或调节与该启动子可操作地相关联的核苷酸序列(即编码序列)的转录的核苷酸序列。典型地，“启动子”是指包含针对RNA聚合酶II的结合部位并指导转录的起始的核苷酸序列。一般而言，启动子发现于相对于相应的编码序列的编码区域的开始的5’或上游。启动子区域可包括充当基因表达的调节物的多个其他的元件。这些包括TATA盒共有序列以及常常CAAT盒共有序列(布莱斯纳奇(Breathnach)和尚邦(Chambon),(1981)生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem).50:349)。在植物中，该CAAT盒可由AGGA盒取代(梅辛(Messing)等人,(1983)于植物的基因工程(Genetic Engineering of Plants),T.小菅(Kosuge),C.梅雷迪思(Meredith)和A.霍尔安德尔(Hollaender)(编辑),普利纳姆出版社(Plenum Press),第211-227页)。
可在植物细胞或细菌中用于起始转录的任何启动子都可用于本发明的表达盒中。启动子可以包括例如用于在重组核酸分子(即“嵌合基因”或“嵌合多核苷酸”)的制备中使用的组成型、可诱导型、时间调节型、发育调节型、化学调节型、组织优选型和/或组织特异型启动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。
启动子的选择将依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于有待转化的宿主细胞(例如，植物或细菌)而变化。许多不同有机体的启动子是本领域中所熟知的。基于本领域中存在的大量知识，可针对感兴趣的特定宿主有机体选择适当的启动子。因此，例如，关于模型有机体中的高度组成型表达的基因上游的启动子的知之甚多，且可容易获得此类知识并适当地应用在其他系统中。
另外，例如，编码本发明的修饰的Vip3多肽的异源多核苷酸可在任何植物、植物部分(例如，叶子、茎杆或茎、穗、花序(例如，穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、根、种子和/或幼苗等)、植物细胞或细菌细胞中表达。例如，在需要在特定组织或器官中表达的多细胞有机体如植物的情况下，可以使用组织特异性或组织优选的启动子(例如，根特异性/优选的启动子)。相比之下，在希望响应刺激而表达的情况下，可以使用可由刺激或化学物诱导的启动子。在一些实施例中，寻求针对多于一类昆虫有害生物的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。在希望在有机体的所有细胞或组织中以相对恒定水平连续表达的情况下，可以选择组成型启动子。
因此，适用于本发明的启动子包括但不限于组成性地驱动核苷酸序列的表达的那些启动子、在诱导时驱动表达的那些启动子、以及以组织或发育特异性或优选的方式驱动表达的那些启动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。可从待转化的植物、酵母或细菌鉴定并分离启动子，然后插入待用于植物、酵母或细菌的转化的表达盒中。
启动子的非限制性实例包括RubisCo小亚基基因1的启动子(PrbcS1)、肌动蛋白基因的启动子(Pactin)、硝酸还原酶基因的启动子(Pnr)和双拷贝碳酸酐酶基因1的启动子(Pdca1)(参见沃克等人，植物细胞报告(Plant Cell Rep.)23:727-735(2005)；李(Li)等人，基因(Gene)403:132-142(2007)；李(Li)等人，分子生物学报告(Mol Biol.Rep.)37:1143-1154(2010)。PrbcS1和Pactin是组成型启动子，且Pnr和Pdca1是诱导型启动子。Pnr被硝酸盐诱导，且被铵抑制(李(Li)等人，基因403:132-142(2007))，且Pdca1被盐诱导(Li等人，分子生物学报告37:1143-1154(2010))。
可用于植物的组成型启动子的实例包括但不限于夜香树病毒(cestrum virus)启动子(cmp)(美国专利号7,166,770)、稻肌动蛋白1启动子(王(Wang)等人，(1992)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)12；3399-3406；以及美国专利号5,641,876)、CaMV 35S启动子(奥德尔(Odell)等人，(1985)自然(Nature)313:810-812)、CaMV 19S启动子(劳顿(Lawton)等人，(1987)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)9:315-324)、nos启动子(埃伯特(Ebert)等人，(1987)美国国家科学院院刊84:5745-5749)、Adh启动子(沃克等人，(1987)美国国家科学院院刊84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(杨和拉塞尔(Yang&Russell)(1990)美国国家科学院院刊87:4144-4148)和泛素启动子。源于泛素的组成型启动子积累在很多细胞类型中。已经从几种植物物种中克隆出泛素启动子以用在转基因植物中使用，例如，向日葵(比奈(Binet)等人，1991.植物科学(Plant Science)79:87-94)、玉米(克里斯坦森(Christensen)等人，1989.植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)12:619-632)和拟南芥(诺里斯(Norris)等人，1993.植物分子生物学21，895-906)。玉蜀黍泛素启动子(UbiP)已经在转基因单子叶植物系统中得以发展，并且它的序列以及构建用于单子叶植物转化的载体披露于专利公开EP 0 342 926中。泛素启动子适用于本发明的核苷酸序列在转基因植物(尤其是单子叶植物)中的表达。此外，由麦克尔罗伊(McElroy)等人(分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)231:150-160(1991))描述的启动子表达盒可容易被修饰以用于本发明的核苷酸序列的表达并且特别适用于在单子叶植物宿主中使用。
在一些实施例中，可将组织特异性/组织优选的启动子用在植物细胞中表达异源多核苷酸。组织特异性或优选的表达模式包括但不限于绿色组织特异性或优选的、根特异性或优选的、茎特异性或优选的、以及花特异性或优选的。适用于在绿色组织中表达的启动子包括调节涉及光合作用的基因的许多启动子，并且这些中的许多已经从单子叶植物和双子叶植物两者中得以克隆。在一个实施例中，可用于本发明的一种启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉蜀黍PEPC启动子(哈得斯佩斯(Hudspeth)和格鲁拉(Grula)，植物分子生物学12:579-589(1989))。组织特异性启动子的非限制性实例包括与编码种子贮藏蛋白(如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白以及菜豆素)、玉米蛋白或油体蛋白(如油质蛋白)、或脂肪酸生物合成中涉及的蛋白质(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶、以及脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因关联以及与胚发育过程中表达的其他核酸(如Bce4，参见，例如克里德(Kridl)等人(1991)种子科学研究(Seed Sci.Res.)1:209-219；连同欧洲专利号255378)关联的那些启动子。适用于本发明的核苷酸序列在植物(特别是玉蜀黍)中表达的组织特异性或组织优先的启动子包括但不限于直接在根、髓、叶或花粉中表达的那些启动子。此类启动子披露于例如WO 93/07278中，通过引用以其全文结合在此。可用于本发明的组织特异性或组织优选的启动子的其他非限制性实例，披露在美国专利6,040,504中的棉花核酮糖二磷酸羧化酶启动子；披露在美国专利5,604,121中的稻蔗糖合酶启动子；德富拉蒙德(de Framond)描述的根特异性启动子(FEBS 290:103-106(1991)；隶属汽巴-嘉基(Ciba-Geigy)的EP 0 452 269)；描述在美国专利5,625,136(隶属汽巴-嘉基)中且驱动玉米trpA基因表达的茎特异性启动子；和披露在WO 01/73087中的夜香树黄叶卷曲病毒启动子。
植物组织特异性/组织优选的启动子的其他实例包括但不限于根毛特异性顺式-元件(RHE)(金姆(Kim)等人.植物细胞18:2958-2970(2006))、根特异性启动子RCc3(郑(Jeong)等人，植物生理学(Plant Physiol.)153:185-197(2010))和RB7(美国专利号5459252)、凝集素启动子(林德斯特伦(Lindstrom)等人，(1990)Der.Genet.11:160-167；和沃德金(Vodkin)(1983)临床生物研究进展(Prog.Clin.Biol.Res.)138:87-98)、玉米乙醇脱氢酶1启动子(丹尼斯(Dennis)等人，(1984)核酸研究12:3983-4000)、S-腺苷基-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(范德米金斯布鲁格(Vander Mijnsbrugge)等人，(1996)植物和细胞生理学((Plant and Cell Physiology),37(8):1108-1115)、玉米集光复合体启动子(班赛尔(Bansal)等人，(1992)美国国家科学院院刊89:3654-3658)、玉米热激蛋白启动子(欧戴尔(O'Dell)等人，(1985)EMBO J.5:451-458；和罗彻斯特(Rochester)等人，(1986)EMBO J.5:451-458)、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(卡什莫尔(Cashmore)，“编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基的核基因(Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase)”第29-39页于植物基因工程(Genetic Engineering of Plants)中(霍兰德(Hollaender)编，普莱南出版社(Plenum Press)1983；和波尔森(Poulsen)等人，(1986)分子遗传学与普通遗传学)205:193-200)、Ti质粒甘露氨酸合酶启动子(兰格里奇(Langridge)等人，(1989)美国国家科学院院刊86:3219-3223)、Ti质粒胭脂碱合酶启动子(兰格里奇等人，(1989)，同上)、矮牵牛查尔酮异构酶启动子(范屯恩(van Tunen)等人，(1988)EMBO J.7:1257-1263)、菜豆富甘氨酸蛋白1启动子(Keller等人，(1989)基因与发育(Genes Dev.)3:1639-1646)、截短CaMV 35S启动子(欧戴尔等人，(1985)自然(Nature)313:810-812)、马铃薯糖蛋白启动子(文茨勒(Wenzler)等人，(1989)植物分子生物学13:347-354)、根细胞启动子(山本(Yamamoto)等人.(1990)核酸研究18:7449)、玉米醇溶蛋白启动子(克里兹(Kriz)等人，(1987)分子遗传学与普通遗传学)207:90-98；兰格里奇等人，(1983)细胞(Cell)34:1015-1022；雷纳(Reina)等人，(1990)核酸研究18:6425；雷纳等人，(1990)核酸研究18:7449；和万德尔特(Wandelt)等人，(1989)核酸研究17:2354)、球蛋白-1启动子(贝朗格(Belanger)等人，(1991)遗传学(Genetics)129:863-872)、α-微管蛋白cab启动子(沙利文(Sullivan)等人，(1989)分子遗传学与普通遗传学)215:431-440)、PEPCase启动子(哈得斯佩斯和格鲁拉(Hudspeth&Grula)(1989)植物分子生物学12:579-589)、R基因复合物相关启动子(钱德勒(Chandler)等人，(1989)植物细胞1:1175-1183)和查尔酮合酶启动子(弗兰肯(Franken)等人，(1991)EMBO J.10:2605-2612)。
尤其可用于种子特异性表达的是豌豆球蛋白启动子(沙寇(Czako)等人，(1992)分子遗传学与普通遗传学)235:3-40；以及披露在美国专利号5,625,136中的种子特异性启动子。可用于成熟的叶中表达的启动子是当衰老开始时开启的那些启动子，如来自拟南芥属(Arabidopsis)的SAG启动子(Gan(加恩)等人,(1995)科学(Science)270:1986-1988)。
此外，可以使用在叶绿体中起作用的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9 5’UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。可用于本发明的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和库尼茨(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
在本发明的一些实施例中，可使用诱导型启动子。因此，例如，可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节物来调节有机体中的基因表达。本发明的核苷酸序列的表达经由化学调节过的启动子进行的调节使得本发明的多肽仅当例如用诱导的化学品处理作物植物时能被合成。取决于目的，在应用化学品诱导基因表达时启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达时启动子可以是化学阻抑型启动子。
植物可使用的化学诱导型启动子在本领域中是已知的，并且包括但不限于玉米In2-2启动子(它是由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉米GST启动子(它是由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草PR-1a启动子(它是由水杨酸激活)(例如，PR1a系统)、类固醇反应性启动子(参见例如，斯凯纳(Schena)等人，(1991)美国国家科学院院刊88,10421-10425和麦克尼利斯(McNellis)等人，(1998)植物学杂志(Plant J.)14,247-257中的糖皮质激素-诱导型启动子)以及四环素-诱导型启动子和四环素-阻抑型启动子(参见例如，加茨(Gatz)等人，(1991)分子遗传学与普通遗传学227、229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)、Lac阻遏物系统启动子、铜-诱导型系统启动子、水杨酸诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素-诱导型启动子(奥亚马(Aoyama)等人，(1997)植物学杂志11:605-612)和蜕皮激素-诱导型系统启动子。
诱导型启动子的其他非限制性实例包括ABA-和细胞膨胀-诱导型启动子、植物生长素结合蛋白基因启动子(施沃布(Schwob)等人，(1993)植物学杂志4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(罗尔斯顿(Ralston)等人，(1988)遗传学119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(科德罗(Cordero)等人，(1994)植物学杂志6:141-150)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(科勒(Kohler)等人.(1995)植物分子生物学29:1293-1298；马丁内斯(Martinez)等人，(1989)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)208:551-565；和奎格利(Quigley)等人，(1989)分子进化杂志(J.Mol.Evol.)29:412-421)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利号5,364,780)和乙醇诱导型(国际专利申请公开号WO 97/06269和WO 97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样，可使用加茨(1996)最新生物技术观点(Current Opinion Biotechnol.)7:168-172和加茨(1997)植物生理学植物分子生物学年度评论(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)48:89-108中描述的任何诱导型启动子。适用于指导本发明的核苷酸序列在植物中的表达的其他化学诱导型启动子披露于美国专利5,614,395中，该专利通过引用以其全文结合在此。基因表达的化学诱导还详述于公开申请EP 0 332 104(授予汽巴-嘉基)和美国专利5,614,395中。在一些实施例中，用于化学诱导的启动子可以是烟草PR-1a启动子。
在一些实施例中，可用于藻类的启动子包括但不限于RubisCo小亚单位基因1的启动子(PrbcS1)、肌动蛋白基因的启动子(Pactin)、硝酸还原酶基因的启动子(Pnr)和双拷贝碳酸酐酶基因1的启动子(Pdca1)(参见，沃克(Walker)等人，植物细胞报告(Plant Cell Rep.)23:727-735(2005)；Li等人，基因(Gene)403:132-142(2007)；Li等人，分子生物学报告(Mol Biol.Rep.)37:1143-1154(2010))、σ70-型质体rRNA基因的启动子(Prrn)、psbA基因(编码光系统-II反应中心蛋白D1)的启动子(PpsbA)、psbD基因(编码光系统-II反应中心蛋白D2)的启动子(PpsbD)、psaA基因(编码光系统I的脱辅基蛋白)的启动子(PpsaA)、ATP酶α亚基基因的启动子(PatpA)和RuBisCo大亚基基因的启动子(PrbcL)以及它们的任何组合(参见例如，德科萨(De Cosa)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)19:71-74(2001)；丹尼尔等人，BMC生物技术(BMC Biotechnol.)9:33(2009)；穆托(Muto)等人，BMC生物技术9:26(2009)；寿喜烧(Surzycki)等人，生物制品(Biologicals)37:133-138(2009))。
在一些实施例中，可用于细菌和酵母的启动子包括但不限于组成型启动子(例如，lpp(脂蛋白基因))和/或氧化应激诱导型启动子(例如，超氧化物歧化酶或过氧化氢酶启动子)。
因此，在一些实施例中，可用于酵母的启动子可包括但不限于来自以下的启动子：磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、半乳糖调节子(GAL1、GAL10)、醇脱氢酶(ADH1、ADH2)、磷酸酶(PHO5)、铜活化金属硫蛋白(CUP1)、MFα1、PGK/α2操纵子、TPI/α2操纵子、GAP/GAL、PGK/GAL、GAP/ADH2、GAP/PHO5、异-1-细胞色素c/糖皮质激素应答元件(CYC/GRE)、磷酸甘油酸激酶/雄激素应答元件(PGK/ARE)、转录延伸因子EF-1α(TEF1)、磷酸丙糖脱氢酶(TDH3)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、丙酮酸激酶1(PYK1)和/或己糖转运体(HXT7)(参见，罗马诺斯(Romanos)等人，酵母(Yeast)8:423-488(1992)；和帕特罗(Partow)等人，酵母(Yeast)27:955-964(2010))。
在一些实施例中，可用于细菌的启动子可包括但不限于L-阿拉伯糖诱导型(araBAD,PBAD)启动子、任何lac启动子、L-鼠李糖诱导型(rhaPBAD)启动子、T7RNA聚合酶启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体启动子(pL,pL-9G-50)、脱水四环素诱导型(tetA)启动子、trp、lpp、phoA、recA、proU、cst-1、cadA、nar、lpp-lac、cspA、T7-lac操纵子、T3-lac操纵子、T4基因32、T5-lac操纵子、nprM-lac操纵子、Vhb、蛋白A、棒状杆菌-大肠杆菌样启动子、thr、hom、白喉毒素启动子、sig A、sig B、nusG、SoxS、katb、α-淀粉酶(Pamy)、Ptms、P43(由两种重叠RNA聚合酶σ因子识别位点σA、σB组成)、Ptms、P43、rplK-rplA、铁氧蛋白启动子和/或木糖启动子。(参见，K.特佩(K.Terpe)应用微生物和生物技术(Appl.Microbiol,Biotechnol.)72:211-222(2006)；汉尼格(Hannig)等人，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)16:54-60(1998)；和斯里瓦斯塔瓦(Srivastava)等人，蛋白质表达和纯化(Protein Expr Purif)40:221-229(2005))。
如本文使用的，“表达盒”意指一种包含编码本发明的修饰的Vip3多肽的核苷酸序列的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列与至少一个控制序列(例如，启动子)可操作地关联。因此，本发明的一些方面提供了被设计成表达编码本发明的修饰的Vip3多肽的核苷酸序列的表达盒。
包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。表达盒还可以是一种天然存在但已经是以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。
除可操作地连接至本发明的核苷酸序列的启动子之外，本发明的表达盒还可以包括其他调节序列。因此，表达盒还可以任选地包括在选定宿主细胞中具有功能性的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用并且负责在超出感兴趣的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区对于该转录起始区可以是天然的，对于该可操作地连接的感兴趣的核苷酸序列可以天然的，对于该宿主细胞可以是天然的，或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的核苷酸序列、该宿主、或其任意组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在感兴趣的宿主细胞中起作用的那些。对于植物，此类终止子可包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。
已经发现众多核苷酸序列增强了来自转录单位之内的基因表达并且这些序列可以与本发明的表达盒结合使用以增加感兴趣的多核苷酸在宿主细胞中的表达。
已经示出不同的内含子序列增强了特别是在单子叶植物细胞中的表达。例如，常规地已经将内含子序列结合到植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列中。
还已知多种从病毒衍生的非翻译前导序列增强了表达，并且在此包括了这些序列。具体而言，已经显示，来自烟草花叶病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMY)的前导序列在增强表达方面是有效的(参见例如加利(Gallie)等人(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:8693-8711；斯库策斯基(Skuzeski)等人(1990)植物分子生物学15:65-79)。本领域内已知的其他前导序列包括但不限于小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区域)(爱罗伊-斯坦(Elroy-Stein)等人，(1989)美国国家科学院院刊86:6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(艾莉森(Allison)等人，(1986)病毒学(Virology)154:9-20；和加利(Gallie)等人，(1995)基因(Gene)165:233-238)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒；艾莉森等人，(1986)病毒学154:9-20)；人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(马策亚克(Macejak)和扎莫(Samow)(1991)自然353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4)(乔布林(Jobling)等人，(1987)自然325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV；加利等人，(1987)核酸研究15:3257-3273；加利等人，(1988)核酸研究16:883-893；加利等人，(1992)核酸研究20:4631-4638)；和玉米褪绿斑驳病毒(Chlorotic Mottle Virus)前导序列(MCMV；洛默尔(Lommel)等人，(1991)病毒学81:382-385)。还参见，黛拉-乔帕(Della-Cioppa)等人(1987)植物生理学(Plant Physiology)84:965-968。
表达盒还可以包括选择性标记的核苷酸序列，它可以用于选择转化的宿主细胞。如本文使用的，“选择性标记”意指核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时向表达该标记的宿主细胞赋予不同的表型，并且因此允许此类转化的细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样一个核苷酸序列可以编码选择性抑或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予可以通过化学手段而被选择的性状，如通过使用选择剂(例如，抗生素等)，或者取决于该标记是否仅是一种人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，如通过筛选(例如，荧光)。当然，适合的选择性标记的许多实例在本领域中是已知的并且可以用于本文描述的表达盒中。
除表达盒之外，本文描述的核酸分子和核苷酸序列还可以与载体一起使用。术语“载体”是指用于将一种核酸(或多种核酸)转移、递送或引入到细胞中的组合物。载体包括一种含有有待被转移、递送或引入的一个或多个核苷酸序列的核酸分子。用于在宿主有机体的转化中使用的载体在本领域是熟知的。一般类别的载体的非限制性实例包括但不限于病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、福斯质粒载体、人工染色体、或农杆菌二元载体，这些载体是处于双链或单链的线性的或环形的形式，可以是或可以不是自身可传播的或可移动的。如本文定义的载体可以通过整合进细胞基因组转化原核的或真核的宿主，或在染色体外存在(例如具有一个复制起点的自主复制质粒)。另外包括的是穿梭载体，穿梭载体一词是指DNA运载体，该DNA运载体自然地或经设计能够在两个不同的宿主有机体中复制，这些宿主有机体可以是选自：放线菌以及相关的物种、细菌和真核有机体(例如，高等植物、哺乳动物、真菌(包括酵母))。在一些实施例中，载体中的核酸是在适当的启动子或其他调节元件的控制之下，并与其可操作地相连接的，以用于在宿主细胞中进行转录。该载体可以是一种双功能的表达载体，它在多种宿主中发挥作用。在基因组DNA的情况下，这可以包含它所拥有的启动子或其他调节元件；而在cDNA的情况下，这可以是处于适当的启动子或其他的调控元件的控制之下，用于在该宿主细胞中表达。因此，本发明的核酸分子和/或表达盒可包含在如本文所述的载体中，并如本领域中所已知。
在一些实施例中，可希望的是将本发明的修饰的Vip3多肽靶向至细胞的具体部分如叶绿体、细胞壁、线粒体等。编码信号肽的核苷酸序列可以在异源核苷酸序列或核酸分子的5’-或3’-末端处可操作地连接。
已知在植物中存在着用于靶向基因产物的不同机制，并且控制这些机制的功能的序列已经在一些细节上被表征。例如，基因产物靶向到叶绿体是通过在不同蛋白的氨基末端发现的信号序列进行控制的，该氨基末端在叶绿体输入期间被切割以产生成熟的蛋白(参见，例如措麦(Comai)等人，(1988)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263:15104-15109)。这些信号序列可以与异源基因产物融合以影响异源产物被输入到叶绿体中(范登布洛克(van den Broeck)等人，(1985)自然313:358-363)。用于编码适当的信号序列的DNA可以从编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶、GS2蛋白以及许多其他的已知位于叶绿体上的蛋白的cDNA的5’端分离。还参见，美国专利号5,639,949的实例37中标题为“叶绿体靶向的表达(Expression with Chloroplast Targeting)”的部分。
不仅可以将以上描述的靶向序列与其内源启动子相结合使用，还可以与异源启动子相结合使用。使用与靶向序列异源的启动子不仅提供了靶向序列的能力，而且提供了与最初产生靶向信号的启动子的表达谱不同的表达谱。
因此，信号肽(以及编码它们的靶向核苷酸序列)在本领域中是熟知的，且可在如下的公共数据库中发现：“信号肽网站：信号序列和信号肽的信息平台”(www.signalpeptide.de)；“信号肽数据库”(proline.bic.nus.edu.sg/spdb/index.html)(Choo等人，BMC Bioinformatics6:249(2005)(可在www.biomedcentral.com/1471-2105/6/249/abstract上获得)；ChloroP(www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/；预测在蛋白质序列中叶绿体转运肽(cTP)的存在以及潜在cTP切割位点的位置)；LipoP(www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/；预测革兰氏阴性菌中的脂蛋白以及信号肽)；MITOPROT(ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot.html；预测线粒体靶向序列)；PlasMit(gecco.org.chemie.uni-frankfurt.de/plasmit/index.html；预测恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)中的线粒体转运肽)；Predotar(urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html；预测线粒体和质体靶向序列)；PTS1(mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp；预测含蛋白质的过氧化物酶体靶向信号1)；SignalP(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；预测来自不同有机体的氨基酸序列中的信号肽切割位点的存在以及位置，这些有机体是：革兰氏阳性原核生物、革兰氏阴性原核生物、以及真核生物)。
因此，例如，为了在质体中定位，可以使用来自质体的铁氧还蛋白的转运肽：NADP+菠菜的氧化还原酶(FNR)，其披露于詹森(Jansen)等人，(1988)当代遗传学(Current Genetics)13:517-522。特别是，可以使用在其中披露的cDNA序列的范围从-171至165的核苷酸的序列，它包括5’非翻译区连同编码转运肽的序列。转运肽的另一个实例是玉米糯蛋白的转运肽，包括成熟玉米糯蛋白的前34个氨基酸残基(克洛斯根(Klosgen)等人，(1989)分子遗传学与普通遗传学217:155-161)。还可能使用没有成熟蛋白的前34个氨基酸的转运肽。此外，可使用核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(沃尔特(Wolter)等人，(1988)美国国家科学院院刊85:846-850；纳夫拉特((Nawrath)等人，(1994)美国国家科学院院刊91:12760-12764)、NADP苹果酸脱氢酶(盖拉多(Galiardo)等人，(1995)植物学(Planta)197:324-332)、谷胱甘肽还原酶(克雷森(Creissen)等人，(1995)植物学杂志8:167-175)和/或R1蛋白质(罗伯斯(Lorberth)等人，(1998)自然生物技术(Nature Biotechnology)16:473-477)的信号肽。
在感兴趣的多核苷酸背景下的“引入”(“Introducing”、“introduce”、“introduced”)(以及它们的语法变型)意指将感兴趣的核苷酸序列以使该核苷酸序列能够进入细胞内部的这样的方式提供给宿主有机体或所述有机体的细胞(例如，宿主细胞)。在有待引入多于一种核苷酸序列的情况下，这些核苷酸序列可以作为一种单一的多核苷酸或核酸构建体的部分、或者作为分开的多核苷酸或核酸构建体而组装，并且可以位于相同或不同的表达构建体或转化载体上。因此，这些多核苷酸可以自单个转化事件、分开的转化/转染事件中引入细胞中，或者例如它们可以通过常规育种方案(例如，杂交)结合到有机体中。因此，在本发明的一些方面，可将本发明的一种或多种核酸构建体(例如，包含编码本发明的修饰的Vip3多肽的核苷酸序列的核酸分子)引入宿主有机体或所述宿主有机体的细胞中。
如本文使用的术语“转化”或“转染”是指将异源核酸引入细胞中。细胞的转化可以是稳定或瞬时的。因此，在一些实施例中，用本发明的核酸分子稳定转化宿主细胞或宿主有机体。在一些实施例中，用本发明的重组核酸分子瞬时转化宿主细胞或宿主有机体。
在多核苷酸背景下的“瞬时转化”意指：将多核苷酸引入细胞中并且没有整合到该细胞的基因组中。
如本文使用，“稳定转化”或“稳定地转化的”意为将核酸分子引入(例如“稳定地引入”或“稳定地引入到”)细胞并且整合进入该细胞的基因组中。按照这样，该整合的核酸分子能够被其子代遗传，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。如本文使用的，“基因组”还包括核基因组与质体基因组，并且因此包括该核酸到例如叶绿体或线粒体基因组中的整合。如本文使用的稳定转化也可以是指在染色体外(例如，作为微型染色体或质粒)维持的转基因。
瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来检测，这些测定可以检测由一个或多个引入到有机体中的转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的基因组DNA与核酸序列(这些核酸序列与引入有机体(例如，植物、哺乳动物、昆虫、古细菌、细菌等)中的转基因的核苷酸序列特异性杂交)的DNA印记杂交测定来检测。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与核酸序列的RNA印迹杂交测定来检测，这些核酸序列与引入到植物或其他有机体中的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域熟知的其他扩增反应来进行检测，这些反应采用与转基因的一个或多个目标序列杂交的特异性引物序列，从而导致该转基因序列的扩增，这种扩增可以根据标准方法进行检测。转化也可以通过本领域中熟知的直接测序和/或杂交方案检测。
因此，在一些实施例中，核酸分子、核苷酸序列、构建体、表达盒可瞬时表达和/或它们可以稳定地结合在宿主有机体的基因组中。
本发明的重组核酸分子/多核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法引入细胞中。在本发明的一些实施例中，细胞的转化包括核转化。在一些实施例中，细胞的转化包括质体转化(例如，叶绿体转化)。在一些实施例中，本发明的重组核酸分子/多核苷酸可通过常规育种技术(例如，杂交)引入。
转化真核和原核有机体的程序在本领域中是熟知的且常规的，且在各处的文献中有所描述(参见例如，江(Jiang)等人，2013.自然生物技术(Nat.Biotechnol.)31:233-239；拉恩(Ran)等人，自然实验手册(Nature Protocols)8:2281–2308(2013))。
因此，可以按本领域中熟知的任何数目的方法将一种核苷酸序列引入宿主有机体或其细胞中。本发明的这些方法并不取决于用于将一种或多种核苷酸引入到有机体中的具体方法，仅取决于它们可以获准进入该有机体的至少一个细胞内部。在有待引入多于一种核苷酸序列的情况下，它们可以作为一种单一核酸构建体的部分、或者作为分开的核酸构建体而进行组装，并且可以位于相同或不同的核酸构建体上。因此，可以在单一的转化事件中或在分开的转化事件中将核苷酸序列引入感兴趣的细胞中，或者，可替代地，在相关的情况下，可将核苷酸序列结合到植物中作为育种方案的一部分。
在一些实施例中，可将本发明的核酸构建体、核酸分子和/或核苷酸序列引入宿主有机体的细胞中。可以使用可用于本发明的任何细胞/宿主有机体。示例性宿主有机体包括植物、细菌、古细菌、病毒、动物(例如，昆虫)和/或真菌(例如，酵母)。
如本文使用，“植物”意为任何植物并且因此包括，例如被子植物(包括单子叶植物和双子叶植物两者)、裸子植物、苔藓植物、厥类和/或拟蕨类。在本发明的一些实施例中，植物是种子植物。另外，本发明的“植物”是处于任何发育阶段的任何植物。
如本文使用，术语“植物部分”或“植物材料”包括但不限于，胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、根、花或花的部分、枝、果实、果仁、穗、穗轴、果壳、茎秆、根、根尖、花药、花粉、卵细胞、受精卵、插条、植物细胞(包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞)、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团(plant clumps)、或植物的任何其他部分或产品。另外，如本文使用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。因此，在一些实施例中，本发明的植物细胞可以处于分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是较高级的组织单位(例如，植物组织或植物器官)的一部分。
“原生质体”是一种分离的植物细胞，没有细胞壁或仅具有部分细胞壁。
“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
如在此使用的，“植物器官”是植物的一个独特而明显结构化和分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
本发明涉及修饰的植物杀虫蛋白质(Vip)，含其的组合物以及其使用方法。在一些实施例中，Vip多肽是Vip3多肽。
Vip3多肽和编码它们的核酸是已知的，并描述在例如，J.伊斯次等人，美国国家科学院院刊93、5389-5394(1996年5月)；J.刘(J.Liu)等人，应用微生物学快报(Letters in Applied Microbiology)45，432-438(2007)；G.沃伦(G.Warren)，美国专利号5,990,383；Z.沈(Z.Shen)等人，美国专利号7,378,493；P.迈尔斯(P.Miles)等人，美国专利号7,244,820；美国专利号5,877,012；美国专利号6,107,279、美国专利号6,137,033和美国专利号6,291,156，将这些参考文献的披露全部通过引用以其全文结合在此。发现相应蛋白的研究小组给Vip蛋白质的命名有所不同。然而，最近已经开发出了标准命名法，且可以在苏云金杆菌毒素命名数据库(www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html)中找到。本披露具体地例示出对Vip3A、Vip3B、Vip3C和Vip3D多肽的修饰，但可以用现在已知或后来发现的任何Vip多肽(例如，任何Vip3多肽)实施本发明。
因此，在本发明的背景中，“Vip3多肽”意指现在或随后鉴定的作为Vip3类的成员的任何植物杀虫蛋白质(VIP)，包括例如但不限于Vip3A、Vip3B、Vip3C、Vip3D和它们的同源物。在一些实施例中，可用于本发明的Vip3多肽可以是天然存在或非天然存在的突变体Vip3。将蛋白质鉴定为在Vip3类蛋白质中的一些结构特征包括，1)大小为约80-88kDa，被昆虫或胰蛋白酶经蛋白水解作用而加工成约62-66kDa的毒性核心(李(Lee)等人，2003.应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)69:4648-4657)；和2)高度保守的N-端分泌信号，其在苏云金杆菌中的分泌期间不会天然地被加工。Vip3类的成员(包括那些先前提到的)和它们相应的GenBank登录号、美国专利或专利公开号的非限制性实例是Vip3Aa1(AAC37036)、Vip3Aa2(AAC37037)、Vip3Aa3(美国专利6137033)、Vip3Aa4(AAR81079)、Vip3Aa5(AAR81080)、Vip3Aa6(AAR81081)、Vip3Aa7(AAK95326)、Vip3Aa8(AAK97481)、Vip3Aa9(CAA76665)、Vip3Aa10(AAN60738)、Vip3Aa11(AAR36859)、Vip3Aa12(AAM22456)、Vip3Aa13(AAL69542)、Vip3Aa14(AAQ12340)、Vip3Aa15(AAP51131)、Vip3Aa16(AAW65132)、Vip3Aa17(美国专利6603063)、Vip3Aa18(AAX49395)、Vip3Aa19(DQ241674)、Vip3Aa19(DQ539887)、Vip3Aa20(DQ539888)、Vip3Aa21(ABD84410)、Vip3Aa22(AAY41427)、Vip3Aa23(AAY41428)、Vip3Aa24(BI 880913)、Vip3Aa25(EF608501)、Vip3Aa26(EU294496)、Vip3Aa27(EU332167)、Vip3Aa28(FJ494817)、Vip3Aa29(FJ626674)、Vip3Aa30(FJ626675)、Vip3Aa31(FJ626676)、Vip3Aa32(FJ626677)、Vip3Aa33(GU073128)、Vip3Aa34(GU073129)、Vip3Aa35(GU733921)、Vip3Aa36(GU951510)、Vip3Aa37(HM132041)、Vip3Aa38(HM117632)、Vip3Aa39(HM117631)、Vip3Aa40(HM132042)、Vip3Aa41(HM132043)、Vip3Aa42(HQ587048)、Vip3Aa43(HQ594534)、Vip3Aa44(HQ650163)、Vip3Ab1(AAR40284)、Vip3Ab2(AAY88247)、Vip3Ac1(美国专利申请公开20040128716)、Vip3Ad1(美国专利申请公开20040128716)、Vip3Ad2(CAI43276)、Vip3Ae1(CAI43277)、Vip3Af1(美国专利7,378,493)、Vip3Af2(ADN08753)、Vip3Af3(HM117634)、Vip3Ag1(ADN08758)、Vip3Ag2(FJ556803)、Vip3Ag3(HM117633)、Vip3Ag4(HQ414237)、Vip3Ag5(HQ542193)、Vip3Ah1(DQ832323)、Vip3Ba1(AAV70653)、Vip3Ba2(HM117635)、Vip3Bb1(美国专利7,378,493)、Vip3Bb2(ABO30520)、Vip3C(帕尔马(Palma)等人，应用与环境微生物学(Appl.Environ Microbiol)78(19):7163-7165(2012))和/或Vip3Bb3(ADI48120)。
诸位发明人已经出乎意料地发现，修饰Vip3多肽，以使得其包含异源碳水化合物结合模块(CBM)得到具有被改变特征的修饰的Vip3多肽，这些特征包括与未经修饰以包含所述异源CBM的相同Vip3多肽(即参考Vip3)相比，针对植物有害生物被改变的毒性。
因此，在本发明的一个方面，提供包含异源碳水化合物结合模块(CBM)，基本上由其组成或由其组成的修饰的Vip3多肽。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽可包含两个或更多个CBM，基本上由其组成或由其组成，这些CBM可以是相同或不同的，任选地呈串联形式。在一些实施例中，异源CBM可以取代Vip3多肽的结构域III的全部或部分。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽包含Vip3多肽的结构域I和/或结构域II的全部或部分。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽可以包含Vip3多肽的结构域IV的全部或部分，基本上由其组成或由其组成，和/或可以缺少Vip3多肽的结构域IV的全部或部分。在一些实施例中，修饰的Vip3多肽在氨基端至羧基端方向上包含Vip3多肽的结构域I的全部或部分、Vip3多肽的结构域II的全部或部分、异源CBM和任选的Vip3多肽的结构域IV的全部或部分，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中任一个的全部或部分，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的所述部分具有至少70％一致性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，Vip3多肽的结构域III包含所述Vip3多肽的氨基酸518至684，基本上由其组成或由其组成。在特定实施例中，结构域III包含SEQ ID NO:1-3的氨基酸542至667或来自不同Vip3多肽的相应氨基酸序列、SEQ ID NO:4的氨基酸550至675或来自不同Vip3多肽的相应氨基酸序列、或者SEQ ID NO:6的氨基酸552至667或来自不同Vip3多肽的相应氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在本发明的背景中，“相应于”意指当某些蛋白的氨基酸序列与彼此比对时，“相应于”在本发明中某些枚举的位置的氨基酸是与参考蛋白中的这些位置比对的那些，但相对于本发明的特定氨基酸序列而言并不一定位于这些精确的数字位置中。
在一些实施例中，Vip3多肽的结构域III包含以下，基本上由其组成或由其组成：
(a)SEQ ID NO:1的氨基酸542至667；
(b)SEQ ID NO:2的氨基酸542至667；
(c)SEQ ID NO:3的氨基酸542至667；
(d)SEQ ID NO:4的氨基酸550至675；
(e)SEQ ID NO:6的氨基酸552至677；
(f)如本文所述的另一Vip3多肽的相应氨基酸序列；或
(g)与上文(a)至(f)中任一个具有至少约70％一致性的氨基酸序列。
异源CBM可以例如通过插入或通过取代Vip3多肽的一部分并入该Vip3多肽中。在CBM取代Vip3多肽的一部分的实施例中，Vip3多肽的交换为异源CBM的一部分可以包括结构域III的全部、结构域III的一部分(例如，少于整个结构域III的氨基酸残基)或可以是Vip3多肽的大于整个结构域III的一部分(例如，可在结构域III外部在N-端方向上延伸并朝向或进入结构域II，和/或在结构域III外部在C-端方向上延伸并朝向或进入结构域IV)。因此，例如，当Vip3多肽的结构域III交换或替换为异源CBM时，交换还可以包括Vip3多肽的在结构域III的氨基端侧和/或羧基端侧的一个或多个氨基酸残基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个残基)。因此，例如，当结构域III包含SEQ ID NO:1的氨基酸542至667时，取代可以包括所述结构域III的氨基端侧的氨基酸残基500至541中的一个或多个(例如，氨基酸500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541或其中的任何范围)和/或羧基端侧的氨基酸668至700中的一个或多个(例如，氨基酸668、669、670、671、672、673、674、675、676、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700或其中的任何范围)，以任何方式组合。在一些实施例中，取代可以包括C-末端和/或N-末端比完整结构域III短约一个至约四个(例如，1、2、3或4)氨基酸残基的结构域III的一部分，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，取代可以包括结构域III和C-末端和/或N-末端比完整结构域III多的额外一个至约十个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)氨基酸残基，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，如本文所述的Vip3结构域III的至少一部分可交换为CBM。因此，例如，当结构域III是SEQ ID NO:4的氨基酸550至675时，通过在SEQ ID NO:4(例如，氨基酸残基550至675)的结构域III的氨基端侧和/或羧基端侧将这些氨基酸残基中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个残基等)保留在Vip3多肽中，取代可以包括少于所有氨基酸残基550至675。例如，对于SEQ ID NO:4，结构域III的被交换部分可以是残基550至675的全长氨基酸序列，或者可以是例如残基551至675、552至675、553至675、554至675、551至674、551至673、551至672、550至673、555至670、560至675、560至670等。
因此，Vip3多肽的被异源CBM交换的区域可以是结构域III的全部或者Vip3多肽的结构域III的羧基端和/或氨基端处的更多和/或更少氨基酸残基的任何组合。
在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56(即SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56)的氨基酸序列具有至少约70％(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)氨基酸序列相似性或一致性。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56中任一个的氨基酸序列具有至少约75％的氨基酸序列相似性或一致性。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56中任一个的氨基酸序列具有至少约80％的氨基酸序列相似性或一致性。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56中任一个的氨基酸序列具有至少约85％的氨基酸序列相似性或一致性。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56中任一个的氨基酸序列具有至少约90％的氨基酸序列相似性或一致性。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56中任一个的氨基酸序列具有至少约95％的氨基酸序列相似性或一致性。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56中任一个的氨基酸序列具有至少约90％至约100％的氨基酸序列相似性或一致性。在一些实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽与选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:33-56中任一个的氨基酸序列具有100％的氨基酸序列相似性或一致性。
在代表性实施例中，本发明的修饰的Vip3多肽可以是在与其野生型或参考母体Vip3多肽相比时“改进的Vip3多肽”，在于其展示出以下特性中的一种或多种：1)抵抗目标昆虫的效力增加(比活度更高)和/或杀死率增加(在相当蛋白质水平下杀死速度更快)；2)目标有害生物谱增加或减少；3)目标有害生物形成抗性的敏感性降低；4)转基因宿主或宿主细胞中的表达水平增加；5)对昆虫蛋白酶降解的抗性增加(目标昆虫肠道中的稳定性增加)；6)在环境中的稳定性增加；和7)对有益昆虫、非目标有害生物和植物的毒性降低。
因此，在本发明的背景中，“提高杀有害生物(例如，杀昆虫、杀线虫)活性”或“提高的杀有害生物(例如，杀昆虫)活性”或其任何语法变型意指对Vip3多肽的修饰得到具有以下特性中的一种或多种的本发明的工程化多肽：1)抵抗目标有害生物(例如昆虫)的效力增加(即比活度更高)和/或杀死率增加(在相当蛋白质水平下杀死速度更快)；2)目标有害生物谱增加或减少；3)目标有害生物形成抗性的敏感性降低；4)转基因宿主或宿主细胞中的表达水平增加；5)对昆虫蛋白酶降解的抗性增加(目标昆虫肠道中的稳定性增加)；6)在环境中的稳定性增加；和7)对有益昆虫、非目标有害生物和植物的毒性降低。
碳水化合物结合模块(CBM)是离散折叠结构域，见于作为碳水化合物活性酶的蛋白质内。如其名字所指示，CBM的特征是它们的碳水化合物结合活性(参见例如，波拉斯顿(Boraston)等人，生物化学杂志(Biochem J.)382:769-781)(2004))。CBM是较大多肽中通过有时高度灵活的接头序列与催化模块连接的非催化结构域(吉尔伯特(Gilbert)等人，结构生物学新观点(Curr.Op.Structural Biol.)23:669-677(2013))。通常认为，CBM功能是使作为其一部分的酶更接近目标底物，从而增加催化速率。
当前，基于氨基酸序列相似性将碳水化合物结合模块分成67个家族(参见，碳水化合物活性酶数据库(www.cazy.org/Welcome-to-the-Carbohydrate-Active.html)；坎塔雷尔(Cantarel)等人，(2009)，“碳水化合物活性酶数据库(CAZy)：糖基因组专业资源(The Carbohydrate-Active EnZymes database(CAZy):An expert resource for Glycogenomics)”，核酸研究(Nucleic Acids Research)37(数据库期号)：D233–D238.doi:10.1093/nar/gkn663)。
可用于本发明的异源CBM可以是来自任何蛋白质的B型CBM。B型CBM是结合具有沟槽或裂缝的CBM的聚糖链。(波拉斯顿等人，生物化学杂志(382:769-781(2004))。在一些实施例中，可用于本发明的B型CBM包含β-夹层。在一些实施例中，异源CBM包含来自β-1,4-甘露聚糖酶的CBM氨基酸序列、任选地来自β-1,4-甘露聚糖酶的B型CBM氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，可用于本发明的CBM来自β-1,4-甘露聚糖酶。国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)为这种酶家族提供的EC号是EC 3.2.1.78。因此，在一些实施例中，可用于本发明的CBM是来自酶类别EC 3.2.1.78的酶。这类酶被人接受的名字是甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶，但这些酶的名字也叫β-1,4-甘露聚糖酶、内切-1,4-甘露聚糖酶、β-甘露聚糖酶；内切-1,4-β-甘露聚糖酶、内切-β-1,4-甘露聚糖酶、β-甘露聚糖酶B、β-1,4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶、内切-β-甘露聚糖酶、β-D-甘露聚糖酶和/或1,4-β-D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶。
在一些实施例中，修饰的Vip3可以包含异源CBM的功能部分，诸如B型CBM或来自1,4-β甘露聚糖酶的B型CBM。CBM的功能部分可包括落在约3埃至约8埃(例如，约3、4、5、6、7、8埃等)碳水化合物结合位点内的和/或影响与碳水化合物相互作用的氨基酸的构象的任何氨基酸残基。可以影响与碳水化合物相互作用的氨基酸的构象的氨基酸残基可以包括那些可与碳水化合物本身、水和/或直接与碳水化合物相互作用的离子形成氢键、范德华相互作用、疏水相互作用或电荷变化的氨基酸。因此，在一些实施例中，异源CBM包含来自β-1,4-甘露聚糖酶的CBM氨基酸序列的、任选地来自β-1,4-甘露聚糖酶的B型CBM氨基酸序列的全部或功能部分，基本上由其组成或由其组成。
可用于本发明的CBM可见于例如碳水化合物活性酶数据库(www.cazy.org/Welcome-to-the-Carbohydrate-Active.html)。一些非限制性实例包括来自以下的CBM：来自极端嗜热厌氧热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor obsidiansis)OB47的甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶(GenBank登录号ADL41540.1)；来自胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)3016的甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶(GenBank登录号AFC29293.1)；来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的β-1,4-甘露聚糖酶(GenBank登录号AAC71692.1)；或来自弧菌属物种MA-138的β-1,4-甘露聚糖酶(GenBank登录号BAG69482.2)。
β-1,4-甘露聚糖酶多肽(本发明可使用由此所得的CBM)的其他非限制性实例包括来自β-1,4-甘露聚糖酶的CBM，该β-1,4-甘露聚糖酶来自：解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)(GenBank登录号AAC44232.1)；弧菌属物种MA-138(GenBank登录号BAG69482.2)；纤维微细菌属物种(Cellulosimicrobium sp.)HY-13(GenBank登录号AEE43708.1)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank登录号AEB98481.1)；日本盘鲍(Haliotis discus discus)(GenBank登录号BAI99559.1)；链霉菌属物种(Streptomyces sp.)s6-204(GenBank登录号ABY90130.1)；弧菌属物种MA-138(GenBank登录号BAA25188.1)；肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种KPNIH27(GenBank登录号AIA43525.1)；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(GenBank登录号AIE71926.1)；豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank登录号KEP91190.1)；肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种KPR0928(GenBank登录号AIE29885.1)；粉尘克罗诺杆菌(Cronobacter pulveris)(NCBI参考序列：WP_029591781.1)；Gemmobacter nectariphilus(NCBI参考序列：WP_028029945.1)；硫碱弧菌属物种(Thioalkalivibrio sp.)ALJ24(NCBI参考序列：WP_026287860.1)；副球菌属物种(Paracoccus sp.)N5(NCBI参考序列：WP_026155388.1)；根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)JGI 0001002-C21(NCBI参考序列：WP_025570492.1)；阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)(GenBank登录号KDP99185.1)；阿斯布肠杆菌(Enterobacter asburiae)(NCBI参考序列：WP_024908493.1)；小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚种8081(NCBI参考序列：YP_001008241.1)；产气荚膜梭菌(Clostridium straminisolvens)JCM 21531(GenBank登录号GAE87707.1)；或弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)NCTC 11218(GenBank:ADT88758.1)。β-1,4-甘露聚糖酶多肽的其他非限制性实例可在碳水化合物活性酶(CAZY)数据库(www.cazy.org)中找到。
在一些实施例中，异源CBM包含与天然存在的CBM，例如，来自β1,4-甘露聚糖酶(例如，SEQ ID NO:24–32中的任一个)的B型CBM的氨基酸序列具有至少约70％-100％(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中的任何变数或范围)氨基酸序列相似性或一致性的CBM氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，异源CBM包含与SEQ ID NO:24-32中任一个的氨基酸序列具有至少约75％氨基酸序列相似性或一致性的CBM氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，异源CBM包含与SEQ ID NO:24-32中任一个的氨基酸序列具有至少约80％至约95％氨基酸序列相似性或一致性的CBM氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，异源CBM包含与SEQ ID NO:24-32中任一个的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列相似性或一致性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CBM氨基酸序列，基本上由其组成，由其组成。
在一些实施例中，异源CBM包含金属结合位点。在一些实施例中，异源CBM的金属结合位点结合钙和/或镁。CBM的金属结合位点可被带电原子配位，且可结合进入CBM和/或存在CBM的蛋白质的表面上的环基序内。在一些实施例中，金属可参与结合碳水化合物。在一些实施例中，金属可以与结合CBM天然所处蛋白质中的CBM的碳水化合物官能无关。
在一些实施例中，修饰的Vip3多肽具有针对例如昆虫的杀有害生物性。因此，在一些实施例中，修饰的Vip3多肽具有针对昆虫，例如，鳞翅目昆虫的杀有害生物性。
因此，在一些实施例中，昆虫有害生物包括但不限于选自以下目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等。在一些实施例中，昆虫有害生物包括但不限于玉米螟(欧洲玉米螟)、小菜蛾(方块蛾)、草地贪夜蛾(秋粘虫)、小地老虎(black cutworm)、西部灰地老虎(pale western cutworm)、西部豆夜蛾(western bean cutworm)、美洲棉铃虫(玉米穗虫)、烟芽夜蛾(烟草夜蛾)、甜菜夜蛾(beet armyworm)、澳洲棉铃虫(土著芽虫)、棉铃实夜蛾(棉铃虫)、传粉夜蛾(烟草天蛾)、粉纹夜蛾(cabbage looper)、棉红铃虫(红铃虫)、巨座玉米螟(西南玉米秆草螟)、小蔗杆草螟(甘蔗螟)、南美玉米苗斑螟(小玉米茎蛀虫)、大豆尺夜蛾(大豆夜蛾)、黎豆夜蛾(黎豆毛虫)、苜蓿绿夜蛾(green cloverworm)、向日葵同斑螟(sunflower head moth)、向日葵细卷叶蛾(banded sunflower moth)、或它们的任何组合。
在一些实施例中，提供包含修饰的Vip3多肽的组合物。在一些实施例中，包含修饰的Vip3多肽的组合物可由转基因植物或植物部分(例如，种子)的提取物制备，所述转基因植物或植物部分包含编码所述修饰的Vip3多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，包含修饰的Vip3多肽的组合物可通过在能够表达编码本发明的多肽的多核苷酸的细菌细胞中表达该多核苷酸而产生。在一些实施例中，组合物在农业上可接受的载体中包含修饰的Vip3多肽。
如本文使用的，“农业上可接受的载体”可以包括可与该活性组分结合以有助于它施用于植物或其部分的天然或合成的有机或无机材料。农业上可接受的载体包括但不限于可用于农业配制品中的惰性组分、分散剂、表面活性剂、佐剂、增粘剂、粘着剂、粘合剂、或其组合。另一种农业上可接受的载体可以是转基因植物或植物部分。
此类组合物可以按照使杀有害生物多肽与有害生物接触、产生毒性效果并控制一种或多种有害生物的任何方式来施用。因此，可以将这些组合物施用于植物或植物部分的表面，包括种子、叶、花、茎、块茎、根等。因此，修饰的Vip3多肽的一种或多种组合物可以按照许多公认的方式进行递送，例如，通过有害生物经口摄入或通过经由转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷洒的蛋白质组合物、一种饵基、或任何其他的领域公认的毒素递送系统与有害生物接触。
在一些实施例中，本发明提供一种核酸分子，该核酸分子包含编码一个或多于一个本文描述的修饰的Vip3多肽的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:7-23和/或SEQ ID NO:33-56的一个或多个核苷酸序列中的一个或多于一个，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，编码修饰的Vip3多肽的核苷酸序列可经密码子优化以在特定宿主有机体或宿主细胞中表达。
因此，在一些实施例中，本发明的核酸在转基因植物中表达。为了在转基因植物中表达，编码本发明的修饰的Vip3多肽的核苷酸序列可能需要其他修饰和/或优化。尽管在许多情况下，来自微生物有机体的核苷酸序列能够在植物中高水平表达而无需修饰，在转基因植物中的低水平表达可能是由于微生物的核苷酸序列的缘故，这些序列具有在植物种并不优选的密码子。在本领域中已知的是所有有机体都具有特定的密码子使用偏好，而且在本文所述的这些核酸/核苷酸序列的密码子可以被改变以符合植物偏好，同时维持由其编码的氨基酸序列。此外，在植物中高表达最好是由以下编码序列实现的，这些编码序列具有至少大约35％、优选大于约45％、更优选大于约50％、并且最优选大于约60％的GC含量。具有低GC含量的微生物核酸可能在植物中表达欠佳，这是由于存在可使信息不稳定的ATTTA基序，以及可能引起不适当的聚腺苷酸化作用的AATAAA基序。尽管核苷酸序列可以在单子叶植物和双子叶植物种类两者中充分表达，但是可以对序列进行修饰以便迎合单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(默里(Murray)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)17:477-498(1989))。此外，可针对不正常剪接位点的存在来对这些核苷酸序列筛选，这些位点可能导致信息平截(message truncation)。所有需要在核酸/核苷酸序列内进行的变化，例如上文所述的那些，都是利用定点突变、PCR、以及合成基因构建的众所周知的技术进行(参见例如，EP 0 385 962、EP 0 359 472、以及WO 93/07278)。
在一些实施例中，本发明提供包含本发明的核酸分子的转基因非人类宿主细胞。非人类宿主细胞可以包括但不限于植物细胞、细菌细胞、真菌(例如，酵母)细胞或昆虫细胞。在一些实施例中，转基因宿主细胞是转基因植物细胞或转基因细菌细胞。在一些实施例中，植物细胞是非繁殖细胞。
在一些实施例中，本发明提供包含本发明的核酸分子的植物、植物部分和/或植物细胞。可用于本发明的植物的非限制性实例包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、甘蓝类作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物植物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、草类(草坪草、观赏草)、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。
在具体实施例中，本发明的植物、植物部分或植物细胞可以是高粱、小麦、向日葵、番茄、甘蓝类作物、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜和/或玉米。在一些实施例中，植物是玉米。在一些实施例中，植物是大豆。
在代表性实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是玉米，且由植物产生的Vip3多肽具有针对来自以下目的昆虫有害生物的杀有害生物性：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、或它们的任何组合。在一些实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是玉米，且由植物产生的Vip3多肽具有针对来自鳞翅目的昆虫有害生物的杀有害生物性。在一些实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是玉米，且由植物产生的Vip3多肽具有针对以下的杀有害生物性：例如，玉米螟(欧洲玉米螟)、草地贪夜蛾(秋粘虫)、小地老虎(black cutworm)、西部灰地老虎(pale western cutworm)、西部豆夜蛾(western bean cutworm)、美洲棉铃虫(玉米穗虫)、甜菜夜蛾(beet armyworm)、澳洲棉铃虫(土著芽虫)、棉铃实夜蛾(棉铃虫)、巨座玉米螟(西南玉米秆草螟)、小蔗杆草螟(甘蔗螟)、南美玉米苗斑螟(小玉米茎蛀虫)、或它们的任何组合。在一些实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是玉米，且由植物产生的Vip3多肽具有针对以下的杀有害生物性：玉米螟(欧洲玉米螟)、草地贪夜蛾(秋粘虫)、美洲棉铃虫(玉米穗虫)或小地老虎(black cutworm)或它们的任何组合。
在代表性实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是大豆，且由植物产生的Vip3多肽具有针对来自以下目的昆虫有害生物的杀有害生物性：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、或它们的任何组合。在一些实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是大豆，且由植物产生的Vip3多肽具有针对来自鳞翅目的昆虫有害生物的杀有害生物性。在一些实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是大豆，且由植物产生的Vip3多肽具有针对以下的杀有害生物性：例如，草地贪夜蛾(秋粘虫)、小地老虎(black cutworm)、西部灰地老虎(pale western cutworm)、美洲棉铃虫(玉米穗虫)、烟芽夜蛾(烟草夜蛾)、甜菜夜蛾(beet armyworm)、澳洲棉铃虫(土著芽虫)、棉铃实夜蛾(棉铃虫)、粉纹夜蛾(cabbage looper)、南美玉米苗斑螟(小玉米茎蛀虫)、大豆尺夜蛾(大豆夜蛾)、黎豆夜蛾(黎豆毛虫)、苜蓿绿夜蛾(green cloverworm)、向日葵同斑螟(sunflower head moth)或向日葵细卷叶蛾(banded sunflower moth)或它们的任何组合。在一些实施例中，包含本发明的核酸分子并表达Vip3多肽的植物是大豆，且由植物产生的Vip3多肽具有针对以下的杀有害生物性：玉米螟(欧洲玉米螟)、草地贪夜蛾(秋粘虫)、美洲棉铃虫(玉米穗虫)或小地老虎(black cutworm)或它们的任何组合。
在一些实施例中，病毒如杆状病毒可在其基因组中包含编码本发明的修饰的Vip3多肽的多核苷酸。所述重组病毒可在感染适合于病毒复制和该多核苷酸表达的真核细胞后表达大量相应的修饰的Vip3多肽。由此产生的杀有害生物多肽可用作杀有害生物剂或杀虫剂。可替代地，经工程化以包括本发明的一种或多种多核苷酸的病毒(例如，杆状病毒)可用于体内感染昆虫，并通过表达杀有害生物多肽或者病毒感染与表达杀有害生物多肽的组合杀死它们。
细菌细胞也可以是用于表达本发明的核酸的宿主。在一个实施例中，使用了能够在植物组织内生活并复制的非致病的共生细菌(所谓的内生植物)，或能够定居在叶际或根际的非致病的共生细菌(所谓的附生植物)。此类细菌包括以下属的细菌：农杆菌属、产碱菌属、固氮螺菌属、定氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文菌属、黄杆菌属、克雷白菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、沙雷菌属、链霉菌属以及黄单胞菌属。共生的真菌(例如木霉属以及胶枝霉属)也是为了相同目的表达本发明的核酸的可能的宿主。
因此，在一些实施例中，作为生物杀有害生物控制剂，本发明的杀有害生物多肽可通过在能够表达多核苷酸的异源宿主细胞中表达编码本发明多肽的多核苷酸来产生。因此，在一些实施例中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的酵母、细菌或植物细胞。
用于转化多种有机体/宿主细胞的技术在本领域中是已知的。例如，表达载体pKK223-3以及pKK223-2可以用来在大肠杆菌中(在转录或翻译融合中)在tac或trc启动子之后表达异源基因。为了表达编码多个ORF的操纵子，一个操作是在转录融合中将该操纵子插入一种载体(如pKK223-3)中，允许对该异源基因的同源核糖体结合位点进行利用。在革兰氏阳性种类(如芽孢杆菌属)中的过表达技术在本领域中也是已知的，并且可在本发明的背景中使用(夸克斯(Quax)等人，工业微生物：基础与应用分子遗传学(Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics)，编者巴尔茨(Baltz)等人，美国微生物学会(American Society for Microbiology),华盛顿(1993))。用于过表达的替代性系统依赖于(例如)酵母载体，并包括毕赤酵母属、酵母属和/或克鲁维酵母属的使用(斯瑞克沙纳(Sreekrishna)，工业微生物：基础与应用分子遗传学(Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics)，巴尔茨(Baltz)、赫格曼(Hegeman)和斯卡图德(Skatrud)编，美国微生物学会，华盛顿(1993)；德坎和巴尔(Dequin&Barre),生物技术(Biotechnology)L2:173-177(1994)；范登博格(van den Berg)等人，生物技术8:135-139(1990))。
用于转化植物的程序在本领域中是熟知且常规的并且普遍描述于文献中。用于植物转化的方法的非限制性实例包括通过以下各项的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由农杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、渗入、PEG介导的核酸吸收、以及使得核酸引入到植物细胞中的任何其他电学的、化学的、物理的(机械的)和/或生物的机制，包括其任意组合。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括三木(Miki)等人，(“将外源DNA引入植物中的程序(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants)”在植物分子生物学和生物技术(Plant Molecular Biology and Biotechnology)的方法中，格里克(Glick)、B.R.和汤普森(Thompson)、J.E.编(CRC出版有限公司，波卡拉顿，1993)，第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(细胞分子生物学快报(Cell.Mol.Biol.Lett.)7:849-858(2002))。
对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体是适合的，而对于直接基因转移(例如，微粒轰击等)，任何载体都是适合的，并且仅含有感兴趣的构建体的线性DNA可以是优选的。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(斯科切尔(Schocher)等人，生物技术(Biotechnology)4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转移二者，转化通常(但不是必需的)用一种选择性标记进行，该选择性标记可以是正向选择(磷甘露糖异构酶)，提供对抗生素(卡那霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)或除草剂(草甘膦或巴斯塔(basta))的抗性。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。
农杆菌介导的转化是一种用于转化植物、尤其是双子叶植物的普遍使用的方法，因为它的高转化效率以及因为它对于许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外来DNA的二元载体转移到适当的农杆菌菌株，这可能取决于由宿主农杆菌菌株或者在共同存在的Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补序列(乌肯斯(Uknes)等人，(1993)植物细胞(Plant Cell)5:159-169)。该重组二元载体向农杆菌中的转移可以利用携带该重组二元载体的大肠杆菌、辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株中的质粒)通过一种三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移到农杆菌中(和威尔米策(Willmitzer)(1988)核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:9877)。
通过重组农杆菌进行的植物转化通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域熟知的方法。在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。
如先前所讨论的，另一种用于转化植物、植物部分和植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物活性的粒子。参见例如，美国专利号4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供在其内部中的结合的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕以使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自含有一种或多种被试图引入的核酸)推进到植物组织中。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸可以被直接转化进质体基因组中。质体转化的一种主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需实质性的修饰，而且质体能够在一种单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在麦克布莱德(McBride)等人(1994)美国国家科学院院刊(Proc.Nati.Acad.Sci.USA)91，7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及将位于选择性标记侧翼的克隆的质体DNA区连同感兴趣的基因一起引入适合的靶组织中，这是(例如)使用生物射弹(biolistic)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)来进行的。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰该原质体(plastome)的特定区域。最初，可以将叶绿体16S rRNA和rps12基因(赋予针对大观霉素和/或链霉素的抗性)的点突变用作供转化用的选择性标记(斯瓦布，Z.(Svab,Z.)、海杜凯维奇，P.(Hajdukiewicz,P.)和马利加，P.(Maliga,P.)(1990)美国国家科学院院刊87，8526-8530)；斯托布，J.M.(Staub,J.M.)和马利加，P.(1992)植物细胞(Plant Cell)4，39-45)。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的引入(斯托布，J.M.(Staub,J.M.)和马利加，P.(Maliga,P.)(1993)欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)12，601-606)。转化效率的实质性增加可以通过用显性的选择性标记(对大观霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷转移酶进行编码的细菌aadA基因)置换隐性的rRNA或r蛋白抗生素抗性基因而获得(斯韦伯，Z.(Svab,Z.)和马利加，P.(Maliga,P.)(1993)美国国家科学院院刊90，913-917)。先前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻这种绿藻的质体基因组的高频率转化(戈尔德施密特-克莱蒙特，M.(Goldschmidt-Clermont,M.)(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.)19:4083-4089)。有用于质体转化的其他选择性标记在本领域是已知的，并且被包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大致15-20个细胞分裂循环以便达到一种同质状态。质体表达(其中多种基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个实施例中，可以将本发明的多核苷酸插入质体靶向载体中并转化进所希望的植物宿主的质体基因组中。因此，可以获得与包含本发明的核苷酸序列的质体基因组同型的植物，这些植物能够高表达该多核苷酸。
选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于本文提供的本发明的方法中。
因此，可以按本领域熟知的任何数目的方法(如上所述的)将多核苷酸引入该植物、植物部分和/或植物细胞中。因此，没有依赖用于将一种或多种多核苷酸引入植物中的具体方法，相反可以使用允许该一种或多种多核苷酸获准进入该植物的至少一种细胞内部的任何方法。在有待引入一种以上多核苷酸的情况下，这些对应的多核苷酸可以作为单一核酸分子的部分、或者作为分开的核酸分子而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸分子上。因此，可以在单一转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分在植物中，将这些多核苷酸引入感兴趣的细胞中。
在本发明的一些实施例中，如果引入的核酸分子被结合到非染色体自主复制子中或被整合到该植物的一条或多条染色体中，其可以稳定地维持在该植物细胞中。可替代地，引入的核酸分子可以存在于染色体外非复制型载体上并且可以短暂地表达或短暂地具有活性。不论是存在于染色体外非复制型载体中或整合到一个染色体中的载体中，该核酸分子可以存在于一个植物表达盒中。植物表达盒可以含有在植物细胞中驱动基因表达的调节序列，其中这些调节序列操作地连接，从而每个序列可以实现其功能，例如，通过多腺苷酸化信号终止转录。示例性多腺苷酸化信号可以是起源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的那些，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合酶(吉耶朗(Gielen)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3:835(1984))或其功能等效物的基因，但是植物中的所有其他具有功能活性的终止子也是合适的。本发明的一个植物表达盒还可以包含其他可操作地连接的序列，像增强每RNA比率多肽的翻译增强子，例如含有来自烟草花叶病毒的5’-非翻译前导序列的超速驱动序列(overdrive-sequence)，(加利(Gallie)等人，核酸研究(Nucl.Acids Research)15:8693-8711(1987))。
此外，如本领域中所熟知的，完整的转基因植物可以使用多种已知技术中的任何技术从转化的植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体再生而来。来自植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体的植物再生描述在例如埃文斯(Evans)等人，(植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Cultures),卷1，麦克米伦出版公司(MacMilan Publishing Co.)纽约(1983))；和瓦西尔I.R.(Vasil I.R.)(编)(植物的细胞培养和体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants),学术出版社(Acad.Press)，奥兰多，第I卷(1984)和第II卷(1986))中。
另外，工程化进以上所述的本发明的转基因种子和植物、植物部分和/或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长来传递，并且因此可以在子代植物中维持并传代。通常，维持和传代利用了被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)的已知农业方法。
因此，本发明提供包含核酸分子的转基因植物、植物部分和植物细胞和由此再生的植物，该核酸分子包含编码本发明的修饰的Vip3多肽的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，转基因植物、植物部分或植物细胞是选自下组植物，该组由以下各项组成：高粱、小麦、向日葵、番茄、甘蓝类作物、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜和玉米。
在本发明的一些实施例中，可以提供从本发明的转基因细胞、植物和/或植物部分产生的收获产物，以及由所述收获产物产生的加工产物。收获产物可以是全株植物或任何植物部分，如本文描述的，其中所述收获产物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列或多肽。因此，在一些实施例中，收获的产物的非限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花药、柱头等)、叶、茎、茎秆、根、块茎等。在特定实施例中，收获产物是种子，其中该种子在其基因组中包含本发明的一种或多种核酸分子/一种或多种核苷酸序列和/或一种或多种多肽。
在一些实施例中，加工产物包括但不限于面粉、粗粉、油、淀粉、糖、纤维、生物燃料或谷类制品等、或由此产生的产物。在一些实施例中，加工产物是来自种子的提取物，其中该提取物包含本发明的核酸分子、核苷酸序列或多肽。在一些实施例中，加工产物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列或多肽。
在一些实施例中，本发明进一步提供了一种包含在农田中栽种在一起的多个本发明的植物的作物。在一些实施例中，本发明提供一种包含在高尔夫球场、住宅草坪、路边、田径场和/或娱乐场地中栽种在一起的多个本发明的转基因植物的作物。
本文还提供使用本发明的修饰的Vip3多肽和/或编码所述修饰的Vip3多肽的核酸分子/多核苷酸的方法。
因此，在一些实施例中，提供一种产生对一种或多种有害生物具有增加的抗性或耐受性的植物、植物部分或植物细胞的方法，该方法包括将包含编码本发明的一种或多种修饰的Vip3多肽的一种或多种核苷酸序列的一种或多种核酸分子引入植物、植物部分或植物细胞，以产生表达该一种或多种核酸分子的转基因植物、植物部分或植物细胞，从而该转基因植物、植物部分或植物细胞表达一种或多种修饰的Vip3多肽并与不包含所述一种或多种核酸分子的植物、植物部分或植物细胞相比提高了所述转基因植物、植物部分或植物细胞中对一种或多种有害生物的抗性或耐受性。在一些实施例中，该方法包括从所述转基因植物细胞或植物部分再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该一种或多种核酸分子，并且具有提高的杀有害生物活性。
在另一方面，提供一种提高植物、植物部分或植物细胞中的杀有害生物活性的方法，该方法包括将包含编码本发明的一种或多种修饰的Vip3多肽的一种或多种核苷酸序列的一种或多种核酸分子引入植物、植物部分或植物细胞，以产生表达该一种或多种核酸分子的转基因植物、植物部分或植物细胞，从而该转基因植物、植物部分或植物细胞表达(产生)一种或多种修饰的Vip3多肽并与不包含所述一种或多种核酸分子的植物、植物部分或植物细胞相比提高了该转基因植物、植物部分或植物细胞中的杀有害生物活性。在一些实施例中，该方法包括从所述转基因植物细胞或植物部分再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该一种或多种核酸分子，并且具有提高的杀有害生物活性。
在一些实施例中，提供一种为农民提供控制植物有害生物的方式的方法，该方法包括为该农民提供植物材料或细菌，所述植物材料或细菌包含编码本发明的修饰的Vip3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，提供了一种产生本发明的修饰的Vip3多肽的方法，该方法包括以下步骤：(a)用包含编码修饰的Vip3多肽的核苷酸序列的重组核酸分子转化宿主细胞；并且(b)在宿主细胞表达重组核酸分子的条件下培养步骤(a)的宿主细胞，从而产生该修饰的Vip3多肽。
在本发明的一些实施例中，提供了一种产生修饰的Vip3多肽的方法，该方法包括在允许表达该修饰的Vip3多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；并且回收该修饰的Vip3多肽。
在一些实施例中，一种减少转基因植物中由植物有害生物引起的损伤的方法，该方法包括种植包含表达本发明的修饰的Vip3多肽的核酸分子的转基因植物种子，从而减少有害生物对由转基因植物种子培养的转基因植物造成的损伤。在一些实施例中，该一种或多种核酸分子包含在表达盒或重组载体中。
在本文描述的任一实施例中，本发明的核酸分子可包含在一种或多种表达盒和/或载体中，其中所述核酸分子与一个或多个在宿主细胞(例如，植物、细菌等)中发挥功能的启动子(和/或其他调节元件)可操作地关联。在一些实施例中，该一种或多种表达盒或载体可包含选择性标记。在一些实施例中，该一种或多种表达盒或载体不包含选择性标记。
在一些实施例中，本发明提供一种控制有害生物的方法，该方法包括使这些有害生物与杀有害生物有效量的本发明组合物接触。在本发明的一些实施例中，提供一种保护植物和/或植物繁殖材料的方法，该方法包括使该植物和/或植物繁殖材料接触杀有害生物有效量的本发明组合物。
本发明的修饰的Vip3多肽可与其他杀有害生物成分或作物保护产品(即杀有害生物活性成分)组合使用，以增加有害生物目标范围。因此，修饰的Vip3多肽可与性质不同的其他杀有害生物成分组合使用，以预防和/或管理昆虫抗性。其他的杀虫成分包括例如蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸型两者)、凝集素、α-淀粉酶、过氧化物酶以及胆固醇氧化酶。相似地，Cry蛋白，如CryIA、CryIB和CryIC家族中的蛋白也可以与本发明的修饰的Vip3蛋白质组合使用。
可以通过将植物遗传工程化以包含并表达所有的必需基因来实现多于一种杀虫成分在同一个转基因植物或植物部分(例如，种子)中的共表达。可替代地，可以将一种植物(亲本1)遗传工程化，用于本发明的基因的表达。可以将一种第二植物(亲本2)遗传工程化，用于一种补充性虫控制成分的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达被引入至亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物。
还可以用杀有害生物活性成分/作物保护产品处理本发明的转基因植物或植物部分或转基因种子。当本发明的杀有害生物活性成分以及转基因植物或转基因部分或转基因种子具有针对同一种目标昆虫的活性时，该组合(i)在用于增强本发明的修饰的Vip3多肽针对目标昆虫的活性的方法中以及(ii)在用于通过提供针对该目标昆虫的第二作用机制而防止对本发明的修饰的Vip3多肽产生抗性的方法中是有用的。因此，本发明提供了一种增强活性的方法，这种活性对抗或防止在目标昆虫中产生抗性，该方法包括例如将杀虫种子包衣(如在美国专利号5,849,320和5,876,739中所述的，通过引用结合在此)施用至包含本发明的一种或多种修饰的Vip3多肽的转基因种子上。
因此在一个实施例中，本发明包括通过提供本发明的转基因植物或转基因植物部分(例如转基因种子)并且将杀有害生物活性成分/作物保护产品施用至该转基因植物、植物部分或种子来控制作物有害生物的方法。在这种情况下，本发明的修饰的Vip3多肽针对目标昆虫的活性被增强，以及(ii)在用于通过提供针对该目标昆虫的第二作用机制而防止对本发明的修饰的Vip3多肽产生抗性的方法中。另外，可以将作物保护产品施用至转基因植物或植物部分，以增加通过施加有效对抗其他作物有害生物的作物保护作用控制的作物有害生物的数量。
此类可施加至如上文所述的本发明的转基因植物和/或转基因植物部分(例如，种子)的活性成分包括但不限于(1)乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，例如氨基甲酸酯，例如棉铃威、涕灭威、涕灭砜威、除害威、灭害威、恶虫威、丙硫克百威、合杀威、畜虫威、丁酮威、丁酮砜威、西维因、卡巴呋喃、丁硫克百威、地虫威、敌蝇威、乙硫苯威、仲丁威、苯硫威、伐虫脒、呋线威、叶蝉散、威百亩、灭虫威、灭多虫、速灭威、草氨酰、抗蚜威、猛杀威、残杀威、硫双威、久效威、混杀威、XMC和灭杀威；或有基磷酸酯，例如高灭磷、甲基吡啶磷、谷硫磷(-甲基、-乙基)、溴硫磷-乙基、溴苯烯磷(-甲基)、特喃硫磷、硫线磷、三硫磷、氯氧磷、毒虫畏、氯甲磷、毒死蜱(-甲基/-乙基)、蝇毒磷、苯腈膦、杀螟腈、毒虫畏、内吸磷-5-甲基、内吸磷-5-甲基砜、氯亚胺硫磷、二嗪农、除线磷、敌敌畏/DDVP、百治磷、乐果、甲基毒虫畏、蔬果磷、地虫硫、EPN、乙硫磷、灭线磷、乙嘧硫磷、氨磺磷、克线磷、杀螟硫磷、丰索磷、倍硫磷、吡氟硫磷、地虫磷、安果、丁苯硫磷、噻唑磷、庚烯磷、碘硫磷、异稻瘟净、氯唑磷、异柳磷、O-水杨酸异丙酯、异恶唑磷、马拉松、灭蚜磷、虫螨畏、甲胺磷、杀扑磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、氧乐果、砜吸磷(oxydemeton-methyl)、对硫磷(-甲基/-乙基)、稻丰散、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、磷虫威、辛硫磷、嘧啶磷(-甲基/-乙基)、丙溴磷、丙虫磷、胺丙畏、丙硫磷、发硫磷、吡唑硫磷、哒嗪硫磷、哒硫磷、喹硫磷、克线丹、硫特普、硫丙磷、丁基嘧啶磷、双硫磷、特丁磷、杀虫畏、甲基乙拌磷、三唑磷、敌百虫、蚜灭多和伊米塞弗。(2)GABA-门控氯离子通道拮抗剂，例如有机氯，如毒杀芬、氯丹、硫丹、γ-HCH、HCH、七氯、林丹以及甲氧氯；或fiproles(苯基吡唑)，例如乙酰虫腈、乙虫腈、氟虫腈、吡嗪氟虫腈、吡啶氟虫腈、氟吡唑虫。(3)钠通道调节剂/电压依赖的钠通道阻断剂，例如拟除虫菊酯，如氟酯菊酯、烯丙菊酯(d-顺式-反式、d-反式)、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、生物烯丙菊酯、生物烯丙菊酯-S-环戊基异构体、苄呋烯菊酯、生物氯菊酯、除虫菊酯、二氯炔戊菊酯、顺式-氯氰菊酯、顺式-苄呋菊酯、顺式-氯菊酯、氰菊酯、乙腈菊酯、氟氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯(α-、β-、θ-、ζ-)、苯醚氰菊酯、溴氰菊酯、烯炔菊酯(1R异构体)、高氰戊菊酯、醚菊酯、五氟苯菊酯、甲氰菊酯、吡氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟溴氰菊酯、氟氰菊酯、三氟醚菊酯、氟氯苯菊酯、氟胺氰菊酯、扫螨宝、γ-三氯氟氰菊酯、炔咪菊酯、克敌菊酯、λ-三氯氟氰菊酯、甲氧苄氟菊酯、氯菊酯(顺式-、反式-)、苯氧司林(1R-反式异构体)、右旋丙炔菊酯、丙氟菊酯、普洛特立芬(protrifenbute)、反灭虫菊、灭虫菊、RU15525、氟硅菊酯、τ-氟胺氰菊酯、七氟菊酯、环戊烯丙菊酯、胺菊酯(1R异构体)、四溴菊酯、四氟菊酯、ZXI 8901、除虫菊酯(除虫菊)、eflusilanat；DDT；或甲氧氯。(4)烟碱能乙酰胆碱受体激动剂/拮抗剂，例如Chloronicotinyls，如啶虫脒、噻虫胺、呋虫胺、吡虫啉、氯噻啉、烯啶虫胺、硝虫噻嗪、噻虫嗪、AKD-1022、烟碱、杀虫磺、杀螟丹、杀虫双、以及thiocylam。(5)变构乙酰胆碱受体调节剂(激动剂)，例如多杀霉素(spinosyns)，如多杀菌素以及乙基多杀菌素。(6)氯离子通道激活剂，例如菌素(mectins)/大环内酯，例如阿维菌素、甲氨基阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、伊维菌素、雷皮菌素和弥拜菌素；或保幼激素类似物，例如烯虫乙酯、烯虫炔酯、甲氧普林、保幼醚、烯虫硫酯、苯氧威、吡丙醚和苯虫醚。(7)具有未知或非特异性作用机制的活性成分，例如熏蒸剂，例如溴化甲烷、三氯硝基甲烷和硫酰氟；选择性拒食素，例如，冰晶石、吡蚜酮、新喹唑啉类杀虫剂(pyrifluquinazon)和氟啶虫酰胺；或螨虫生长抑制剂，例如四螨嗪、噻螨酮、乙螨唑。(8)氧化磷酸化的抑制剂、ATP破坏剂，例如丁醚脲；有机锡化合物，例如三唑锡、环己锡和苯丁锡；或克螨特、四氯杀螨砜。(9)破坏H-质子梯度氧化磷酸化去耦合剂，例如溴虫腈、乐杀螨、敌螨通、敌螨普以及DNOC。(10)虫肠膜的微生物干扰剂，例如苏云金杆菌菌株。(11)甲壳质生物合成抑制剂，例如苯甲酰脲，例如bistrifluoron、定虫隆、除虫脲、氟佐隆、氟螨脲、氟虫脲、氟铃脲、虱螨脲、双苯氟脲、多氟脲、氟幼脲、伏虫脲或杀虫脲。(12)噻嗪酮。(13)蜕皮干扰剂，例如环丙马秦。(14)蜕皮素激动剂/干扰剂，例如二酰肼，例如环虫酰肼、氯虫酰肼、甲氧虫酰肼、虫酰肼、以及呋喃虫酰肼(JS118)；或印楝素。(15)章鱼胺能激动剂，例如双甲脒；(16)位点III电子传递抑制剂/位点II电子传递抑制剂，例如氟蚁腙；灭螨醌；嘧螨酯；或丁氟螨酯和腈吡螨酯。(17)电子传递抑制剂，例如来自METI杀螨剂的组的位点I电子传递抑制剂，例如喹螨醚、唑螨酯、嘧螨醚、哒螨酮、吡螨胺、唑虫酰胺、以及鱼藤酮；或电压依赖的钠通道阻断剂，例如茚虫威以及氰氟虫腙。(18)脂肪酸生物合成抑制剂，例如特窗酸(tetronic acid)衍生物，例如季酮螨酯以及螺甲螨酯；或特特拉姆酸衍生物，例如螺虫乙酯。(19)具有未知作用机制的神经元抑制剂，例如联苯肼酯。(20)利阿诺定受体效应剂，例如二酰胺，如氟虫酰胺、(R)-、(S)-3-氯-N1位取代-{2-甲基-4-[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)-乙基]苯基}-N2位取代-(1-甲基-2-甲基磺酰基乙基)酞酰胺、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)或氰虫酰胺(Cyazypyr)。(21)具有未知作用机制的另外的活性成分，例如磺胺螨酯、benclothiaz、苯螨特、溴螨酯、噻嗪酮、灭螨猛、杀虫脒、乙酯杀螨醇、氯噻苯、cycloprene、开乐散、地昔尼尔、fenoxacrim、氟硝二苯胺、氟螨噻、嘧虫胺、氟螨嗪、红铃虫性诱剂、日本弧丽跋素、恶虫酮、石油、油酸钾、啶虫丙醚、氟虫胺、杀螨好、苯螨噻、或增效炔醚；或以下已知的活性化合物：4-{[(6-溴代吡啶-3-基)甲基](2-氟代乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从WO 2007/115644获知)、4-{[(6-氟代吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从WO 2007/115644获知)、4-{[(2-氯-1,3-噻唑-5-基)甲基](2-氟代乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从WO 2007/115644获知)、4-{[(6-氯代吡啶-3-基)甲基](2-氟代乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从WO 2007/115644获知)、4-{[(6-氯代吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从WO 2007/115644获知)、4-{[(6-氯-5-氟代吡啶-3-基)甲基](甲基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从获知WO 2007/115643)、4-{[(5,6-二氯代吡啶-3-基)甲基](2-氟代乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从WO 2007/115646获知)、4-{[(6-氯-5-氟代吡啶-3-基)甲基](环丙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从WO 2007/115643获知)、4-{[(6-氯代吡啶-3-基)甲基](环丙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从EP-A-0 539 588获知)、4-{[(6-氯代吡啶-3-基)甲基](甲基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(从EP-A-0 539 588获知)、[(6-氯代吡啶-3-基)甲基](甲基)氧-λ4位取代-亚硫烷基氨腈(从WO 2007/149134获知)、[1-(6-氯代吡啶-3-基)乙基](甲基)氧-λ4位取代-亚硫烷基氨腈(从WO 2007/149134获知)以及它的非对映异构体(A)和(B)(同样从WO 2007/149134获知)、[(6-三氟甲基吡啶-3-基)甲基](甲基)氧-λ4位取代-亚硫烷基氨腈(从WO 2007/095229获知)、或[1-(6-三氟甲基吡啶-3-基)乙基](甲基)氧-λ4位取代-亚硫烷基氨腈(从WO 2007/149134获知)以及它的非对映异构体(C)和(D)，称为氟啶虫胺腈(同样从WO 2007/149134获知)。
现在将参考以下实例描述本发明。应了解，这些实例并不旨在将权利要求书的范围限于本发明，而是旨在成为某些实施例的示例。技术人员想到的所例举的方法中的任何变型旨在属于本发明的范围内。
实例
实例1.Vip3D突变体中(10His-Vip3D-AAPF；P021)的结构域交换
10His-Vip3D-AAPF(P012)中的一百二十六个氨基酸(SEQ ID NO:6)被来自β-1,4甘露聚糖酶(ManA)的碳水化合物结合模块替换，该酶来自解多糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum)(解多糖嗜热厌氧细菌(Caldanaerobius polysaccharolyticus))。因此，将对应于来自GenBank ID:AAD09354.1的CBM的137个氨基酸(620EGGVNMVSNP GFEDGLDSWQ DWQQDMSAVP EAAHNGALGL KIGGGKAAGG GQDIPLKPNT TYILGAWAKF DSKPAGTFDV VVQYHLKDAN NTYVQHILNF NETDWTYKQL LFTTPDVFGS TPQLALWKGD TSKANLYVDD VYLVEV 756)(SEQ ID NO:24)插入P021的氨基酸542-667(542GSIEEDNLEP WKANNKNAYV DHTGGVNGTK ALYVHKDGGF SQFIGDKLKP KTEYVIQYTV KGKPSIHLKD ENTGYIHYED TNNNLKDYQT ITKRFTTGTD LKGVYLILKS QNGDEAWGDK FTILEI 667)(SEQ ID NO:6，aa 542-667)的位置中。该设计是基于Vip3D的原子级分辨率结构。
使用苏云金杆菌密码子表制备嵌合体的CBM部分。然而，因为嵌合核苷酸序列的表达在大肠杆菌中进行，所以密码子表可以是大肠杆菌密码子表或另一原核生物的密码子表。
经测定，嵌合结构域-交换突变体(称为Vip3Dd3到2ZEX)具有针对小地老虎(BCW)的活性(杀虫性)(LC50约700ng/cm2)，且具有针对秋粘虫(FAW)和西部玉米根虫(WCR)的部分活性。
实例2.P021中另外的结构域III交换
基于Vip3Dd3到2ZEX的成功，来自真细菌β-1,4甘露聚糖酶的八个其他CBM取代来自P021序列的Vip3D结构域III(氨基酸542-667)(Vip3Dd3)。所使用的八个CBM是SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。一个结构域交换(Vip3Dd3交换为1WKy(SEQ ID NO:15)在表达后不溶于大肠杆菌中，但是剩下的7个在作为大肠杆菌可溶性粗提物分析时，在7天后杀死100％BCW幼虫(表1)。
表1.饮食表面覆盖分析中大肠杆菌粗提物在第5天和第7天时针对小地老虎的功效。
图2中提供表达各种CBM Vip3D结构域III(P021)交换的裂解大肠杆菌的可溶性部分。如所示，Vip3D3d到1WKY未产生可溶性蛋白。因此，无法容易地测试这种融合物的功效。
2ZEX、2ZEZ、1OF3、1PMH、1WKY和2GBP各自来自解析结构，所述结构包含来自B型β-1,4甘露聚糖酶的碳水化合物结合模块(图3)。
除基于现有蛋白质数据库条目测试CBM交换以外，还基于它们的BLAST相似性测试来自其他β-1,4甘露聚糖酶蛋白的三种CBM融合物：CenC、gp21和PsHGF7(图4)。
表1中列出的第一交换(Vip3Dd3到2ZEZ)是来自用于Vip3Dd3到2ZEX中相同的酶(GenBank ID:AAD09354.1)的CBM。该特定甘露聚糖酶在催化结构域后具有两个串联的CBM。2ZEX是第一个CBM，随后紧接着2ZEZ。尽管明显具有相同的底物，并与相同酶连接，但2ZEZ CBM序列与2ZEX具有64％一致性。2ZEZ序列是(756GMDGWPDWGY PVSAVPEAAY GGTKGFKLSG GKQAGMGQKV ALKPNTTYIL GAWGKFTAKP GTYCDVIVQY HLKDANNTYV QNILRFTETD WTYKQVVFTT PDAFGSDPEF VLWKDDASNA DFYADNITLV EV 899)(SEQ ID NO:25)。已将2ZEX和2ZEZ归类为CBM家族16。
下文提供的是取代P021的氨基酸542至667位置的CBM序列。
2BGP GenBank：AAO31761.1内切-b1,4-甘露聚糖酶5C[纤维弧菌]。CBM35(208TAASASITAP AQLVGNVGEL QGAGSAVIWN VDVPVTGEYR INLTWSSPYS SKVNTLVMDG TALSYAFAEA TVPVTYVQTK TLSAGNHSFG VRVGSSDWGY MNVHSLKLEL LG 319)(SEQ ID NO:28)
1OFE是来自海栖热袍菌内切β-1,4甘露聚糖酶的C-端176个氨基酸。已将它归为CBM家族27。将NP_229032氨基酸(505DFSSPEEVKN WWNSGTWQAE FGSPDIEWNG EVGNGALQLN VKLPGKSDWE EVRVARKFER LSECEILEYD IYIPNVEGLK GRLRPYAVLN PGWVKIGLDM NNANVESAEI ITFGGKEYRR FHVRIEFDRT AGVKELHIGV VGDHLRYDGP IFIDNVRLYKR 665)(SEQ ID NO:26)克隆到Vip3D结构域3中。
1PMH.CBM27-1.GenBank：AAC44232.1.解糖热解纤维素菌β-1,4甘露聚糖酶。
(45DFEDGTVMSF GEAWGDSLKC IKKVSVSQDL QRPGNKYALR LDVEFNPNNG WDQGDLGTWI GGVVEGQFDF TGYKSVEFEM FIPYDEFSKS QGGFAYKVVI NDGWKELGSE FNITANAGKK VKINGKDYTV IHKAFAIPED FRTKKRAQLV FQFAGQNSNY KGPIYLDNVR IRPE 218)(SEQ ID NO:27)
1WKY.CBM59.β-1,4-甘露聚糖酶。解糖热解纤维素菌。(碱性甘露聚糖酶)(Amn5)。GenBank：AAC44232.1；(345DFEESTQGWT GSSLSRGPWT VTEWSSKGNH SLKADIQMSS NSQHYLHVIQ NRSLQQNSRI QATVKHANWG SVGNGMTARL YVKTGHGYTW YSGSFVPING SSGTTLSLDL SNVQNLSQVR EIGVQFQSES NSSGQTSIYI DNVIVE 490)(SEQ ID NO:32)
CenC.碳水化合物结合。CenC结构域蛋白[类芽孢杆菌属物种JDR-2]。NCBI参考序列：YP_003011283.1.；(202PGLEDGINNW QAWGEGFTAA SDMSHTGSAS LKVLLNNGGR QVVALQPGKS YKLGVWGKTA GTGTGTQTAT VMINYKKPED DSSHTYGSFQ FGPDNSEFTY KEITFETPDD MAQEWGTQFV SIWSEGADQV YLDDFTLSEV 341)(SEQ ID NO:30)
Gp21.Gp21[肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种HS11286]。NCBI参考序列：YP_005220866.1.；(69PSFERGTEGY TGWSGIATVV TLQVPHLGTK AAKLAAGGSA GVGQKISFKK DRSYKIGIWA KQDPNTTIQS TDNTKFRVAD GNGLIASKAY GPFTSNWQEV SWTWKATKDV LADVQFTAFL SAGAMYFDDF YVVDV 203)(SEQ ID NO:29)
PsHGF7.碳水化合物结合结构域蛋白[类芽孢杆菌属物种HGF7]。NCBI参考序列：WP_009674454.1。
(66PGFEDNLASW TNWGNTSSVT SPAFAGAKAA RIASGEGGAG QIIPGIPSGT TYVLSGHGSV SAGTDTAIVG VDCLDANNNV LAKNTLRFNQ TLYEFKSTAF TTVPGTAKLQ VYIYKNADSG ANAFLDDLSL VEV 195)(SEQ ID NO:31)
图6A-6C中提供取代示意图。
实例3.活性谱测试
通过镍亲和色谱法纯化所有可溶性构建体。蛋白质交换进入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在L1-L2阶段通过针对各种鳞翅目物种的饮食覆盖进行测试(n＝12)。测试两个剂量：32μg/cm2和1μg/cm2。对照是纯化的P021，它是带有10-组氨酸标签的Vip3D，氨基酸AAPF在活性位点被取代(SEQ ID NO:6)；以及缓冲液对照(PBS)。测试每种构建体针对欧洲玉米螟(ECB)、玉米穗虫(CEM)、小地老虎(BCW)和秋粘虫(FAW)的活性。下表2中提供活性测试结果。
表2.P012交换针对欧洲玉米螟(ECB)、玉米穗虫(CEM)、小地老虎(BCW)和秋粘虫(FAW)的活性。
交换β-1,4甘露聚糖酶B型CBM序列替代Vip3D结构域III的结果很明显。利用纯化蛋白质观察到广谱鳞翅目控制。某些嵌合体在特定剂量下对任何给定昆虫具有或多或少的毒性。例如，Vip3Dd3_到_GP21显现是融合物中对测试的特定昆虫毒性最大的一种。然而，其针对CEW的毒性小于Vip3Dd3_到_2ZEX。这些嵌合体有可能可用于控制多种鳞翅目和其他农业有害生物。
实例4.Vip3A交换
将如实例1和2中所述与P021的结构域III交换的相同CBM结构域与Vip3A多肽的结构域III交换。将CBM结构域克隆到Vip3A骨架的与Vip3D P021中相同的接合点(例如，氨基酸541和668)上。Vip3A蛋白在活化位点中不具有AAPF变化，且不包含如P021中一样的N-端组氨酸标签。由于缺少单柱纯化步骤，使用大肠杆菌可溶性粗提物饮食覆盖进行谱测试。这些构建体在粗提物中表达良好，且因此这些分析是高剂量测试。空载体大肠杆菌粗提物被包括作为对照。下表3中提供结果。
SDS-PAGE凝胶示出，几乎所有蛋白质都高度可溶，例外是2ZEX和1OFE嵌合体(图5)。这两种构建体确实表达了一些可溶性蛋白且有活性，如表3(下文)中所示。
表3.Vip3A结构域III交换针对欧洲玉米螟(ECB)、玉米穗虫(CEM)、小地老虎(BCW)和秋粘虫(FAW)的活性。
结果显示，在Vip3A中相同CBM交换对广泛的鳞翅目控制是有效的。ECB中的总体模式与高剂量Vip3D交换相似，且2ZEZ和GP21活性最大。测试的其他3种昆虫物种对这些融合物也具有高度敏感性。然而，1OFE交换只对BCW有毒性。凝胶分析指示，1OFE的表达水平比其他多数蛋白质要低得多(图5)，这可以解释异常失活。2ZEX融合物的表达水平也较低，但对所有昆虫幼虫示出高活性，ECB除外。
以上实例中的数据显示，来自β1,4甘露聚糖酶的B型碳水化合物结合模块可交换替代Vip3多肽的结构域III，以产生活性毒素。这些毒素对测试的四种鳞翅目物种示出不同活性，大多数杀死FAW、CEW和BCW。ECB被两种嵌合体有效靶标。Vip3D和Vip3A两者均充当这些设计的良好骨架，并产生有差别的活性。测试的昆虫是可通过本发明构建体控制的类型的示例。另外，交换Vip3多肽的结构域III的具体CBM也是可用于本发明的CBM结构域类型的示例。因此，当引入Vip3多肽中或与Vip3多肽的结构域III交换时，任何β-1,4甘露聚糖酶CBM，特别是任何β-1,4甘露聚糖酶B型CBM可用于本发明。另外，在一些实施例中，当引入Vip3多肽中或与Vip3多肽的结构域III交换时，与SEQ ID NO:24至32中的任一氨基酸序列具有至少70％同源性或一致性的任何CBM都可用于本发明。
值得注意的是，除直接用本文所述组合物控制昆虫以外，构建体也可以在转基因植物中表达，为农民提供控制植物有害生物的其他工具。
以上实例清楚地说明本发明的优点。虽然已经参考某些实施例的具体细节描述本发明，但不希望此类细节被视为对本发明范围的限制，除非它们被包括在所附权利要求书中或到它们被包括在所附权利要求书中的程度。
序列表
<110> Syngenta Participations AG
Watts, Joseph
<120> 修饰的VIP3多肽
<130> 9207-116WO
<150> US 62/043,922
<151> 2014-08-29
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 788
<212> PRT
<213> 苏云金杆菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(788)
<223> Vip3D氨基酸序列
<400> 1
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Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
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Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
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Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
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Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
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Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
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Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
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Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
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Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
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Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
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Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Lys Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Lys Phe Thr Ile Leu Glu Ile Lys Pro Ala Glu Asp
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro
675 680 685
Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn
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Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser
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Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val
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Val Ser Ile Lys
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<210> 2
<211> 789
<212> PRT
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(789)
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1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
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Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
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Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
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Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
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Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
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Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
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Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
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325 330 335
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370 375 380
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435 440 445
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485 490 495
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Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
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565 570 575
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<213> 苏云金杆菌
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<221> 尚未归类的特征
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<211> 803
<212> PRT
<213> 苏云金杆菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(803)
<223> Vip3C氨基酸序列
<400> 4
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
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20 25 30
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Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 5
<211> 781
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 共有Vip3氨基酸序列
<400> 5
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
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Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
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100 105 110
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Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Ile Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
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595 600 605
Leu Lys Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
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625 630 635 640
Asp Leu Ser Gly Val His Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
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660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Ser Asn Ala Trp Ile Ser Thr Gly
675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
Val Leu Phe Glu Lys Ser Met Ser Ser Lys Asp Ile Ser Glu Ser Phe
740 745 750
Thr Thr Ala Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Ile Glu Leu Ser Arg Ser
755 760 765
Thr Ser Gly Gly Ile Ser Phe Arg Asp Val Ser Ile Lys
770 775 780
<210> 6
<211> 798
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 10His-Vip3D-AAPH氨基酸序列
<400> 6
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
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Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
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275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
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305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
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405 410 415
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420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile Glu Glu Asp Asn Leu Glu
545 550 555 560
Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asn Leu Lys Asp Tyr Gln
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Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu Ala Trp Gly Asp Lys Phe
660 665 670
Thr Ile Leu Glu Ile Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu Ser Pro Glu Leu
675 680 685
Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser Gly
690 695 700
Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln Ser
705 710 715 720
Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser Phe Thr Ala Ser
725 730 735
Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu
740 745 750
Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly Thr Phe Lys
755 760 765
Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser
770 775 780
Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
785 790 795
<210> 7
<211> 809
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021d3_到_2ZEX序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(688)
<223> 2ZEX结构域
<400> 7
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe Glu Asp Gly Leu Asp Ser
545 550 555 560
Trp Gln Asp Trp Gln Gln Asp Met Ser Ala Val Pro Glu Ala Ala His
565 570 575
Asn Gly Ala Leu Gly Leu Lys Ile Gly Gly Gly Lys Ala Ala Gly Gly
580 585 590
Gly Gln Asp Ile Pro Leu Lys Pro Asn Thr Thr Tyr Ile Leu Gly Ala
595 600 605
Trp Ala Lys Phe Asp Ser Lys Pro Ala Gly Thr Phe Asp Val Val Val
610 615 620
Gln Tyr His Leu Lys Asp Ala Asn Asn Thr Tyr Val Gln His Ile Leu
625 630 635 640
Asn Phe Asn Glu Thr Asp Trp Thr Tyr Lys Gln Leu Leu Phe Thr Thr
645 650 655
Pro Asp Val Phe Gly Ser Thr Pro Gln Leu Ala Leu Trp Lys Gly Asp
660 665 670
Thr Ser Lys Ala Asn Leu Tyr Val Asp Asp Val Tyr Leu Val Glu Val
675 680 685
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690 695 700
Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile
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Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser
725 730 735
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740 745 750
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Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn
770 775 780
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785 790 795 800
Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
805
<210> 8
<211> 809
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021d3_到2ZEZ序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(688)
<223> 2ZEZ结构域
<400> 8
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
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420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
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450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe Glu Asn Gly Met Asp Gly
545 550 555 560
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565 570 575
Gly Gly Thr Lys Gly Phe Lys Leu Ser Gly Gly Lys Gln Ala Gly Met
580 585 590
Gly Gln Lys Val Ala Leu Lys Pro Asn Thr Thr Tyr Ile Leu Gly Ala
595 600 605
Trp Gly Lys Phe Thr Ala Lys Pro Gly Thr Tyr Cys Asp Val Ile Val
610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
Ala Ser Asn Ala Asp Phe Tyr Ala Asp Asn Ile Thr Leu Val Glu Val
675 680 685
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690 695 700
Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile
705 710 715 720
Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser
725 730 735
Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val
740 745 750
Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met
755 760 765
Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn
770 775 780
Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His
785 790 795 800
Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
805
<210> 9
<211> 833
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021d3_到_1OFE序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(712)
<223> 1OFE结构域
<400> 9
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Asp Phe Ser Ser Pro Glu Glu Val Lys
545 550 555 560
Asn Trp Trp Asn Ser Gly Thr Trp Gln Ala Glu Phe Gly Ser Pro Asp
565 570 575
Ile Glu Trp Asn Gly Glu Val Gly Asn Gly Ala Leu Gln Leu Asn Val
580 585 590
Lys Leu Pro Gly Lys Ser Asp Trp Glu Glu Val Arg Val Ala Arg Lys
595 600 605
Phe Glu Arg Leu Ser Glu Cys Glu Ile Leu Glu Tyr Asp Ile Tyr Ile
610 615 620
Pro Asn Val Glu Gly Leu Lys Gly Arg Leu Arg Pro Tyr Ala Val Leu
625 630 635 640
Asn Pro Gly Trp Val Lys Ile Gly Leu Asp Met Asn Asn Ala Asn Val
645 650 655
Glu Ser Ala Glu Ile Ile Thr Phe Gly Gly Lys Glu Tyr Arg Arg Phe
660 665 670
His Val Arg Ile Glu Phe Asp Arg Thr Ala Gly Val Lys Glu Leu His
675 680 685
Ile Gly Val Val Gly Asp His Leu Arg Tyr Asp Gly Pro Ile Phe Ile
690 695 700
Asp Asn Val Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu Ser
705 710 715 720
Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser
725 730 735
Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe
740 745 750
Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser Phe
755 760 765
Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu Val
770 775 780
Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly
785 790 795 800
Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser
805 810 815
Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile
820 825 830
Lys
<210> 10
<211> 846
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021d3_到_1PMH序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(725)
<223> 1PMH结构域
<400> 10
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Asp Phe Glu Asp Gly Thr Val Met Ser
545 550 555 560
Phe Gly Glu Ala Trp Gly Asp Ser Leu Lys Cys Ile Lys Lys Val Ser
565 570 575
Val Ser Gln Asp Leu Gln Arg Pro Gly Asn Lys Tyr Ala Leu Arg Leu
580 585 590
Asp Val Glu Phe Asn Pro Asn Asn Gly Trp Asp Gln Gly Asp Leu Gly
595 600 605
Thr Trp Ile Gly Gly Val Val Glu Gly Gln Phe Asp Phe Thr Gly Tyr
610 615 620
Lys Ser Val Glu Phe Glu Met Phe Ile Pro Tyr Asp Glu Phe Ser Lys
625 630 635 640
Ser Gln Gly Gly Phe Ala Tyr Lys Val Val Ile Asn Asp Gly Trp Lys
645 650 655
Glu Leu Gly Ser Glu Phe Asn Ile Thr Ala Asn Ala Gly Lys Lys Val
660 665 670
Lys Ile Asn Gly Lys Asp Tyr Thr Val Ile His Lys Ala Phe Ala Ile
675 680 685
Pro Glu Asp Phe Arg Thr Lys Lys Arg Ala Gln Leu Val Phe Gln Phe
690 695 700
Ala Gly Gln Asn Ser Asn Tyr Lys Gly Pro Ile Tyr Leu Asp Asn Val
705 710 715 720
Arg Ile Arg Pro Glu Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu Ser Pro Glu Leu
725 730 735
Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser Gly
740 745 750
Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln Ser
755 760 765
Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser Phe Thr Ala Ser
770 775 780
Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu
785 790 795 800
Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly Thr Phe Lys
805 810 815
Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser
820 825 830
Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
835 840 845
<210> 11
<211> 784
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021_到_2BGP序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(663)
<223> 2BGP结构域
<400> 11
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Thr Ala Ala Ser Ala Ser Ile Thr Ala
545 550 555 560
Pro Ala Gln Leu Val Gly Asn Val Gly Glu Leu Gln Gly Ala Gly Ser
565 570 575
Ala Val Ile Trp Asn Val Asp Val Pro Val Thr Gly Glu Tyr Arg Ile
580 585 590
Asn Leu Thr Trp Ser Ser Pro Tyr Ser Ser Lys Val Asn Thr Leu Val
595 600 605
Met Asp Gly Thr Ala Leu Ser Tyr Ala Phe Ala Glu Ala Thr Val Pro
610 615 620
Val Thr Tyr Val Gln Thr Lys Thr Leu Ser Ala Gly Asn His Ser Phe
625 630 635 640
Gly Val Arg Val Gly Ser Ser Asp Trp Gly Tyr Met Asn Val His Ser
645 650 655
Leu Lys Leu Glu Leu Leu Gly Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu Ser Pro
660 665 670
Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile
675 680 685
Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg
690 695 700
Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser Phe Thr
705 710 715 720
Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu
725 730 735
Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly Thr
740 745 750
Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg
755 760 765
Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
770 775 780
<210> 12
<211> 807
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021_到_GP21序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(686)
<223> GP21结构域
<400> 12
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Ser Phe Glu Arg Gly Thr Glu Gly
545 550 555 560
Tyr Thr Gly Trp Ser Gly Ile Ala Thr Val Val Thr Leu Gln Val Pro
565 570 575
His Leu Gly Thr Lys Ala Ala Lys Leu Ala Ala Gly Gly Ser Ala Gly
580 585 590
Val Gly Gln Lys Ile Ser Phe Lys Lys Asp Arg Ser Tyr Lys Ile Gly
595 600 605
Ile Trp Ala Lys Gln Asp Pro Asn Thr Thr Ile Gln Ser Thr Asp Asn
610 615 620
Thr Lys Phe Arg Val Ala Asp Gly Asn Gly Leu Ile Ala Ser Lys Ala
625 630 635 640
Tyr Gly Pro Phe Thr Ser Asn Trp Gln Glu Val Ser Trp Thr Trp Lys
645 650 655
Ala Thr Lys Asp Val Leu Ala Asp Val Gln Phe Thr Ala Phe Leu Ser
660 665 670
Ala Gly Ala Met Tyr Phe Asp Asp Phe Tyr Val Val Asp Val Lys Pro
675 680 685
Ala Glu Asp Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile
690 695 700
Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu
705 710 715 720
Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser
725 730 735
Thr Tyr Ser Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val
740 745 750
Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser
755 760 765
Thr Ser His Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly
770 775 780
Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser
785 790 795 800
Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
805
<210> 13
<211> 812
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021_到_CENC序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(691)
<223> CenC结构域
<400> 13
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Leu Glu Asp Gly Ile Asn Asn
545 550 555 560
Trp Gln Ala Trp Gly Glu Gly Phe Thr Ala Ala Ser Asp Met Ser His
565 570 575
Thr Gly Ser Ala Ser Leu Lys Val Leu Leu Asn Asn Gly Gly Arg Gln
580 585 590
Val Val Ala Leu Gln Pro Gly Lys Ser Tyr Lys Leu Gly Val Trp Gly
595 600 605
Lys Thr Ala Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gln Thr Ala Thr Val Met Ile
610 615 620
Asn Tyr Lys Lys Pro Glu Asp Asp Ser Ser His Thr Tyr Gly Ser Phe
625 630 635 640
Gln Phe Gly Pro Asp Asn Ser Glu Phe Thr Tyr Lys Glu Ile Thr Phe
645 650 655
Glu Thr Pro Asp Asp Met Ala Gln Glu Trp Gly Thr Gln Phe Val Ser
660 665 670
Ile Trp Ser Glu Gly Ala Asp Gln Val Tyr Leu Asp Asp Phe Thr Leu
675 680 685
Ser Glu Val Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn
690 695 700
Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys
705 710 715 720
Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser
725 730 735
Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro
740 745 750
Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser
755 760 765
Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu
770 775 780
Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly
785 790 795 800
Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
805 810
<210> 14
<211> 805
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021_到_PsHGF7序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(684)
<223> PSHGF7结构域
<400> 14
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe Glu Asp Asn Leu Ala Ser
545 550 555 560
Trp Thr Asn Trp Gly Asn Thr Ser Ser Val Thr Ser Pro Ala Phe Ala
565 570 575
Gly Ala Lys Ala Ala Arg Ile Ala Ser Gly Glu Gly Gly Ala Gly Gln
580 585 590
Ile Ile Pro Gly Ile Pro Ser Gly Thr Thr Tyr Val Leu Ser Gly His
595 600 605
Gly Ser Val Ser Ala Gly Thr Asp Thr Ala Ile Val Gly Val Asp Cys
610 615 620
Leu Asp Ala Asn Asn Asn Val Leu Ala Lys Asn Thr Leu Arg Phe Asn
625 630 635 640
Gln Thr Leu Tyr Glu Phe Lys Ser Thr Ala Phe Thr Thr Val Pro Gly
645 650 655
Thr Ala Lys Leu Gln Val Tyr Ile Tyr Lys Asn Ala Asp Ser Gly Ala
660 665 670
Asn Ala Phe Leu Asp Asp Leu Ser Leu Val Glu Val Lys Pro Ala Glu
675 680 685
Asp Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr
690 695 700
Pro Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr
705 710 715 720
Asn Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr
725 730 735
Ser Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn
740 745 750
Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser
755 760 765
His Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr
770 775 780
Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu
785 790 795 800
Asn Val Ser Ile Lys
805
<210> 15
<211> 818
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P021_到_1WKY序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (552)..(697)
<223> 1WKY结构域
<400> 15
Met His His His His His His His His His His Asn Met Asn Asn Thr
1 5 10 15
Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe
35 40 45
Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp
100 105 110
Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ala Ala Pro Phe Val Lys Lys
195 200 205
Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg
245 250 255
Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys
260 265 270
Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu
275 280 285
Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His
305 310 315 320
Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp
340 345 350
Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Val
355 360 365
Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu
370 375 380
Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu
385 390 395 400
Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe Cys Pro Asp Gln Ser Glu
405 410 415
Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile
420 425 430
Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu
485 490 495
Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu
500 505 510
Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr
515 520 525
Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Asp Phe Glu Glu Ser Thr Gln Gly Trp
545 550 555 560
Thr Gly Ser Ser Leu Ser Arg Gly Pro Trp Thr Val Thr Glu Trp Ser
565 570 575
Ser Lys Gly Asn His Ser Leu Lys Ala Asp Ile Gln Met Ser Ser Asn
580 585 590
Ser Gln His Tyr Leu His Val Ile Gln Asn Arg Ser Leu Gln Gln Asn
595 600 605
Ser Arg Ile Gln Ala Thr Val Lys His Ala Asn Trp Gly Ser Val Gly
610 615 620
Asn Gly Met Thr Ala Arg Leu Tyr Val Lys Thr Gly His Gly Tyr Thr
625 630 635 640
Trp Tyr Ser Gly Ser Phe Val Pro Ile Asn Gly Ser Ser Gly Thr Thr
645 650 655
Leu Ser Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Asn Leu Ser Gln Val Arg Glu
660 665 670
Ile Gly Val Gln Phe Gln Ser Glu Ser Asn Ser Ser Gly Gln Thr Ser
675 680 685
Ile Tyr Ile Asp Asn Val Ile Val Glu Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu
690 695 700
Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala
705 710 715 720
Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr
725 730 735
Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser
740 745 750
Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu
755 760 765
Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His Ile Ser
770 775 780
Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu
785 790 795 800
Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser
805 810 815
Ile Lys
<210> 16
<211> 800
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_2ZEX序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(678)
<223> 2ZEX结构域
<400> 16
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe
530 535 540
Glu Asp Gly Leu Asp Ser Trp Gln Asp Trp Gln Gln Asp Met Ser Ala
545 550 555 560
Val Pro Glu Ala Ala His Asn Gly Ala Leu Gly Leu Lys Ile Gly Gly
565 570 575
Gly Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gln Asp Ile Pro Leu Lys Pro Asn Thr
580 585 590
Thr Tyr Ile Leu Gly Ala Trp Ala Lys Phe Asp Ser Lys Pro Ala Gly
595 600 605
Thr Phe Asp Val Val Val Gln Tyr His Leu Lys Asp Ala Asn Asn Thr
610 615 620
Tyr Val Gln His Ile Leu Asn Phe Asn Glu Thr Asp Trp Thr Tyr Lys
625 630 635 640
Gln Leu Leu Phe Thr Thr Pro Asp Val Phe Gly Ser Thr Pro Gln Leu
645 650 655
Ala Leu Trp Lys Gly Asp Thr Ser Lys Ala Asn Leu Tyr Val Asp Asp
660 665 670
Val Tyr Leu Val Glu Val Ser Pro Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu
675 680 685
Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser
690 695 700
Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln
705 710 715 720
Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val
725 730 735
Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe
740 745 750
Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr
755 760 765
Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn
770 775 780
Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
785 790 795 800
<210> 17
<211> 800
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_2ZEZ序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(678)
<223> 2ZEZ结构域
<400> 17
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe
530 535 540
Glu Asn Gly Met Asp Gly Trp Pro Asp Trp Gly Tyr Pro Val Ser Ala
545 550 555 560
Val Pro Glu Ala Ala Tyr Gly Gly Thr Lys Gly Phe Lys Leu Ser Gly
565 570 575
Gly Lys Gln Ala Gly Met Gly Gln Lys Val Ala Leu Lys Pro Asn Thr
580 585 590
Thr Tyr Ile Leu Gly Ala Trp Gly Lys Phe Thr Ala Lys Pro Gly Thr
595 600 605
Tyr Cys Asp Val Ile Val Gln Tyr His Leu Lys Asp Ala Asn Asn Thr
610 615 620
Tyr Val Gln Asn Ile Leu Arg Phe Thr Glu Thr Asp Trp Thr Tyr Lys
625 630 635 640
Gln Val Val Phe Thr Thr Pro Asp Ala Phe Gly Ser Asp Pro Glu Phe
645 650 655
Val Leu Trp Lys Asp Asp Ala Ser Asn Ala Asp Phe Tyr Ala Asp Asn
660 665 670
Ile Thr Leu Val Glu Val Ser Pro Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu
675 680 685
Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser
690 695 700
Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln
705 710 715 720
Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val
725 730 735
Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe
740 745 750
Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr
755 760 765
Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn
770 775 780
Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
785 790 795 800
<210> 18
<211> 824
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_1OFE序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(702)
<223> OFE结构域
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(702)
<223> 1OFE结构域
<400> 18
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Asp Phe Ser
530 535 540
Ser Pro Glu Glu Val Lys Asn Trp Trp Asn Ser Gly Thr Trp Gln Ala
545 550 555 560
Glu Phe Gly Ser Pro Asp Ile Glu Trp Asn Gly Glu Val Gly Asn Gly
565 570 575
Ala Leu Gln Leu Asn Val Lys Leu Pro Gly Lys Ser Asp Trp Glu Glu
580 585 590
Val Arg Val Ala Arg Lys Phe Glu Arg Leu Ser Glu Cys Glu Ile Leu
595 600 605
Glu Tyr Asp Ile Tyr Ile Pro Asn Val Glu Gly Leu Lys Gly Arg Leu
610 615 620
Arg Pro Tyr Ala Val Leu Asn Pro Gly Trp Val Lys Ile Gly Leu Asp
625 630 635 640
Met Asn Asn Ala Asn Val Glu Ser Ala Glu Ile Ile Thr Phe Gly Gly
645 650 655
Lys Glu Tyr Arg Arg Phe His Val Arg Ile Glu Phe Asp Arg Thr Ala
660 665 670
Gly Val Lys Glu Leu His Ile Gly Val Val Gly Asp His Leu Arg Tyr
675 680 685
Asp Gly Pro Ile Phe Ile Asp Asn Val Arg Leu Tyr Lys Arg Ser Pro
690 695 700
Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr
705 710 715 720
Ser Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln
725 730 735
Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser
740 745 750
Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile
755 760 765
Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala
770 775 780
Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe
785 790 795 800
Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val
805 810 815
His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
820
<210> 19
<211> 837
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_1PMH序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(715)
<223> 1PMH结构域
<400> 19
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Asp Phe Glu
530 535 540
Asp Gly Thr Val Met Ser Phe Gly Glu Ala Trp Gly Asp Ser Leu Lys
545 550 555 560
Cys Ile Lys Lys Val Ser Val Ser Gln Asp Leu Gln Arg Pro Gly Asn
565 570 575
Lys Tyr Ala Leu Arg Leu Asp Val Glu Phe Asn Pro Asn Asn Gly Trp
580 585 590
Asp Gln Gly Asp Leu Gly Thr Trp Ile Gly Gly Val Val Glu Gly Gln
595 600 605
Phe Asp Phe Thr Gly Tyr Lys Ser Val Glu Phe Glu Met Phe Ile Pro
610 615 620
Tyr Asp Glu Phe Ser Lys Ser Gln Gly Gly Phe Ala Tyr Lys Val Val
625 630 635 640
Ile Asn Asp Gly Trp Lys Glu Leu Gly Ser Glu Phe Asn Ile Thr Ala
645 650 655
Asn Ala Gly Lys Lys Val Lys Ile Asn Gly Lys Asp Tyr Thr Val Ile
660 665 670
His Lys Ala Phe Ala Ile Pro Glu Asp Phe Arg Thr Lys Lys Arg Ala
675 680 685
Gln Leu Val Phe Gln Phe Ala Gly Gln Asn Ser Asn Tyr Lys Gly Pro
690 695 700
Ile Tyr Leu Asp Asn Val Arg Ile Arg Pro Glu Ser Pro Ser Glu Lys
705 710 715 720
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
725 730 735
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg
740 745 750
Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
755 760 765
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
770 775 780
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
785 790 795 800
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
805 810 815
Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
820 825 830
Asp Val Ser Ile Lys
835
<210> 20
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_2BGP序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(653)
<223> 2BGP结构域
<400> 20
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Thr Ala Ala
530 535 540
Ser Ala Ser Ile Thr Ala Pro Ala Gln Leu Val Gly Asn Val Gly Glu
545 550 555 560
Leu Gln Gly Ala Gly Ser Ala Val Ile Trp Asn Val Asp Val Pro Val
565 570 575
Thr Gly Glu Tyr Arg Ile Asn Leu Thr Trp Ser Ser Pro Tyr Ser Ser
580 585 590
Lys Val Asn Thr Leu Val Met Asp Gly Thr Ala Leu Ser Tyr Ala Phe
595 600 605
Ala Glu Ala Thr Val Pro Val Thr Tyr Val Gln Thr Lys Thr Leu Ser
610 615 620
Ala Gly Asn His Ser Phe Gly Val Arg Val Gly Ser Ser Asp Trp Gly
625 630 635 640
Tyr Met Asn Val His Ser Leu Lys Leu Glu Leu Leu Gly Ser Pro Ser
645 650 655
Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser
660 665 670
Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly
675 680 685
Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr
690 695 700
Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg
705 710 715 720
Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys
725 730 735
Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr
740 745 750
Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His
755 760 765
Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
770 775
<210> 21
<211> 798
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_Gp21序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(676)
<223> Gp21结构域
<400> 21
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Ser Phe
530 535 540
Glu Arg Gly Thr Glu Gly Tyr Thr Gly Trp Ser Gly Ile Ala Thr Val
545 550 555 560
Val Thr Leu Gln Val Pro His Leu Gly Thr Lys Ala Ala Lys Leu Ala
565 570 575
Ala Gly Gly Ser Ala Gly Val Gly Gln Lys Ile Ser Phe Lys Lys Asp
580 585 590
Arg Ser Tyr Lys Ile Gly Ile Trp Ala Lys Gln Asp Pro Asn Thr Thr
595 600 605
Ile Gln Ser Thr Asp Asn Thr Lys Phe Arg Val Ala Asp Gly Asn Gly
610 615 620
Leu Ile Ala Ser Lys Ala Tyr Gly Pro Phe Thr Ser Asn Trp Gln Glu
625 630 635 640
Val Ser Trp Thr Trp Lys Ala Thr Lys Asp Val Leu Ala Asp Val Gln
645 650 655
Phe Thr Ala Phe Leu Ser Ala Gly Ala Met Tyr Phe Asp Asp Phe Tyr
660 665 670
Val Val Asp Val Ser Pro Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile
675 680 685
Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn
690 695 700
Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu
705 710 715 720
Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly
725 730 735
Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys
740 745 750
Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys
755 760 765
Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu
770 775 780
Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
785 790 795
<210> 22
<211> 803
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_CenC序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(681)
<223> CenC结构域
<400> 22
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Leu
530 535 540
Glu Asp Gly Ile Asn Asn Trp Gln Ala Trp Gly Glu Gly Phe Thr Ala
545 550 555 560
Ala Ser Asp Met Ser His Thr Gly Ser Ala Ser Leu Lys Val Leu Leu
565 570 575
Asn Asn Gly Gly Arg Gln Val Val Ala Leu Gln Pro Gly Lys Ser Tyr
580 585 590
Lys Leu Gly Val Trp Gly Lys Thr Ala Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gln
595 600 605
Thr Ala Thr Val Met Ile Asn Tyr Lys Lys Pro Glu Asp Asp Ser Ser
610 615 620
His Thr Tyr Gly Ser Phe Gln Phe Gly Pro Asp Asn Ser Glu Phe Thr
625 630 635 640
Tyr Lys Glu Ile Thr Phe Glu Thr Pro Asp Asp Met Ala Gln Glu Trp
645 650 655
Gly Thr Gln Phe Val Ser Ile Trp Ser Glu Gly Ala Asp Gln Val Tyr
660 665 670
Leu Asp Asp Phe Thr Leu Ser Glu Val Ser Pro Ser Glu Lys Leu Leu
675 680 685
Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly Ser Thr
690 695 700
Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Ile
705 710 715 720
Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr
725 730 735
Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu
740 745 750
Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Ser Glu
755 760 765
Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser
770 775 780
Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val
785 790 795 800
Ser Ile Lys
<210> 23
<211> 796
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Ad3_到_PsHGF7序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (542)..(674)
<223> PsHGF7结构域
<400> 23
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe
530 535 540
Glu Asp Asn Leu Ala Ser Trp Thr Asn Trp Gly Asn Thr Ser Ser Val
545 550 555 560
Thr Ser Pro Ala Phe Ala Gly Ala Lys Ala Ala Arg Ile Ala Ser Gly
565 570 575
Glu Gly Gly Ala Gly Gln Ile Ile Pro Gly Ile Pro Ser Gly Thr Thr
580 585 590
Tyr Val Leu Ser Gly His Gly Ser Val Ser Ala Gly Thr Asp Thr Ala
595 600 605
Ile Val Gly Val Asp Cys Leu Asp Ala Asn Asn Asn Val Leu Ala Lys
610 615 620
Asn Thr Leu Arg Phe Asn Gln Thr Leu Tyr Glu Phe Lys Ser Thr Ala
625 630 635 640
Phe Thr Thr Val Pro Gly Thr Ala Lys Leu Gln Val Tyr Ile Tyr Lys
645 650 655
Asn Ala Asp Ser Gly Ala Asn Ala Phe Leu Asp Asp Leu Ser Leu Val
660 665 670
Glu Val Ser Pro Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr
675 680 685
Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu
690 695 700
Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu
705 710 715 720
Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala
725 730 735
Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr
740 745 750
Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu
755 760 765
Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly
770 775 780
Gly Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
785 790 795
<210> 24
<211> 137
<212> PRT
<213> 解多糖热厌氧杆菌
<400> 24
Pro Gly Phe Glu Asp Gly Leu Asp Ser Trp Gln Asp Trp Gln Gln Asp
1 5 10 15
Met Ser Ala Val Pro Glu Ala Ala His Asn Gly Ala Leu Gly Leu Lys
20 25 30
Ile Gly Gly Gly Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gln Asp Ile Pro Leu Lys
35 40 45
Pro Asn Thr Thr Tyr Ile Leu Gly Ala Trp Ala Lys Phe Asp Ser Lys
50 55 60
Pro Ala Gly Thr Phe Asp Val Val Val Gln Tyr His Leu Lys Asp Ala
65 70 75 80
Asn Asn Thr Tyr Val Gln His Ile Leu Asn Phe Asn Glu Thr Asp Trp
85 90 95
Thr Tyr Lys Gln Leu Leu Phe Thr Thr Pro Asp Val Phe Gly Ser Thr
100 105 110
Pro Gln Leu Ala Leu Trp Lys Gly Asp Thr Ser Lys Ala Asn Leu Tyr
115 120 125
Val Asp Asp Val Tyr Leu Val Glu Val
130 135
<210> 25
<211> 137
<212> PRT
<213> 解多糖热厌氧杆菌
<400> 25
Pro Gly Phe Glu Asn Gly Met Asp Gly Trp Pro Asp Trp Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Ser Ala Val Pro Glu Ala Ala Tyr Gly Gly Thr Lys Gly Phe Lys
20 25 30
Leu Ser Gly Gly Lys Gln Ala Gly Met Gly Gln Lys Val Ala Leu Lys
35 40 45
Pro Asn Thr Thr Tyr Ile Leu Gly Ala Trp Gly Lys Phe Thr Ala Lys
50 55 60
Pro Gly Thr Tyr Cys Asp Val Ile Val Gln Tyr His Leu Lys Asp Ala
65 70 75 80
Asn Asn Thr Tyr Val Gln Asn Ile Leu Arg Phe Thr Glu Thr Asp Trp
85 90 95
Thr Tyr Lys Gln Val Val Phe Thr Thr Pro Asp Ala Phe Gly Ser Asp
100 105 110
Pro Glu Phe Val Leu Trp Lys Asp Asp Ala Ser Asn Ala Asp Phe Tyr
115 120 125
Ala Asp Asn Ile Thr Leu Val Glu Val
130 135
<210> 26
<211> 161
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌
<400> 26
Asp Phe Ser Ser Pro Glu Glu Val Lys Asn Trp Trp Asn Ser Gly Thr
1 5 10 15
Trp Gln Ala Glu Phe Gly Ser Pro Asp Ile Glu Trp Asn Gly Glu Val
20 25 30
Gly Asn Gly Ala Leu Gln Leu Asn Val Lys Leu Pro Gly Lys Ser Asp
35 40 45
Trp Glu Glu Val Arg Val Ala Arg Lys Phe Glu Arg Leu Ser Glu Cys
50 55 60
Glu Ile Leu Glu Tyr Asp Ile Tyr Ile Pro Asn Val Glu Gly Leu Lys
65 70 75 80
Gly Arg Leu Arg Pro Tyr Ala Val Leu Asn Pro Gly Trp Val Lys Ile
85 90 95
Gly Leu Asp Met Asn Asn Ala Asn Val Glu Ser Ala Glu Ile Ile Thr
100 105 110
Phe Gly Gly Lys Glu Tyr Arg Arg Phe His Val Arg Ile Glu Phe Asp
115 120 125
Arg Thr Ala Gly Val Lys Glu Leu His Ile Gly Val Val Gly Asp His
130 135 140
Leu Arg Tyr Asp Gly Pro Ile Phe Ile Asp Asn Val Arg Leu Tyr Lys
145 150 155 160
Arg
<210> 27
<211> 174
<212> PRT
<213> 解糖热解纤维素菌
<400> 27
Asp Phe Glu Asp Gly Thr Val Met Ser Phe Gly Glu Ala Trp Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Lys Cys Ile Lys Lys Val Ser Val Ser Gln Asp Leu Gln Arg
20 25 30
Pro Gly Asn Lys Tyr Ala Leu Arg Leu Asp Val Glu Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Asn Gly Trp Asp Gln Gly Asp Leu Gly Thr Trp Ile Gly Gly Val Val
50 55 60
Glu Gly Gln Phe Asp Phe Thr Gly Tyr Lys Ser Val Glu Phe Glu Met
65 70 75 80
Phe Ile Pro Tyr Asp Glu Phe Ser Lys Ser Gln Gly Gly Phe Ala Tyr
85 90 95
Lys Val Val Ile Asn Asp Gly Trp Lys Glu Leu Gly Ser Glu Phe Asn
100 105 110
Ile Thr Ala Asn Ala Gly Lys Lys Val Lys Ile Asn Gly Lys Asp Tyr
115 120 125
Thr Val Ile His Lys Ala Phe Ala Ile Pro Glu Asp Phe Arg Thr Lys
130 135 140
Lys Arg Ala Gln Leu Val Phe Gln Phe Ala Gly Gln Asn Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Gly Pro Ile Tyr Leu Asp Asn Val Arg Ile Arg Pro Glu
165 170
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 纤维弧菌
<400> 28
Thr Ala Ala Ser Ala Ser Ile Thr Ala Pro Ala Gln Leu Val Gly Asn
1 5 10 15
Val Gly Glu Leu Gln Gly Ala Gly Ser Ala Val Ile Trp Asn Val Asp
20 25 30
Val Pro Val Thr Gly Glu Tyr Arg Ile Asn Leu Thr Trp Ser Ser Pro
35 40 45
Tyr Ser Ser Lys Val Asn Thr Leu Val Met Asp Gly Thr Ala Leu Ser
50 55 60
Tyr Ala Phe Ala Glu Ala Thr Val Pro Val Thr Tyr Val Gln Thr Lys
65 70 75 80
Thr Leu Ser Ala Gly Asn His Ser Phe Gly Val Arg Val Gly Ser Ser
85 90 95
Asp Trp Gly Tyr Met Asn Val His Ser Leu Lys Leu Glu Leu Leu Gly
100 105 110
<210> 29
<211> 135
<212> PRT
<213> 肺炎克雷伯氏菌
<400> 29
Pro Ser Phe Glu Arg Gly Thr Glu Gly Tyr Thr Gly Trp Ser Gly Ile
1 5 10 15
Ala Thr Val Val Thr Leu Gln Val Pro His Leu Gly Thr Lys Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Ala Ala Gly Gly Ser Ala Gly Val Gly Gln Lys Ile Ser Phe
35 40 45
Lys Lys Asp Arg Ser Tyr Lys Ile Gly Ile Trp Ala Lys Gln Asp Pro
50 55 60
Asn Thr Thr Ile Gln Ser Thr Asp Asn Thr Lys Phe Arg Val Ala Asp
65 70 75 80
Gly Asn Gly Leu Ile Ala Ser Lys Ala Tyr Gly Pro Phe Thr Ser Asn
85 90 95
Trp Gln Glu Val Ser Trp Thr Trp Lys Ala Thr Lys Asp Val Leu Ala
100 105 110
Asp Val Gln Phe Thr Ala Phe Leu Ser Ala Gly Ala Met Tyr Phe Asp
115 120 125
Asp Phe Tyr Val Val Asp Val
130 135
<210> 30
<211> 140
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属物种JDR-2
<400> 30
Pro Gly Leu Glu Asp Gly Ile Asn Asn Trp Gln Ala Trp Gly Glu Gly
1 5 10 15
Phe Thr Ala Ala Ser Asp Met Ser His Thr Gly Ser Ala Ser Leu Lys
20 25 30
Val Leu Leu Asn Asn Gly Gly Arg Gln Val Val Ala Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Lys Ser Tyr Lys Leu Gly Val Trp Gly Lys Thr Ala Gly Thr Gly Thr
50 55 60
Gly Thr Gln Thr Ala Thr Val Met Ile Asn Tyr Lys Lys Pro Glu Asp
65 70 75 80
Asp Ser Ser His Thr Tyr Gly Ser Phe Gln Phe Gly Pro Asp Asn Ser
85 90 95
Glu Phe Thr Tyr Lys Glu Ile Thr Phe Glu Thr Pro Asp Asp Met Ala
100 105 110
Gln Glu Trp Gly Thr Gln Phe Val Ser Ile Trp Ser Glu Gly Ala Asp
115 120 125
Gln Val Tyr Leu Asp Asp Phe Thr Leu Ser Glu Val
130 135 140
<210> 31
<211> 133
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属物种HGF7
<400> 31
Pro Gly Phe Glu Asp Asn Leu Ala Ser Trp Thr Asn Trp Gly Asn Thr
1 5 10 15
Ser Ser Val Thr Ser Pro Ala Phe Ala Gly Ala Lys Ala Ala Arg Ile
20 25 30
Ala Ser Gly Glu Gly Gly Ala Gly Gln Ile Ile Pro Gly Ile Pro Ser
35 40 45
Gly Thr Thr Tyr Val Leu Ser Gly His Gly Ser Val Ser Ala Gly Thr
50 55 60
Asp Thr Ala Ile Val Gly Val Asp Cys Leu Asp Ala Asn Asn Asn Val
65 70 75 80
Leu Ala Lys Asn Thr Leu Arg Phe Asn Gln Thr Leu Tyr Glu Phe Lys
85 90 95
Ser Thr Ala Phe Thr Thr Val Pro Gly Thr Ala Lys Leu Gln Val Tyr
100 105 110
Ile Tyr Lys Asn Ala Asp Ser Gly Ala Asn Ala Phe Leu Asp Asp Leu
115 120 125
Ser Leu Val Glu Val
130
<210> 32
<211> 146
<212> PRT
<213> 解糖热解纤维素菌
<400> 32
Asp Phe Glu Glu Ser Thr Gln Gly Trp Thr Gly Ser Ser Leu Ser Arg
1 5 10 15
Gly Pro Trp Thr Val Thr Glu Trp Ser Ser Lys Gly Asn His Ser Leu
20 25 30
Lys Ala Asp Ile Gln Met Ser Ser Asn Ser Gln His Tyr Leu His Val
35 40 45
Ile Gln Asn Arg Ser Leu Gln Gln Asn Ser Arg Ile Gln Ala Thr Val
50 55 60
Lys His Ala Asn Trp Gly Ser Val Gly Asn Gly Met Thr Ala Arg Leu
65 70 75 80
Tyr Val Lys Thr Gly His Gly Tyr Thr Trp Tyr Ser Gly Ser Phe Val
85 90 95
Pro Ile Asn Gly Ser Ser Gly Thr Thr Leu Ser Leu Asp Leu Ser Asn
100 105 110
Val Gln Asn Leu Ser Gln Val Arg Glu Ile Gly Val Gln Phe Gln Ser
115 120 125
Glu Ser Asn Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ile Tyr Ile Asp Asn Val Ile
130 135 140
Val Glu
145
<210> 33
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Dd3_到_2ZEX序列
<400> 33
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe
530 535 540
Glu Asp Gly Leu Asp Ser Trp Gln Asp Trp Gln Gln Asp Met Ser Ala
545 550 555 560
Val Pro Glu Ala Ala His Asn Gly Ala Leu Gly Leu Lys Ile Gly Gly
565 570 575
Gly Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gln Asp Ile Pro Leu Lys Pro Asn Thr
580 585 590
Thr Tyr Ile Leu Gly Ala Trp Ala Lys Phe Asp Ser Lys Pro Ala Gly
595 600 605
Thr Phe Asp Val Val Val Gln Tyr His Leu Lys Asp Ala Asn Asn Thr
610 615 620
Tyr Val Gln His Ile Leu Asn Phe Asn Glu Thr Asp Trp Thr Tyr Lys
625 630 635 640
Gln Leu Leu Phe Thr Thr Pro Asp Val Phe Gly Ser Thr Pro Gln Leu
645 650 655
Ala Leu Trp Lys Gly Asp Thr Ser Lys Ala Asn Leu Tyr Val Asp Asp
660 665 670
Val Tyr Leu Val Glu Val Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu Ser Pro Glu
675 680 685
Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser
690 695 700
Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln
705 710 715 720
Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser Ile Ser Phe Thr Ala
725 730 735
Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe
740 745 750
Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His Ile Ser Gly Thr Phe
755 760 765
Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg
770 775 780
Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
785 790 795
<210> 34
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Dd3_到_2ZEZ序列
<400> 34
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Pro Gly Phe
530 535 540
Glu Asn Gly Met Asp Gly Trp Pro Asp Trp Gly Tyr Pro Val Ser Ala
545 550 555 560
Val Pro Glu Ala Ala Tyr Gly Gly Thr Lys Gly Phe Lys Leu Ser Gly
565 570 575
Gly Lys Gln Ala Gly Met Gly Gln Lys Val Ala Leu Lys Pro Asn Thr
580 585 590
Thr Tyr Ile Leu Gly Ala Trp Gly Lys Phe Thr Ala Lys Pro Gly Thr
595 600 605
Tyr Cys Asp Val Ile Val Gln Tyr His Leu Lys Asp Ala Asn Asn Thr
610 615 620
Tyr Val Gln Asn Ile Leu Arg Phe Thr Glu Thr Asp Trp Thr Tyr Lys
625 630 635 640
Gln Val Val Phe Thr Thr Pro Asp Ala Phe Gly Ser Asp Pro Glu Phe
645 650 655
Val Leu Trp Lys Asp Asp Ala Ser Asn Ala Asp Phe Tyr Ala Asp Asn
660 665 670
Ile Thr Leu Val Glu Val Lys Pro Ala Glu Asp Leu Leu Ser Pro Glu
675 680 685
Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro Gly Ala Ser Ile Ser
690 695 700
Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gln
705 710 715 720
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Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly
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Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Ile Lys
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<211> 802
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<213> 人工
<220>
<223> Vip3Dd3_到_CenC序列
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Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
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Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
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275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
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Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
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420 425 430
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435 440 445
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Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
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Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly
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<210> 49
<211> 814
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vip3Cd3_到_2ZEX序列
<400> 49
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
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Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
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