本发明具体涉及一种基于葡聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法和应用，属于生物、食品加工技术领域。
背景技术：
抗冻蛋白，俗称冰结构蛋白，又叫作热滞蛋白，首先于1969年由devries在南极海峡的一种极地鱼（trematomusborchgrevinki）的血液中发现。抗冻蛋白具有低温保护活性，可以作为冷冻保护剂应用于医学、生物及食品加工等领。如抗冻蛋白应用于组织、细胞及微生物的低温保存，可以显著提高其冷冻存活率；抗冻蛋白能减少冷冻食品在低温冻藏过程形成的冰晶及其重结晶对食品造成的品质劣变，提高冷冻食品的稳定性。
抗冻蛋白的抗冻活性主要来源于抗冻蛋白中的某些活性片段，并不是整个蛋白在起作用。汪少芸等人通过酶解技术从牛皮、猪皮及鱼皮等不同来源的胶原蛋白中酶解、分离出具有高抗冻活性的多肽片段。
近年来有研究发现重结晶抑制活性对于抗冻蛋白发挥冷冻保护作用起到了至关重要的作用，然而抗冻蛋白的热滞活性和冰结合特性对于当冻藏温度低于热滞活性温度区间的生物材料（如细胞、血液、组织）反而起到破坏甚至致死作用，主要因为当冻藏温度低于热滞活性温度范围时，冰晶生长不受控制而快速转变成针状结构，进而导致细胞损伤和解冻后细胞存活率的下降。这也是阻碍天然抗冻蛋白（或肽）作为冷冻保护剂进行实际应用的主要因素。因此，近年来国际研究开始致力于开发一些具有重结晶抑制活性而没有热滞活性的新型抗冻蛋白，基于糖基化修饰的抗冻蛋白就是这类活性物质的一种。例如一个由4个ser-gly-gly三肽重复的肽链为骨架并通过ser残基的碳端连接一个半乳糖苷基形成的抗冻肽就发现具有很强的重结晶抑制活性而没有热滞活性。此外，研究还发现糖基种类和肽链骨架中糖基化位置及氨基酸残基类型对重结晶抑制活性有着显著的影响作用，如半乳糖基修饰的抗冻肽重结晶抑制活性比甘露糖基修饰的抗冻肽强，而脯氨酸由于具有限制的旋转角可使蛋白在溶液中具有明显二级结构，因此一些含脯氨酸的具有较强的重结晶抑制活性。
因此，本发明将不同来源的抗冻多肽与葡聚糖通过糖基化修饰手段，化学合成抗冻糖肽。所合成的抗冻糖肽的抗冻活性显著高于原始抗冻多肽，可以广泛应用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存；并且该方法安全、易于控制，可以大规模工业化生产。
技术实现要素：
本发明目的之一针对现有技术不足，提供一种基于葡聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法和应用。添加本发明抗冻糖肽的细胞、组织、器官、微生物的冷冻存活率均显著提高；将本发明应用到冷冻保藏食品中，可以很好地保持冷冻食品原有品质的稳定性，显著降低冷冻损伤引起的食品品质劣变。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于葡聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，按照如下方法制备：
按照抗冻多肽粉和葡聚糖之间质量比为1:1~1:5的比例将抗冻多肽粉和葡聚糖混合，然后溶解于去离子水中，溶液最终浓度为5~15%（w/v），搅拌使其充分溶解；然后在60~80℃、ph为8.0~9.0条件下反应1~2h；反应结束后，立即放在0℃水中冷却以终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到所述的葡聚糖修饰的抗冻糖肽冻干粉。
所述的抗冻多肽粉的原料来源于猪皮、牛皮、鱼皮或鱼鳞。
所述的搅拌时间为10~20min；所述冷却时间为15~30min。
如上所述的制备方法制得的抗冻糖肽的用途，所述的抗冻糖肽制备用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存。
本发明所提供的技术方案具有如下优势：
（1）本发明所用的抗冻多肽原料来源于食品源下脚料，具有安全无毒、来源广泛，价格便宜等优势；
（2）本发明提供的抗冻糖肽合成方法高效、安全、成本低，易于控制；
（3）本发明合成的抗冻糖肽应用广泛，可应用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存；并且与抗冻多肽相比，其抗冻活性显著提高。
具体实施措施
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
一种基于葡聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，按照如下方法进行：
（1）按照抗冻多肽粉（来源于猪皮）和葡聚糖之间质量比为1:2.7的比例将抗冻多肽粉和葡聚糖混合，然后溶解于去离子水中，溶液最终浓度为10%（w/v），搅拌15min使其充分溶解；
（2）溶解后的抗冻多肽与葡聚糖混合液在77℃、ph为8.74条件下反应67min；反应结束后，立即放在冰水中冷却20min，终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到抗冻糖肽冻干粉。
实施例2
一种基于葡聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，按照如下方法进行：
（1）按照抗冻多肽粉（来源于牛皮）和葡聚糖之间质量比为1:1的比例将抗冻多肽粉和葡聚糖混合，然后溶解于去离子水中，溶液最终浓度为5%（w/v），搅拌10min使其充分溶解；
（2）溶解后的抗冻多肽与葡聚糖混合液在60℃、ph为8.0条件下反应60min；反应结束后，立即放在冰水中冷却15min，终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到抗冻糖肽冻干粉。
实施例3
一种基于葡聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，按照如下方法进行：
（1）按照抗冻多肽粉（来源于鱼皮）和葡聚糖之间质量比为1:5的比例将抗冻多肽粉和葡聚糖混合，然后溶解于去离子水中，溶液最终浓度为15%（w/v），搅拌20min使其充分溶解；
（2）溶解后的抗冻多肽与葡聚糖混合液在80℃、ph为9.0条件下反应120min；反应结束后，立即放在冰水中冷却30min，终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到抗冻糖肽冻干粉。
应用例1本发明抗冻糖肽在微生物冷冻保存中的应用
按照如下方法进行：
试验处理：a.空白对照（去离子水），b.葡聚糖，c.未进行糖基化修饰的抗冻多肽，d.实施例1制备的抗冻糖肽。
试验方法：
（1）制备种子液：取保存的嗜热链球菌在m17液体培养基中复苏，37°c，180r/min培养一夜，od值约为1.3。
（2）准备实验菌液：取50μl的种子液在盛有4mlm17液体培养基的试管中培养4h，此时菌液的od约为1.2。
（3）将实验菌液用灭菌去离子水稀释100倍，取100μl的稀释菌液转移到2ml的塑料冷冻管中，与900μl的抗冻保护剂混合，涡旋混合器混匀。
（4）取样品混合液50μl在4ml的m17液体培养基中培养7h，检测600nm处的od值。取完后的样品放入-24℃冷冻处理24h后，37℃水浴解冻10min，再次取50μl接种培养测定7h的od值。
此条件下的od值与乳酸菌的相对含量符合如下关系式：
y=0.2152ln(x)+0.0594，r2=0.9972(2-1)
式中y为样品中活菌的相对含量，x为7h培养菌液的od值。计算出冷冻前后样品中菌的相对含量c0和c后，菌的存活率用公式（2-2）计算：
c0，冷冻前样品中菌的相对含量（%）；c，冷冻24小时后样品中菌的相对含量（%）。计算冷冻处理样品的菌存活率，来检测添加剂的抗冻活性。
结果见表1，葡聚糖（处理b）和抗冻多肽（处理c）对嗜热链球菌均有一定的抗冻保护效果，本发明基于葡聚糖修饰的抗冻糖肽修饰物（处理d）的冷冻存活率高达92.5%~97.3%，显著高于单一的葡聚糖（53.9%）和抗冻多肽（66.5%）。说明本发明的基于糖基化修饰的抗冻糖肽具有很好的抗冻功能，对微生物的冷冻保藏具有很好的低温保护作用。
表1本发明抗冻糖肽对对微生物冷冻保护对比试验结果
应用例2本发明抗冻糖肽在猪卵母细胞冷冻保存中的应用
猪卵母细胞冷冻保护剂基本配方，每100份中含：葡萄糖3份、柠檬酸钠1份、青霉素8万单位。
试验处理：在实施实例4中的猪卵母细胞冷冻保护剂基本配方上，分别添加去离子水、葡聚糖、抗冻多肽、实施例1制备的抗冻糖肽，将其相应命名为保护剂a、b、c、d，以保护剂a为对照组。
试验方法：
（1）装管：从废弃的猪卵巢中获取卵母细胞，洗净，移入装有冷冻保护剂的冻存管中平衡15min。
（2）冻存：将平衡后装有卵母细胞的冻存管放入冷冻降温盒中（降温速率2℃/min），降温至-80℃后放入液氮罐中保存。
（3）结果鉴定：解冻后进行培养，计算存活率，结果见表2。
表2本发明抗冻糖肽对卵母细胞冷冻保护对比试验结果
从表2可以看出，本发明的基于糖基化修饰的抗冻糖肽具有很好的抗冻功能，对卵母细胞的超低温保藏具有很好的保护作用。
应用例3本发明抗冻糖肽在冷冻土豆面团制品中的应用
一种耐低温冷藏的冷冻土豆面团所用的原料及配方如下：中筋面粉100份、新鲜土豆120份、高活性干酵母2份、实施例1制备的抗冻糖肽4份、蒸馏水80份。
试验方法：
(1)土豆泥制备：将新鲜土豆洗净沥干，按比例称取沥干的土豆，放入高温蒸汽锅中蒸煮30min,去皮，放入组织捣碎机中捣成土豆泥，冷却至室温备用；
(2)酵母活化：称取所需干酵母粉于37℃蒸馏水中活化20min；
(3)面团调制：将实施例1制备的抗冻糖肽按所需比例添加到活化处理后的酵母液中溶解，再将土豆泥及面粉一同倒入和面机中充分搅拌，揉面至面团表面光滑不黏手；
(4)分割：将揉好的面团分割成剂量为20g左右的面团坯子；
(5)整形：将面团坯子搓圆用保鲜膜包裹；
(6)速冻：将包裹好的面团坯子置于-80℃冰箱速冻60min；
(7)冻藏：将速冻后的面团坯置于-20℃冰箱中冻藏；
(8)解冻：将冷冻面团置于温度为35℃，相对湿度为85%的恒温箱中解冻30min；
(9)一次发酵：解冻好的面团置于温度为37℃，相对湿度为85%的恒温箱中发酵100min；
(10)揉面：将一次发酵好的面团用压面机压10遍；
(11)整形：将压好的面整成所需的馒头形状；
(12)二次发酵：整好型后的面团置于温度为37℃，相对湿度为85%的恒温箱中醒发30min；
(13)蒸制：将发酵好的馒头坯子置于蒸笼中大火蒸煮30min；等待5min后开锅取出。
添加本发明抗冻糖肽的冷冻面团制作馒头所需醒发时间短，蒸制而得的馒头比容大，馒头心部呈海绵状，口感细腻有弹性，与用新鲜面团制作的馒头品质相近。
应用例4本发明抗冻糖肽在冷冻鱼糜制品中的应用
一种耐低温冷藏的冷冻鱼糜制品所用的原料及配方如下：鱼浆60份、大豆分离蛋白、实施例1制备的抗冻糖肽5份、明胶30份、猪脊膘20份、淀粉8份、大蒜0.4份、味琳1.5份、白糖3份、食用盐3份、味精0.3份，余量为冰水。
试验方法：
（1）解冻：将鱼浆解冻至可斩碎，但中心部位仍有部分碎冰为宜的半解冻状态；
（2）斩拌：将解冻后的鱼浆与猪脊膘、大蒜、味琳、白糖、食用盐、味精和冰水在斩拌机中斩拌，期间待料温达到15℃以上添加淀粉，继续斩拌，出浆温度为20℃；
（3）将大豆分离蛋白打成乳液状后，与实施例1制备的抗冻糖肽一同加入斩拌机内，中速斩拌均匀；
（4）成型：所述成型采用的成型模具，包括机座，所述机座上设有鱼糜螺旋进料机构，料槽道上方均设有转动的推料拨板、压辊及热接合装置的上下部热接合辊，所述引导部设置在框架的一侧，将通过压辊机将鱼糜压成片状，再经过捆束机将鱼糜片卷成樱花状。
（5）蒸煮：先低温水煮：将成型后的生鱼丸制品送入低温水煮机内进行低温水煮，水煮温度为40℃，水煮时间为15min；接着高温水煮：将低温水煮后的鱼丸制品送入高温水煮机内进行高温水煮，水煮温度为95℃，水煮时间为4min；最后将高温水煮后的鱼丸制品送入高温蒸煮机内进行高温蒸煮，蒸煮温度为121℃，蒸煮时间为15min。
（6）冷却：所述冷却的工艺如下：将高温蒸煮后的鱼丸制品送入冷却机上，使鱼丸制品的温度降低至室温。
（7）速冻：所述速冻的工艺如下：将冷却后的鱼丸制品送入速冻机内，速冻机库温低于-30°c，冻结完成后鱼丸制品中心温度低于-18℃。
（8）包装：对检验合格的产品进行包装，包装好的产品经过金属探测器的检测产品中是否混有金属物质；
（9）入库：将装箱合格的产品放在-18℃以下的冷藏库冷藏。
在冷冻鱼糜制品中添加本发明抗冻糖肽能有效抑制由于冻藏引发的品质略变、凝胶性能降低、风味不佳等问题；抗冻糖肽能改善肉制品品质，同时使鱼糜制品营养更丰富，更受消费者青睐。
以上所述仅为本发明的较佳实施实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。