用于减少脂肪的胆酸类与盐类的组合物和方法与流程

抽脂术，也称为脂肪抽吸术、脂肪塑形吸脂术或简称抽脂，是一种从人体上的许多不同部位去除脂肪的整容外科手术。涉及区域可以从腹部、大腿和臀部到颈部、胳膊后面和其它地方。多个因素限制了能够在一个阶段中安全去除的脂肪量。对于去除太多的脂肪存在消极的方面。在那些“过度抽吸”的患者中可以看到皮肤中的异常肿块和/或凹陷。脂肪去除越多，手术风险越高。注射脂解是一种将药物混合物注射到患者中以破坏脂肪细胞的美容过程。这种使用通常基于磷脂酰胆碱(PPC)和脱氧胆酸盐(DCA)的药物的实践，源自那些用于治疗血液疾病的药物制剂的最初静脉内使用。PPC是一类包括胆碱作为首基的磷脂。它是生物膜的主要成分，并且能够容易地从各种容易获得的来源(例如蛋黄或大豆)中使用己烷进行机械或化学提取而获得。PPC防止脂肪堆积，并用于治疗由脂肪肝、心肌缺血、脑血管疾病和痴呆引起的肝衰竭。最近也在美国、欧洲和世界其它地方引入PPC用于肥胖治疗的脂解。DCA是次级胆汁盐之一，其是肠道细菌的代谢副产物。DCA自从其发现以来已在人类医学的各个领域中使用，并且与PPC混合公开地用于脂解注射。DCA已经用于改善PPC的水溶性，而最近已经用于改善药物例如两性霉素B、TaxolTM和地西泮的水溶性。高度纯化的PPC能够与DCA、抗菌剂、苯甲醇和水组合以形成能够被快速灭菌并用于静脉内给药的稳定的混合胶束制剂。1966年，研究人员指出，静脉注射含PPC的溶液可以去除脂肪栓塞。后来，在德国批准了含有5％PPC和4.75％DCA的称作的药物制剂，并用于治疗脂肪栓塞、血脂异常和酒精诱导的肝硬化。在洗涤剂当中，胆汁盐是脂质双层膜的特别有效的增溶剂。所有生物细胞膜由相同的双脂质层结构组成，因此受到洗涤剂的溶解。通过洗涤剂使细胞膜溶解包括洗涤剂在脂质双层之间的分布、双层的去稳定化、崩解和随后形成混合胶束(由洗涤剂和细胞膜脂质组成)。胆汁盐和其它洗涤剂降低不混溶材料的边界处的表面张力，并使得大聚集体分解成越来越小的颗粒。在组织中，这些试剂溶解细胞膜并引起细胞溶解。通过细胞溶解产生炎症反应，引起身体去除洗涤剂溶解的材料。最近，Kythera生物制药公司，一家位于美国的私人公司，正在使用PPC免费版本的DCA开发脂肪溶解注射剂。基于PPC作为DCA中乳化剂的作用及其在治疗高脂血症中的用途，已假定PPC作为脂解注射剂中的活性成分。加入这些现有技术组合物中的洗涤剂，例如DCA，仅仅是为了分散或溶解假定的活性成分PPC。然而，证明DCA实际上是局部脂肪乳化的活性剂。因为DCA是胆汁盐家族中的强洗涤剂之一，所以单独治疗PPC和DCA或DCA会引起不期望的不良反应。给药DCA引起注射部位周围组织的破坏。使用DCA用于身体脂肪去除也与包括疼痛、灼烧感、麻木、瘀伤、水肿、肿胀、色素沉着和硬结的明显负面作用相关。此外，以前的研究人员揭示了暴露于DCA后乳腺癌或结肠癌的风险增加。虽然满足了一些成功，但现有技术和组合物已经遇到一定限制。因此，需要一种不需要外科手术或延长的恢复时间并且比目前可用的方法具有更少的不良副作用的减少局部脂肪堆积的方法。本发明满足了该需要。技术实现要素：本发明提供了用于非外科手术去除受试者中的局部脂肪沉积物的制剂。在一个实施方式中，该制剂包含在pH小于9的药学上可接受的制剂中的脂肪溶解浓度的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。在一个实施方式中，该制剂的pH小于8。在另一个实施方式中，该制剂的pH小于7.5。在一个实施方式中，该制剂包含浓度为约0.5％至约4.0％的脂肪溶解浓度的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。在另一个实施方式中，浓度为约0.5％至约2.0％。在一个实施方式中，制剂还包含选自由抗炎剂、止痛剂、分散剂和促渗剂所组成的组中的至少一种另外的活性成分。在一个实施方式中，该制剂还包含治疗剂，该治疗剂选自由抗菌剂、抗血栓形成剂、抗凝血剂、抑泡剂、抗炎剂、麻醉剂、止痛剂、类固醇、镇定剂、抗分散剂和肌肉松弛剂所组成的组。在一个实施方式中，制剂是可注射制剂。在另一个实施方式中，制剂是脂解注射制剂。本发明还提供用于在具有局部脂肪堆积的受试者中非外科手术去除局部脂肪沉积物的方法。在一个实施方式中，该方法包括给药包含脂肪溶解浓度的在pH小于9的药学上可接受的制剂中的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的制剂。在一个实施方式中，该给药步骤包括皮下注射。在一个实施方式中，该局部脂肪堆积选自由下眼睑脂肪疝出、脂肪瘤、脂肪代谢障碍、和与脂肪团相关的脂肪沉积物所组成的组。在一个实施方式中，脂肪沉积物局部位于受试者的眼下、下巴下、腋下、臀部、小腿、背部、大腿、踝部或胃部。本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包括：(a)第一容器，所述第一容器包含用于非外科手术除去受试者中的局部脂肪沉积物的制剂，该制剂包含脂肪溶解浓度的在pH小于9的药学上可接受的制剂中的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种；和(b)在不使用外科手术下使用该制剂减少受试者中的脂肪沉积物的书面说明书。在一个实施方式中，第一容器包含治疗剂，该治疗剂选自由抗菌剂、抗血栓形成剂、抗凝血剂、抑泡剂、抗炎剂、麻醉剂、止痛剂、类固醇、镇定剂、抗分散剂和肌肉松弛剂所组成的组。在一个实施方式中，该试剂盒还包括第二容器，其中第二容器包含第二治疗剂，该第二治疗剂选自由抗菌剂、抗血栓形成剂、抗凝血剂、抑泡剂、抗炎剂、麻醉剂、止痛剂、类固醇、镇定剂、抗分散剂和肌肉松弛剂所组成的组。附图说明当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确设置和手段。图1，包括图1A至图1C，是示出3T3-L1前脂肪细胞分化的一系列图像。用分化培养基(MDI培养基)处理3T3-L1前脂肪细胞(图1A)，洗涤并固定分化的脂肪细胞(图1B)。用0.2％triton-X100渗透后，将细胞用油红O染色(图1C)，并在200X放大倍率下拍照。图2，包括图2A至图2C，是示出洗涤剂对3T3-L1脂肪细胞的细胞溶解效应的一系列图像。将分化的3T3-L1脂肪细胞暴露于脱氧胆酸盐(DCA)、鹅脱氧胆酸盐(CDCA)、牛磺熊脱氧胆酸盐(TUDCA)和胆酸盐(CA)(0～0.1％)(图2A)；TUDCA和CA(0～2％)(图2B)以及熊脱氧胆酸盐(UDCA)、猪脱氧胆酸盐(HDCA)和CA(0-1％)(图2C)1小时，并通过溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)试验测定细胞存活率。除TUDCA外的所有洗涤剂显示出剂量依赖性细胞溶解作用。对于每次处理，进行三次重复的实验。结果表示为与未处理对照相比的活细胞的总百分数。图3，包括图3A和图3B，是示出在DCA、CDCA、HDCA和CA处理后测量脂肪垫溶解的一系列图。从饮食诱导的肥胖小鼠切下95-100mg脂肪组织，并暴露于不同浓度的DCA、CDCA和CA(图3A)和HDCA(图3B)。通过MTT测定法测量脂肪组织的存活率，并通过分光光度计测量相对吸光度(OD570)。增加洗涤剂的浓度产生更显著的脂肪组织溶解。对于每次处理，进行五次重复实验。图4是示出高脂肪饮食喂养的小鼠的平均体重增加的图。每隔两周监测体重。图5，包括图5A和图5B，是示出注射有1％DCA、CDCA、CA和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的肥胖小鼠的体重(图5A)和腹股沟脂肪垫重量(图5B)的一系列图。将胆汁盐(DCA、CDCA和CA)溶液注射到小鼠的右腹股沟脂肪垫。使小鼠的左腹股沟脂肪垫接收相同体积的PBS(作为对照)。在2周期间重复注射4次以上。在最后一次注射4天后处死小鼠，并解剖腹股沟脂肪垫，并测量其重量。图6是描述在给药胆汁盐的小鼠的脂肪垫中观察到的组织学变化的图像。在注射胆汁盐和PBS后，解剖注射区域的脂肪组织。将解剖的组织用多聚甲醛固定，包埋在石蜡块中，并切片成载玻片。通过H&E染色观察组织损伤和坏死。图7是坏死面积测定的代表性过程。注射24小时后获得的氯化2,3,5-三苯基四唑鎓(TTC)染色的脂肪垫的图像。将正常组织染成红色，将坏死区域染成白色，并使用图像分析系统量化。使用图像分析系统(ImageJ；NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,USA)测量坏死面积(白色，未染色区域)。图8是示出体内坏死面积的量化的图。切开注射以不同浓度的胆汁盐(DCA、CDCA和CA)和PBS的脂肪垫，通过TTC染色(每组中n＝8)来确定坏死面积。增加洗涤剂的浓度产生更显著的脂肪组织溶解。图9是在各种(DCA、CA、CDCA)胆汁盐和载体(PBS)处理后的TTC染色的脂肪垫的代表性图像。图10，包括图10A和图10B，是描述与正常PBS相比的组织存活率(图10A)和在MTT测定后的相对吸光度(图10B)的一系列图。将小鼠腹股沟脂肪垫暴露于含有CA、DCA和CDCA的不同浓度的盐(0～200mM氯化钠)的磷酸盐缓冲液中。将95～100mg脂肪组织用在各种盐浓度中的EC50浓度的DCA、CDCA和CA(在正常PBS中显示组织存活率降低50％的浓度)培养。对于每次处理，进行五次重复实验。图11，包括图11A至图11D，是示出在各种pH条件(pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)下暴露于DCA、CDCA、CA、HDCA和PBS的小鼠腹股沟脂肪垫的存活率(图11A，11C)和相对吸光度(图11B，11D)的一系列图。在各种pH条件下将95～100mg脂肪组织用EC50浓度的DCA、CDCA，HDCA和CA培养。通过MTT测定法测量脂肪组织的存活率，并通过分光光度计测量吸光度(OD570)。对于每次处理，进行五次重复实验。图12，包括图12A至12C，是示出相对坏死面积的一系列图。将注射有不同浓度的DCA、CDCA和CA(图12A)、UDCA(图12B)、HDCA(图12C)的脂肪垫解剖，通过TTC染色(每组中n＝10)确定坏死面积。使用图像分析系统测定坏死面积(白色，未染色区域)。注射较高浓度的洗涤剂产生更显著的脂肪组织溶解。图13是示出在给药胆汁盐后在小鼠脂肪垫中观察到的组织学变化的一系列图像。将脂肪组织解剖并用多聚甲醛固定，包埋在石蜡块中，并在注射1.5％CA、1.5％HDCA和1.5％UDCA溶液后切片成载玻片。通过H&E染色在HDCA或UDCA处理过的组织中观察多形核(PMN)细胞到脂肪垫组织中的渗透。图14，包括图14A至14C，是示出各种胆汁盐对3T3-L1脂肪细胞的细胞溶解作用的一系列图。将分化的3T3-L1脂肪细胞暴露于牛磺胆酸盐(TCA)、甘氨胆酸盐(GCA)、CA、牛磺脱氧胆酸盐(TDCA)、甘氨脱氧胆酸盐(GDCA)、DCA、牛磺鹅脱氧胆酸盐(TCDCA)和CDCA(图14A-14C)1小时，通过MTT测定法测量细胞存活率。所有洗涤剂显示出剂量依赖性细胞溶解作用。牛磺酸、甘氨酸的共轭不影响CA、DCA和CDCA的细胞溶解活性。对于每次处理，进行三次重复实验。结果表示为与未处理对照相比的活细胞的总百分数。图15，包括图16A和16B，是示出暴露在各种pH条件(pH6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)下的CA、GCA、TCA溶液和载体(PBS)中的小鼠腹股沟脂肪垫的组织存活率的一系列图像。在各种pH条件下，将95～100mg脂肪组织用0.1％GCA、TCA和CA培养。通过MTT测定法作为光密度(图16A)和相对吸光度(图16B)监测脂肪组织的存活率。光密度(图16A)和相对吸光度(图16B)对于每次处理，进行五次重复实验。图16是示出注射DCA、CA和PBS14天后的小鼠尾部的组织学检查的一系列图像。H&E染色显示出处理过的尾部中的皮下脂肪坏死。在处理过的尾部中也观察到肌肉和皮肤层的组织结构。图17，包括图17A至17E，是示出在将1％DCA、1.5％CA、0.8％CDCA、1.5％UDCA、1.5％HDCA和PBS注射到后爪中后的大鼠爪外观(图17A、17C)和爪厚度(图17B、17D、17E)的一系列图像。图18，包括图18A和18B，是示出在皮下注射不同浓度(0.5-1.5％；在pH7.4溶液中)的DCA、CA和PBS后小鼠皮肤外观(图18A)和皮肤损伤严重性(图18B)的一系列图像。具体实施方式本发明基于以下预料不到的发现：根据在体外和离体观察到的胆酸盐的活性，胆酸盐在体内的脂肪溶解作用是不可预测的。也就是说，尽管胆酸盐与体外脱氧胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐相比表现出相对低的溶解活性，但是胆酸盐在体内表现出优异的结果。例如，与脱氧胆酸盐的治疗相比，体内治疗胆酸盐治疗使得皮肤中的不良反应显著减少。胆酸盐的这种使得体内不良反应减少的预料不到的脂肪溶解作用支持胆酸盐作为脂解注射剂中的活性成分，特别是在从体外和离体结果无法预测的浓度下的使用。本发明通过提供用于减少脂肪沉积物的非外科手术方法解决了动物中的局部脂肪堆积问题。在一个实施方式中，本发明包括给药有效量的脂肪溶解浓度的在药学上可接受的制剂中的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。本发明涉及胆汁酸或其盐的减少动物，优选哺乳动物，更优选人类中脂肪的用途。在一个实施方式中，胆汁酸或其盐是胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。在一个实施方式中，本发明涉及胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的通过向目标部位局部给药药学上可接受的制剂来减少哺乳动物中的皮下脂肪堆积的用途。在一个实施方式中，制剂是脂解注射剂的形式。本发明涉及减少哺乳动物中脂肪沉积物的方法，包括使脂肪沉积物与包含胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的制剂接触。在另一个实施方式中，本发明涉及用胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种处理脂肪团和多余脂肪沉积物从而使与脂肪团和多余脂肪沉积物相关的脂肪细胞溶解的方法。在另一个实施方式中，本发明涉及通过控制制剂的pH以改善胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的活性的脂肪去除方法。在一个实施方式中，包含胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的制剂可以配制成具有小于约9的合适的pH。定义除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文中所述相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是描述了优选的方法和材料。如本文所使用的，以下术语中的每一个具有在该部分中与其相关联的含义。在本文中使用的冠词“一”和“一个”用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。作为示例，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。当涉及可测量的值例如量、时距等时，本文中所用的“约”意在包括从指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，因为这样的变化适于进行所公开的方法。如果疾病或失调的症状的严重程度、患者经受这种症状的频率或两者都减轻，则疾病或失调被“减轻”。本文中所用的术语“胆汁酸”包括在动物(例如人)的胆汁中发现的类固醇酸(和/或其羧酸根阴离子)及其盐，包括作为非限制性例子的胆酸、胆酸盐、脱氧胆酸、脱氧胆酸盐，猪脱氧胆酸、猪脱氧胆酸盐、甘氨胆酸、甘氨胆酸盐、牛磺胆酸、牛磺胆酸盐、鹅脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸盐、石胆酸、石胆酸盐等(及其盐)。术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指可用于检验本文中所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。如本文所用，术语“组合物”或“药物组合物”是指至少一种本发明化合物与其它化学组分例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物有助于将化合物给药于生物体。如本文所用，术语“有效量”、“药学有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足够量的试剂，以提供所需的生物学结果。该结果可以是疾病的体征、症状或病因的减少和/或减轻，或生物系统的任何其它所需的改变。在任何个体情况下的适当治疗量可由本领域普通技术人员使用常规实验确定。如本文所用，术语“功效”是指在测定中达到的最大效果(Emax)。如本文所用，“指导材料”包括试剂盒中能够用于传达本发明的化合物、组合物、载体或输送系统的有用性以实施本文所述的各种疾病或失调的缓解的出版物、记录、图表或任何其它表现媒介。任选地或可替选地，指导材料能够描述减轻哺乳动物的细胞或组织中的疾病或失调的一种或多种方法。本发明的试剂盒的指导材料可以，例如缀附到含有本发明的经鉴定的化合物、组合物、载体或输送系统的容器，或者与含有经鉴定的化合物、组合物、载体或输送系统的容器一起运送。可替选地，指导材料可以与容器单独地运送，使得指导材料和化合物能够由接受者协同使用。“局部给药”是指通过非全身途径将药剂给药至患者的肌肉或皮下位置附近。因此，局部给药不包括全身给药途径，例如静脉内给药或口服给药。“外围给药”是指给药到远离有症状的位置，与局部给药相反。“药学上可接受的”是指关于组合物、制剂、稳定性、患者接受度和生物利用度，从药理学/毒理学角度来说使患者可接受的那些性质和/或物质以及从物理/化学角度来说使制造药学药剂师可接受的那些性质和/或物质。“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对其给药的宿主无毒性的介质。“治疗性”治疗是对表现出病理学体征或症状的受试者给药的治疗，目的是减少或消除这些体征或症状。本文所使用的术语“治疗”被定义为将治疗剂，即本发明的化合物(单独或与另一种药剂组合)施加或给药于患者，或将治疗剂施加或给药于从具有本文关注的病症(具有本文关注的病症的症状或具有形成本文关注的病症的可能)的患者分离的组织或细胞系(例如用于诊断或离体应用)，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、缓和、改善或影响本文关注的病症、本文关注的病症的症状或形成本文关注的病症的可能性。基于从药理学领域获得的知识，可以特异性地调整或改进这样的治疗。“治疗有效量”是当给药至患者时改善疾病的症状的本发明的化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、疾病状态及其严重性、待治疗的患者的年龄等而变化。治疗有效量可以由本领域普通技术人员考虑到他自己的知识和本公开来常规地确定。范围：遍及本公开始终，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式的描述仅仅是为了方便和简明性，而不应被解释为对本发明的范围的固定限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论该范围的宽度如何，这都适用。说明胆汁盐的稳定性和活性很大程度上受其pH条件的影响。本发明部分地涉及通过调节pH条件来改善胆汁盐注射的安全性的观测。本发明涉及以下发现：在合适的pH范围内合适浓度范围的胆汁盐的组合对于通过减少不良反应实现期望的治疗结果是重要的。例如，较低浓度的胆汁盐可用于较低pH制剂，因为较低pH条件增强胆汁盐的细胞溶解活性。优选地，所用的较低pH不会增加胆汁盐制剂的副作用。因此，可以在适当的pH条件下将副作用与细胞溶解活性区分开。因此，在一些情况下，在较低pH制剂中使用较低浓度的胆汁盐可以降低副作用，而不会降低胆汁盐的细胞溶解活性。在脱氧胆酸盐的情况下，在较低pH溶液中观察到脱氧胆酸盐的沉淀。因此，脱氧胆酸盐需要更高的pH缓冲液。然而，高于生理的pH溶液显示出不良反应。因此，本发明提供了与脱氧胆酸盐制剂相比提供了另外的优点(例如减少不良反应)的生理pH和低浓度的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐溶液中的一种或多种的制剂。本发明基于胆酸盐在体内的预料不到的脂肪溶解作用，其中胆酸盐在其它脱氧胆酸盐显示出副作用的浓度下不对受体表现出副作用。因此，本发明提供了胆酸盐的制剂，其中胆酸盐的浓度可以高于脱氧胆酸盐的浓度，但对患者表现出减少的副作用。在另一方面，本发明提供了胆酸盐的制剂，其中胆酸盐的浓度可以与脱氧胆酸盐的浓度相同，但是引起更大程度的脂肪溶解作用，同时对患者表现出减少的副作用。因此，本发明提供了更安全的脂解注射剂，该脂解注射剂包含与使用脱氧胆酸盐相比不会表现出副作用的有效浓度的胆酸盐。在一个实施方式中，本发明提供了使用胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种作为用于哺乳动物中脂肪减少的活性成分的组合物和方法。在一个实施方式中，本发明提供了在脂解注射剂中使用胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的组合物和方法。在一个实施方式中，本发明提供了用于非外科手术减少需要其的患者中的局部脂肪沉积物的组合物和方法，其中该方法包括使用包含药理上活性的胆汁酸或其盐，例如胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐的组合物。本发明的组合物还可以包括其它试剂，例如抗炎剂、止痛剂、分散剂和药学上可接受的赋形剂。本发明的组合物可用于治疗哺乳动物的包括眼下、下巴下、腋下以及臀部、小腿、背部、大腿、踝部或胃部的脂肪沉积物的局部脂肪堆积。在另一个实施方式中，所述方法可以减少特定类型的脂肪沉积物，例如，眼睑脂肪疝出、脂肪瘤、脂肪代谢障碍、水牛背脂肪代谢障碍或与脂肪团相关的脂肪沉积物。在一个实施方式中，脂肪减少不需要外科手术过程例如脂肪抽吸。在一个实施方式中，本发明的组合物被配制成适于直接注射到需要减少脂肪的患者的治疗部位，而不需要外科手术干预。在一个实施方式中，非外科手术的脂肪去除方法不包括脂肪抽吸、脂肪塑形术或吸脂切除术。在一个实施方式中，本发明提供了用于减少皮下脂肪沉积物以及收紧松弛皮肤的组合物、方法和试剂盒。组合物本发明提供了用于非外科手术减少或去除需要其的患者中的局部脂肪沉积物的组合物。在一个实施方式中，组合物包含有效脂肪溶解量的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。在一个实施方式中，本发明的组合物可用于治疗包括下眼睑脂肪疝出、脂肪代谢障碍和与脂肪团相关的脂肪沉积物的局部脂肪堆积。优选地，使用本发明的组合物，从而不需要外科手术过程例如脂肪抽吸。在一个实施方式中，本发明提供了生物相容性胆汁酸或其盐的组合物，该组合物包括一种或多种药理学活性胆汁酸及其盐和以水性载体的药学上可接受的赋形剂。特别地，在本发明的范围内，药理学活性胆汁酸或其盐用于溶解脂肪。在本发明中包括多种胆汁酸及其盐。例如，本发明中包括的胆汁酸及其盐选自胆酸、鹅脱氧胆酸及其任何盐。在多个方面，任何胆汁酸或胆汁酸轭合物可以是生理学上可接受的盐的形式，例如钠盐或与胆酸或鹅脱氧胆酸的牛磺酸或甘氨酸的轭合物。在一个方面，术语胆酸指胆酸的钠盐。在一个实施方式中，胆酸(胆酸盐)是本发明制剂中的活性成分。在另一方面，术语鹅脱氧胆酸指鹅脱氧胆酸的钠盐。在一个实施方式中，鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸盐)是本发明制剂中的活性成分。在一些情况下，术语胆酸盐化合物、胆酸盐和胆酸可互换使用。在一些情况下，术语鹅脱氧胆酸盐化合物、鹅脱氧胆酸盐和鹅脱氧胆酸可互换使用。在一个实施方式中，在本文中提供足量的合适胆汁酸作为定义的药物组合物。一方面，特定的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐药物组合物不含动物来源的所有部分和哺乳动物和/或细菌热原的所有部分。在另一方面，提供足够量的合适的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种作为定义的药物组合物，该药物组合物可以与相关组合物一起用作用于局部脂肪去除的可注射药物组合物。本发明的定义的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐注射液中的一种或多种可以与引起脂肪死亡的分子组合。在一些实施方式中，胆汁盐包括选自由钠(Na+)、钾(K+)、锂(Li+)、镁(Mg2+)、钙(Ca2+)、钡(Ba2+)、锶(Sr2+)和铵(NH4+)所组成的组中的阳离子。在一些实施方式中，洗涤剂包含具有阳离子的胆汁盐，所述阳离子是碱金属或碱土金属。优选地，碱金属是钠(Na+)、钾(K+)、或锂(Li+)，且碱土金属是镁(Mg2+)、钙(Ca2+)、钡(Ba2+)或锶(Sr2+)。在某些实施方式中，在本文中所述的方法和组合物中使用的胆汁盐是药学上可接受的盐，包括作为非限制性例子的其钠盐和钾盐。在某些实施方式中，本发明的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐组合物中的一种或多种的浓度可以为以重量或体积计的本组合物的约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％或其中可得到的任何范围。因此，预计胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐组合物中的一种或多种可以包含任意组合或百分数范围内的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。在一个实施方式中，本发明的组合物在溶液中。优选地，该溶液是水性的。在一个实施方式中，本发明涉及用于皮下注射的溶液，其包含：(i)治疗有效量的一种或多种药理学活性胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐；和(ii)药物、兽用药或化妆品赋形剂。在一些实施方式中，溶液可以进一步包含选自以下所组成的组中的第二治疗剂：抗菌剂、血管收缩剂、抗血栓形成剂、抗凝血剂、抑泡剂、抗炎剂、止痛剂、分散剂、抗分散剂、促渗剂、类固醇、镇定剂、肌肉松弛剂和抗腹泻剂。在一些实施方式中，溶液在含有高达500mL溶液的容器中。这种容器可以是注射器或可注射器装载的容器。组合物(例如溶液)包括治疗有效量的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。该治疗有效量有效地减少皮下脂肪沉积物或收紧具有副作用的松弛皮肤区域。本发明的溶液中的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种可以为约0.001至10、0.01至5或0.1至2％w/w、w/v或v/v的浓度。优选地，溶液中胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种可以为约0.1-5w/w或更优选约1％w/w的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种被配制成在低于约9的pH下，以使胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种有效地溶解脂肪。在一个实施方式中，将胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种配制成在低于约8的pH下，以使胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种有效地溶解脂肪。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种被配制成在低于约7.5的pH下，以使胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种有效地溶解脂肪。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种被配制成在低于约7.0的pH下，以使胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种有效地溶解脂肪。优选地，制剂是液体制剂，其中胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在25℃下处于稳定形式。如本文所用，稳定形式不是凝胶形式或沉淀形式。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种被配制成约0.5％至约4.0％的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种被配制成约0.5％至约2.0％的浓度。优选地，制剂是液体制剂，其中胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在25℃下处于稳定形式。如本文所用，稳定形式不是凝胶形式或沉淀形式。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约9的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约4.0％的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约8的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约4.0％的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约7.5的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约4.0％的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约7的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约4.0％的浓度。优选地，制剂是液体制剂，其中胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在25℃下处于稳定形式。如本文所用，稳定形式不是凝胶形式或沉淀形式。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约9的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约2.0％的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约8的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约2.0％的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约7.5的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约2.0％的浓度。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在小于约7的pH缓冲液中被配制成约0.5％至约2.0％的浓度。优选地，制剂是液体制剂，其中胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在25℃下处于稳定形式。如本文所用，稳定形式不是凝胶形式或沉淀形式。在一个实施方式中，本发明提供在25℃下处于稳定形式的在小于约8的pH缓冲液中浓度为约0.5％至约2.0％的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的制剂。本发明制剂的优点是，当使用较高pH溶液和较高胆汁盐浓度时，生理pH和低浓度的胆汁盐溶液减少了不良反应。方法本发明的组合物可应用于许多临床情况。本发明涉及一种或多种药理学活性的胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的用途，以通过将这种制剂局部给药于靶部位来减少哺乳动物的皮下脂肪堆积。该组合物的其它用途可以包括溶解脂肪瘤、脂肪，美塑疗法，分离组织，减少肿瘤，降低癌症，癌症治疗以及其中人们可能希望使用其松动、移除、辅助身体消耗或从身体的一部分或区域分解蜡、脂类、蛋白质或碳水化合物的任何其它临床情况。例如，在脂肪瘤的治疗中，组合物可以通过皮下注射与脂肪瘤接触以溶解脂肪瘤。也可以使用对脂肪瘤给药的任何其它合适的方法。在一个实施方式中，本发明的组合物用于减少受试者中的脂肪沉积物。在一些情况下，脂肪沉积物与选自以下组成的组中的病症相关：肥胖症、脂肪重新分布综合征、眼睑脂肪疝出、脂肪瘤、德尔肯氏病、脂肪代谢障碍、水牛背脂肪代谢障碍、颈背面脂肪、内脏肥胖症、乳房肿大、肥胖过度、躯干和手臂周围的扩散体脂肪，以及与脂肪团有关的脂肪沉积物。在优选的实施方式中，本发明的方法不包括对受试者进行外科手术。本发明的组合物可用于治疗肉芽肿、疤痕、肿瘤、痤疮囊肿、皮脂腺囊肿、皮脂增生、皮脂疾病、痤疮相关的皮肤病、皮下脂肪疾病、肿瘤、纹身去除、感染和生物膜、脂肪团、脂肪沉积物、脂肪组织和相关病症。它还可以用于使皮肤轮廓缺陷(例如乳房不对称或唇部不对称，例如在用皮肤填充物过度校正或身体对注射的高度反应之后)变平。这种过程可以在活的组织、从身体取出的组织中进行，或用于病理评估或检测评估中的辅助。它可以在组织、血清或任何其它身体部分上进行。除了人类护理之外，该组合物还适用于动物护理。在一个实施方式中，本发明涉及用于减少受试者的脂肪的方法。该方法包括以下步骤：将本发明的组合物局部给药于目标区域。在一些实施方式中，给药步骤涉及通过皮下注射或透皮注射输送本发明的组合物。在一些实施方式中，给药步骤涉及通过真皮贴片、泵或皮下储存处输送本发明的组合物。在一些实施方式中，给药步骤涉及局部或皮下输送本发明的组合物。在一些实施方式中，被治疗的靶部位的区域在眼下、下巴下、腋下、臀部、脸颊、眉头、小腿、背部、大腿、踝部或胃部。在一些实施方式中，用于减少受试者的脂肪的组合物用皮肤收紧溶液配制。该皮肤收紧溶液还可以包含选自以下所组成的组中的第二治疗剂：抗菌剂、血管收缩剂、抗血栓形成剂、抗凝血剂、抑泡剂、抗炎剂、止痛剂、分散剂、抗分散剂、促渗剂、类固醇、镇定剂、肌肉松弛剂和抗腹泻剂。在一些实施方式中，本发明的方法不包括对受试者进行外科手术。在某些实施方式中，本发明的第一治疗和第二治疗之间的时间为至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少12周、至少13周、至少14周、至少15周、至少16周、至少17周、至少18周、至少19周、至少20周、至少21周、至少22周、至少23周、至少24周、至少25周、至少26周、至少27周、至少28周、至少29周、至少30周、至少31周、至少32周、至少33周、至少34周、至少35周、至少36周、至少37周、至少38周、至少39周、至少40周、至少41周、至少42周、至少43周、至少44周、至少45周、至少46周、至少47周、至少48周、至少49周、至少50周、至少51周、至少52周或更长。药物组合物在一个实施方式中，本发明提供了在小于约9、小于约8、小于约7.5或小于约7的pH缓冲液中包含胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种的液体药物组合物。在一个实施方式中，胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种在25℃下在液体药物组合物中是稳定的。在一个实施方式中，在25℃下在液体药物组合物中是稳定的意味着胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种不是凝胶形式或沉淀形式。本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或以后开发的任何方法制备。通常，这种制备方法包括将活性成分与载体或一种或多种其它辅助成分结合的步骤，然后如果必要或需要，将产品成形或包装成所需的单剂量单位或多剂量单位。尽管对本文提供的药物组合物的描述主要针对适于对人类进行处方给药的药物组合物，但本领域技术人员应理解，此类组合物通常适于给药于所有种类的动物。对适于给药于人类的药物组合物的改性以使所述组合物适于给药于各种动物是众所周知的，且普通技术的兽医药理学专家能够仅使用普通(如果有的话)实验来设计和进行这种改性。考虑给药本发明的药物组合物的受试者包括但不限于，人和其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物例如非人灵长类动物、牛、猪、马、羊、猫和狗。可用于本发明方法的药物组合物可以以适于眼内给药、口服给药、直肠给药、阴道给药、肠胃外给药、局部给药、肺给药、鼻内给药、面颊给药或其它给药途径的制剂制备、包装或销售。其它预计的制剂包括喷射的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新封闭的红细胞和基于免疫的制剂。本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量制备、包装或成批销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将给药于受试者的活性成分的剂量或该剂量的适当分数，例如该剂量的一半或三分之一。本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何另外的成分的相对量将根据被治疗的受试者的特征、大小和状况而变化，并且还取决于组合物的给药途径。例如，组合物可以包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。本发明的药物组合物的控释制剂或缓释制剂可以使用传统技术制备。药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包含其它成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌可注射制剂可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如水或1,3-丁二醇)制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏液、等渗氯化钠溶液和固定油例如合成的单甘油酯或二甘油酯。其它可用的可肠胃外给药的制剂包括那些包含微晶形式的、脂质体制剂中的或作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的制剂。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物材料或疏水性材料，例如乳剂、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。本发明的药物组合物可以以适于口腔给药的制剂制备、包装或销售。这种制剂可以例如为使用传统方法制备的片剂或锭剂的形式，并且可以包含例如0.1至20％(w/w)活性成分，余量包含可口服溶解或可口服降解的组合物，和任选地，本文所述的另外的成分中的一种或多种。可替选地，适于口腔给药的制剂可以包含含有活性成分的粉末或雾化或气雾化溶液或悬浮液。这种粉末、雾化或气雾化制剂当分散时优选具有在约0.1至约200纳米范围内的平均颗粒或液滴尺寸，并且还可以包含本文所述的另外的成分中的一种或多种。如本文所用，“另外的成分”包括但不限于以下的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理上可降解的组合物例如明胶；水性载体和溶剂；油性载体和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂；缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合物材料或疏水材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其它“另外的成分”是本领域中已知的，并且在通过引用而并入本文中的例如Remington’sPharmaceuticalSciences(1985,Genaro,ed.,MackPublishingCo.,Easton,PA)中被描述。实验例通过参考以下实验例进一步详细描述本发明。除非另有规定，否则提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，而并不旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型例。无需进一步描述，相信本领域普通技术人员能够使用之前的描述和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下实施例具体指出了本发明的优选实施方式，而不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。实施例1：用于减少脂肪的胆汁酸和盐本文呈现的结果证明了预料不到的发现，即胆酸盐的脂肪溶解作用使得胆酸盐能够作为脂解注射液的活性成分，特别是在从体外和离体结果不能预测的浓度下使用。现在描述在这些实验中使用的材料和方法。体外细胞培养和脂肪细胞分化在37℃在5％CO2/95％空气的湿润气氛中将3T3-L1细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养至细胞覆盖。为了诱导脂肪细胞分化，将3T3-L1前脂肪细胞接种在96-孔板(5×103个细胞/孔)中并使其生长直到细胞覆盖后2天(第0天)，然后用生长培养基加MDI(0.5μM甲基异丁基黄嘌呤、1μM地塞米松和10μg/ml胰岛素；全部来自Sigma-AldrichChemical,St.Louis,MO,USA)处理2天，然后用仅含有10μg/ml胰岛素的培养基处理2天。在接下来的8天中每2天更换培养基。油红O染色诱导分化后7-10天，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗细胞两次，用10％福尔马林固定1小时，并用PBS洗涤三次。将细胞用过滤过的油红O(0.3％)工作溶液染色20分钟，将被染色的细胞用蒸馏水洗涤三次。使用配备有奥林巴斯数码相机的奥林巴斯倒置显微镜采集图像。洗涤剂在体外的细胞溶解作用将在96孔板中的分化的脂肪细胞用PBS洗涤两次，并在不含血清的DMEM中的不同浓度的胆汁盐中培养。在37℃培养1小时后，更换培养基，并将20μlMTT溶液(5mgMTT/ml在PBS中)加入每个孔中，并在37℃培养1小时。将所得甲瓒产物溶解于100μlDMSO/孔中，通过使用酶标仪测量570nm下的光密度(OD570)来确定细胞存活率。来自小鼠的脂肪组织的制备和离体脂肪溶解测定从饮食诱导的肥胖小鼠切下腹股沟脂肪(皮下脂肪)垫，并切成大约相同的大小。将100mg组织样品转移到48孔板中，并用350μl不同浓度和pH的DCA、CDCA、CA和磷酸盐缓冲液培养10分钟。将70μl的MTT溶液(5mg/ml在PBS中)加入每个孔中并在37℃下培养过夜。除去溶液，将沉淀的甲瓒产物溶于300μlDMSO中。通过使用酶标仪测量570nm下的光密度(OD570)来监测组织存活率。诱发小鼠的饮食诱导的肥胖症四周龄雄性C57BL/6N小鼠购自OrientBio(Sungnam,韩国)。从第4周开始到18周龄给小鼠喂食高脂肪饮食(D12331-包含58％的来自脂肪的卡路里，16.4％的来自蛋白质的卡路里和25.5％来自碳水化合物(主要是蔗糖)的卡路里；ResearchDiets,NewBrunswick,NJ,USA)。将小鼠在12小时光照/12小时暗处循环下在气候控制环境(22.8±2.0℃，45～50％湿度)中饲养。水和指定的饮食可随意获得。每隔一周监测个体小鼠的体重。体内监测胆汁盐诱导的脂肪减少将雄性C57BL/6N小鼠笼养并在12周期间喂食高脂肪饮食。通过将胆汁盐直接注射到皮下脂肪组织来监测胆汁盐的体内作用。简言之，在诱发饮食诱导的肥胖症后，用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为60mg/kg和12.5mg/kg；通过腹腔内注射给药)麻醉小鼠。用电子剪刀剃刮小鼠的注射部位。将100μl胆汁盐(DCA、CDCA和CA，1％w/v)注射到肥胖小鼠的右腹股沟脂肪垫中。在2周期间重复注射4次以上。使小鼠的左腹股沟脂肪垫接受相同体积的PBS作为对照。在最后一次注射4天后处死小鼠。测量每组小鼠的体重和腹股沟脂肪垫重量。解剖注射区域的脂肪组织，用10％福尔马林固定，并包埋在石蜡块中用于组织学检查。体内坏死面积的量化在诱发饮食诱导的肥胖症后，用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为60mg/kg和12.5mg/kg；通过腹腔内注射给药)麻醉小鼠。用电子剪刀剃刮小鼠的注射部位。将在100μl体积的PBS中的不同浓度的胆汁盐(DCA、CDCA和CA)溶液注射到肥胖小鼠的腹股沟脂肪垫。在注射1天后处死小鼠。用在PBS中的2％TTC(Sigma-AldrichChemical,St.Louis,MO,USA)将小鼠腹股沟脂肪垫染色2小时以鉴定非坏死面积和坏死面积，随后浸入10％福尔马林中以增强对比度。坏死面积显示为未被TTC染色的面积。坏死的脂肪区域的外观和面积被采集并通过扫描仪成像。DCA、CDCA、CA和PBS处理的脂肪垫的坏死面积由ImageJ计算。胆汁盐在水溶液中的稳定性为了测试胆汁盐的溶解度和稳定性，通过将磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶于水中来制备各种pH的磷酸盐缓冲液(10mM；pH6.5、6.7、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.3)。将0.01g胆汁盐(UDCA、DCA、CDCA和CA)溶解在1ml磷酸盐缓冲液中，并在室温下放置10天。体内监测胆汁盐的组织特异性作用将100μlDCA和CA(1％、0.5％和0.25％)和PBS注射入雌性ICR小鼠的尾部(距尾基部1cm处)。14天后处死小鼠，此时获得在注射部位处的组织并在4％福尔马林中固定。在注射部位处5mm内垂直于尾部的长轴切割标准组织切片。然后制备用于用苏木精和曙红(H&E)染色的样品。通过配备有奥林巴斯数码相机的奥林巴斯显微镜采集图像。对皮肤的不良反应的体内监测为了监测胆汁盐对皮肤的副作用，将不同浓度(1.5％、1％和0.5％，100μl体积)的DCA、CA和PBS皮下注射到小鼠板条中。第一次注射后3天重复注射1次。在最后一次注射4天后处死小鼠。使用以下标准评估皮肤损伤的严重程度。总的皮肤损伤严重程度评分定义为针对以下损伤特征和长度中的每个的单个评分的总和。通过测量所鉴定的最大损伤的最长直径来确定损伤的长度。所测量的长度应该仅涉及损伤，并且不跨越临床正常皮肤。在每个注射部位内损伤的长度从0到3评分，其中0＝不包含；1＝受影响部位的长度≤0.2cm，2＝受影响部位的长度为0.2～0.5cm，3＝受影响部位的长度>0.5cm。损伤的特征从0到3评分，其中0＝不存在损伤；1＝仅脱皮一处或一个小的点状痂皮(<2mm)；2＝多个小的点状痂皮或聚结痂皮(≥2mm)；3＝糜烂或溃疡。胆汁盐诱导的爪水肿雄性SD大鼠(6周龄)购自KoatechCo.(首尔,韩国)，并在驯化1周后使用。随机选择大鼠(200～230g)，并使用数字卡尺(Bluebird,首尔,韩国)在所有组中测量完整大鼠爪的体积。在诱导爪水肿之前，用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为60mg/kg和12.5mg/kg；通过腹腔内注射给药)麻醉大鼠。为了诱导水肿，使大鼠接受100μl不同胆汁盐和PBS到大鼠后足的足底区域中。在即将注射胆汁盐之前和注射后4小时，通过卡尺对爪体积进行测量。现在描述实验的结果。胆汁酸和盐的生物活性胆汁盐分子的生物活性与其化学性质(例如羟基的数目和位置或其轭合)紧密相关。这些参数直接影响其疏水性，其是毒性和洗涤剂强度的公知预测者。胆汁盐的亲水性指数不仅与羟基的数目成比例，而且还受它们在甾醇环两侧上的位置的影响。胆汁盐的洗涤剂能力直接影响它们的毒性。一般来说，更强的洗涤剂显示出更多的毒性。DCA通常用作生物洗涤剂以溶解细胞和溶解细胞组分，因为已知DCA是胆汁盐家族中最强的洗涤剂之一。使用DCA去除身体脂肪涉及显著的不良反应。为了避免严重的副作用，需要使用更安全的胆汁盐来代替DCA。然而，预期较少毒性的胆汁盐也将会具有弱的洗涤剂能力和生物活性。为此，使用测量细胞存活率的简单的量化测定法进行实验以相比于DCA的作用来比较各种胆汁盐的细胞溶解活性。为了监测脂肪细胞溶解活性，使用分化的3T3-L1脂肪细胞系(图1)。使用MTT测定法监测细胞存活率。在初步实验中，比较了不同浓度的胆汁盐(包括TUDCA、CDCA、CA、HDCA、UDCA和DCA)的细胞溶解作用。在低浓度(例如，低于0.1％)下，仅两种胆汁盐DCA、CDCA降低了脂肪细胞的存活率(图2A)。在相似浓度下，CDCA显示出与DCA类似的细胞溶解活性。为了测试高浓度的其余胆汁盐的溶解作用，使用高达2％浓度的CA和TUDCA进行实验。TUDCA的处理不会降低脂肪细胞的存活率。然而，在这些较高浓度下，CA显示出细胞杀伤(图2B)。在相似浓度下，HDCA和HDCA与CA相比显示出略高的细胞杀伤作用(图2C)。CA、HDCA和UDCA的细胞溶解活性大大低于DCA和CDCA。为了比较每种胆汁盐的相对细胞溶解活性，测量DCA、CDCA、HDCA、UDCA和CA的EC50(杀死50％细胞的浓度)。DCA、CDCA、HDCA、UDCA和CA的EC50分别为0.051％、0.060％、0.42％、0.25％和0.42％(表1)。CA的EC50比DCA和CDCA高约7～8倍。表1：在体外溶解脂肪细胞所需的胆汁盐的EC50值。洗涤剂ED50(％w/v)脱氧胆酸盐(DCA)0.0509鹅脱氧胆酸盐(CDCA)0.0597胆酸盐(CA)0.42猪脱氧胆酸盐(HDCA)0.249熊脱氧胆酸盐(UDCA)0.328体外条件的结果表明，DCA和CDCA能够有效地溶解脂肪细胞，因此被认为是脂解注射剂的组分。不希望受任何特定理论的束缚，TUDCA没有细胞溶解作用可能是由于其低的洗涤活性，表明TUDCA不适合于脂肪溶解注射剂。CA、HDCA和UDCA在体外条件下的非常低的溶解活性表明，可能需要非常高浓度的CA、HDCA和UDCA作为脂解注射剂的组分。因此，从本文所示的体外结果，认为仅仅CDCA能够有效地替代脂解注射剂中的DCA。然而，本文提供的结果证明，体外结果不总是代表真实的体内情况。例如，单层培养的细胞不能反映完整的组织结构。因为渗入完整组织可能会影响胆汁盐的细胞溶解活性，所以进行实验以测试不同浓度的DCA、CDCA、HDCA和CA的离体脂肪组织溶解效应。在12周内从喂食高脂肪饮食的C57BL/6N小鼠新鲜分离皮下脂肪组织。将脂肪组织在不同浓度的胆汁盐溶液中培养10分钟。通过MTT测定法测量组织溶解活性(图3)。所有四种胆汁盐溶液均显示出脂肪组织溶解作用。DCA和CDCA显示出与培养的细胞的结果相似的组织溶解活性。为了比较每种胆汁盐在离体条件下的相对溶解活性，计算了DCA、CDCA、HDCA和CA的EC50。DCA、CDCA、HDCA和CA的EC50浓度分别为0.0179％、0.0180％、0.0250和0.0727％(表2)。CA、HDCA的溶解活性仍低于DCA或CDCA。然而，与体外细胞培养实验(其中CA的EC50为DCA和CDCA的约7～8倍)相比，CA的EC50仅为DCA或CDCA的4倍。此外，与体外细胞培养实验(其中HDCA的EC50为DCA和CDCA的约4～5倍)相比，HDCA的EC50为DCA或CDCA的仅1.4倍。表2：离体脂肪组织溶解所需的胆汁盐的EC50值洗涤剂ED50(％w/v)脱氧胆酸盐(DCA)0.0179鹅脱氧胆酸盐(CDCA)0.018胆酸盐(CA)0.0727猪脱氧胆酸盐(HDCA)0.0250离体研究的结果表明，胆汁盐的溶解活性不能简单地从体外结果估计。离体条件比体外条件更复杂。例如，组织的结构能够影响每种胆汁盐对脂肪细胞的渗透，并且组织中内部结构的存在也能够影响胆汁盐的溶解活性。与体外结果相比，离体结果表明相对较低浓度的CA或HDCA可能足以溶解脂肪组织。然而，可能需要4倍高剂量的CA以获得与DCA或CDCA相似的脂肪溶解活性。基于离体结果，假设如果CA在体内或离体条件下相比于体内具有与DCA或CDCA相比的相似的对脂肪组织的溶解活性，则能够将由周围组织的损伤产生的不良反应与DCA或CDCA治疗区分开。为了测试这一点，进行实验以检测DCA、CDCA和CA的体内脂肪组织溶解活性。与体外条件和离体条件不同，体内条件具有甚至更复杂的方面和许多变量，例如给药药物的分布、排泄和代谢。将胆汁盐溶液直接给药于肥胖小鼠的皮下脂肪组织。通过向C57BL/6N小鼠喂食含有60％高脂肪的饮食来诱发小鼠的肥胖。在高脂肪喂养12周后，它们的体重达到约50克(图4)。在一个实验中，在2周期间将1％的胆汁盐溶液施加于腹股沟脂肪组织5次。与注射盐水的小鼠相比，注射胆汁盐的小鼠显示出减少的体重和皮下脂肪含量。有趣的是，减少的体重和脂肪含量与所有三种胆汁盐类似(图5A，图5B)。为了确保胆汁盐的组织溶解活性，对皮下脂肪组织的注射部位进行了观察(图6)。在注射盐水的小鼠的脂肪组织中没有观察到明显的异常损伤。接受了来自胆汁盐之一(例如DCA、CDCA和CA)的小鼠的脂肪组织在给药区域中显示出淡黄色损伤，其代表坏死的发炎部位。通过对注射区域的H&E染色来监测胆汁盐对组织结构的影响。与盐水的情况相比，所有三种胆汁盐的注射均诱导了脂肪组织结构的显著破坏。在DCA、CDCA和CA的注射区域中观察到纤维化区域。不希望受任何特定理论的束缚，认为重复给药胆汁盐可通过复发性炎症引起组织纤维化。这些结果表明所有三种胆汁盐均在活小鼠中具有脂解活性，并且在相同浓度下，DCA、CDCA和CA的体内作用相似。与体外条件或离体条件对比，重复给药CA的脂解作用与体内条件下DCA或CDCA的作用相容。尽管小鼠中体重和脂肪质量的减少由胆汁盐处理引起，但认为来自注射的胆汁盐和麻醉过程的副作用也能够影响经胆汁盐处理的小鼠的体重减轻。为了验证胆汁盐的体内作用，直接监测胆汁盐在活小鼠中的组织溶解活性(图7至图9)。为了量化脂肪组织的坏死面积，开发了使用TTC溶液的新的实验方法。TTC是通常用于具体表明缺血性休克后的梗塞面积的生物实验中的氧化还原指示剂。由于不同脱氢酶的活性，TTC在活组织中被酶促还原成红色1,3,5-三苯基甲瓒，而在坏死区域中保持白色。在TTC染色后，在坏死白色区域和活的红色区域之间形成明显的边界(图7)。白色坏死面积通过图像分析程序容易地测量。这种新方法提供了对化学品(如胆汁盐)的组织坏死作用的更加精确的计算，并使得能够比较不同材料的组织溶解作用。将不同剂量的DCA、CDCA或CA注射到肥胖的C57BL/6N小鼠的腹股沟脂肪。在注射胆汁盐一天后，测量被注射的小鼠的皮下脂肪的坏死面积(图8和图9)。注射的胆汁盐浓度的增加引起坏死面积的成比例增加。在反映体外数据和离体数据的相同剂量下，DCA和CDCA显示出相似的组织坏死。在相同浓度下，与DCA或CDCA相比，CA处理过的小鼠的坏死面积更小。然而，大约两倍高的CA浓度足以显示出与DCA和CDCA相似的坏死效应。DCA、CA、CDCA注射后的代表性图像示于图9中。总体而言，CA相对于DCA或CDCA的组织溶解作用在体外、离体和体内条件下是不同的。通常，活性试剂的体内剂量效果可以通过体外或离体实验推测。然而，在许多情况下，体内的意外作用影响试剂的真实生物活性。因此，体外结果或离体结果不能被轻易地解释为体内条件。本文提供的体外数据和离体数据显示出，与DCA或CDCA相比，溶解组织所需的CA剂量高4倍以上。然而，体内数据表明，这种较高剂量的CA并不是实际脂肪溶解作用所需要的。胆汁盐的洗涤活性代表脂质或蛋白质的增溶能力。因此，预计细胞溶解活性与洗涤剂的活性成比例。因为，DCA和CDCA比CA具有更强的洗涤活性，所以它们也显示更高的细胞溶解活性。然而，胆汁盐的体内细胞溶解活性不仅仅代表胆汁盐的洗涤能力。CA的这种预料不到的脂肪溶解作用使得能够使用CA作为脂解注射剂的活性成分，特别是在从体外结果和离体结果无法预测的浓度下。溶液中盐的浓度也能够影响胆汁盐的洗涤活性。测试氯化钠浓度对胆汁盐的脂肪溶解活性的影响。将来自饮食诱导的肥胖小鼠的腹股沟脂肪组织在含有不同浓度的氯化钠的多个溶液中培养。将各胆汁盐的浓度在pH7.4下调节至EC50。然而，不同浓度的钠盐的处理没有对各个胆汁盐的脂肪溶解活性产生任何影响(图10)。洗涤剂溶液的pH可影响胶束的形成和洗涤活性。为了测试胆汁盐的pH对脂肪溶解活性的影响，将来自饮食诱导的肥胖小鼠的腹股沟脂肪组织在不同pH条件(pH6.0～pH9.0)下的DCA、CDCA、HDCA和CA中培养。通过磷酸盐缓冲液调节胆汁盐溶液的pH。将各胆汁盐的浓度在pH7.4下调节至EC50。有趣的是，溶液的pH增加大大降低了CDCA、HDCA和CA的脂肪溶解活性(图11)。在DCA的情况下，在较低pH溶液中观察到DCA的沉淀。结果，与CA、HDCA或CDCA的情况相比，DCA的较高pH缓冲液没有显示出脂肪溶解活性的大大降低。高于pH9的CA和CDCA溶液大多失去其脂肪溶解活性。因此，使用CA或CDCA溶液进行有效的脂肪溶解需要低于9的pH。胆汁盐的稳定性受溶液pH的影响。进行实验以测试1％(w/v)胆汁盐在不同磷酸盐缓冲液(10mM；pH6.5、6.7、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.3，在25℃下)条件下的稳定性(图12)。在较低的pH下，观察到胆汁盐的沉淀或凝胶化。DCA、CDCA、HDCA、UDCA和CA的水溶液在pH分别低于8.3、7.4、7.4、7.8和7.0下保持稳定(表3)。通常，注射部位的不适或疼痛由pH比正常生理pH更低或更高的溶液引起。因为CDCA、HDCA和CA在正常pH下具有稳定的性质，所以它们用作注射剂成分与其它胆汁盐例如DCA和UDCA相比预期会减少不适和疼痛。表3：在不同pH下的胆汁盐的溶液稳定性(25℃，1％，在10mM磷酸盐缓冲液中)pH6.56.77.07.27.47.67.88.08.3DCA凝胶化凝胶化凝胶化凝胶化凝胶化凝胶化凝胶化凝胶化稳定CA沉淀沉淀稳定稳定稳定稳定稳定稳定稳定CDCA凝胶化凝胶化凝胶化沉淀稳定稳定稳定稳定稳定HDCA凝胶化凝胶化凝胶化凝胶化稳定稳定稳定稳定稳定UDCA沉淀沉淀沉淀沉淀沉淀沉淀稳定稳定稳定考虑到DCA溶液在生理pH下不稳定，用于脂解注射剂的DCA溶液的制剂必须高于pH8.3。具有较高pH的胆汁盐溶液显示出较低的组织溶解活性。因为CA、CDCA、UDCA和HDCA溶液在较低pH下是稳定的，预期较少量的CA、CDCA、UDCA和HDCA足以显示出与高pH的DCA溶液类似的组织溶解效应。为了测试这一点，通过在注射不同浓度的CA(pH7.0)和CDCA(pH7.4)溶液后监测组织坏死面积，选择在pH8.3的条件下显示出与1％DCA溶液相似的组织溶解活性的浓度。观察到在pH8.3的条件下DCA溶液的组织溶解活性低于在pH7.4的条件下的DCA制剂的活性。在相同的pH(pH7.4)条件下，注射约2％CA或1％CDCA溶液显示出与注射1％DCA类似的组织溶解活性。然而，1.5％CA(pH7.0)或0.6％CDCA(pH7.4)的浓度足以显示出与具有更高的pH(pH8.3)的1％DCA类似的组织溶解作用(图12A)。生理pH和低浓度的胆汁盐溶液能够提供另外的优点，例如减少不良反应。与CDCA和CA不同，UDCA或HDCA的组织溶解效应没有随更高浓度的UDCA或HDCA成比例地增加(图12B和图12C)。有趣的是，将UDCA或CDCA一次注射到皮下脂肪引起注射部位处的淡黄色结构(图13A)。H&E染色显示出大量多形核(PMN)细胞在注射部位处渗透(图13B)。在UDCA或HDCA注射后，预计淡黄色结构为形成PMN富集的渗出物(脓)的结果。通过UDCA或HDCA注射引起的PMN细胞的浸润和炎症可能是影响UDCA或HDCA的坏死活性的因素。在将UDCA或HDCA注射到皮下脂肪后观察到严重的炎症表明UDCA或HDCA不适合用作脂解注射剂的成分。胆汁盐与肝脏中的牛磺酸或甘氨酸轭合。测试了与牛磺酸或甘氨酸与胆汁盐的轭合对脂肪细胞溶解活性具有的任何影响。用甘氨酸或牛磺酸轭合形式的CA、CDCA和DCA对分化的脂肪细胞进行处理(图14和图15)。甘氨酸或牛磺酸轭合的胆汁盐的细胞溶解活性与非轭合形式的胆汁盐几乎相同。这些结果表明，通过甘氨酸或牛磺酸与胆汁盐的轭合对细胞溶解活性几乎没有影响。在不同条件下的脂肪溶解的不同方面也可以发生在其它组织中。尽管在体外条件下脂肪细胞的溶解作用与肌肉细胞的溶解作用没有大的差异，但是在体内条件下各组织溶解活性能够变化。因此，如果一些胆汁盐能够致使与脂肪组织相比减少的皮肤或肌肉溶解活性，则能够开发具有增加的安全性的脂解试剂。为了测试这一点，将在pH7.4溶液中的不同浓度的DCA和CA注射到小鼠的尾部，并评价尾部的组织完整性(图16)。因为尾部由脂肪、肌肉和皮肤组成，所以可以一次容易地监测各个组织层的完整性。与注射盐水相比，尾部脂肪层通过注射DCA和CA而被破坏。有趣的是，与相同浓度的CA注射过的尾部相比，DCA注射过的尾部的肌肉损伤显著。DCA或CA注射过的小鼠的皮肤层在两种情况下没有被严重损伤。水肿是由DCA注射引起的典型不良反应之一。在注射胆汁盐后，通过大鼠爪的厚度监测水肿的严重程度(图17)。将胆汁盐溶液的制剂调整为显示出类似组织溶解作用的浓度和pH(图17A和17B)。注射相同体积的PBS显示出爪厚度没有增加。相比之下，注射胆汁盐增加了大鼠爪的厚度。虽然所有胆汁盐组合物的组织坏死活性相似，但是各胆汁盐在水肿的严重程度上不同。给药DCA的爪显示最严重的水肿表型。与DCA相比，UDCA、HDCA和CDCA在注射后显示稍微较低的症状。最令人惊讶的是，与DCA相比，CA注射引起的肿胀非常轻微。由CA引起的足部厚度增加小于DCA情况的一半。这些结果通过用具有相同pH(pH7.4)的胆汁盐溶液处理来再现(图17C和17D)。与之前实验几乎相同的结果表明，pH不是影响胆汁酸注射后的水肿的因素(图17E)。接下来，测试胆汁盐在皮肤层中的副作用。将不同浓度的胆汁盐(调节至pH7.4)和PBS注射到活小鼠的皮下，监测皮肤的任何观察到的损伤(图18)。在PBS处理过的小鼠的皮肤中，未发现可检测到的损伤。用DCA处理在注射区域引起严重的皮肤损伤。即使在最低剂量(0.5％)的DCA处理也引起了皮肤上的小的点状损伤。在较高浓度的DCA注射部位发现大的损伤、糜烂和溃疡。与DCA相比，用CA注射在注射区域形成明显较少的损伤。在较高剂量的CA(1.5％)中仅观察到小的点状损伤。在较低剂量下，在CA处理过的小鼠的皮肤中没有发现可检测的损伤。通过在胆汁盐的注射部位上形成的损伤的尺寸和严重程度对皮肤的损伤进行评分。与最低剂量的DCA(0.5％)的处理相比，即使最高剂量的CA(1.5％)的处理也显示出较低的损伤分数。这些结果表明，与DCA的处理相比，CA的处理引起的皮肤的不良反应显著减少。有趣的是，与其它胆汁盐相比，只有脂解注射剂的市售成分DCA在生理pH下显示出不稳定性，并且在注射后具有更严重的不良反应。在所测试的胆汁盐当中，TUDCA在体外测试中不具有细胞溶解活性，而排除了进一步分析。虽然UDCA和CDCA在体外试验和离体试验中具有轻微的细胞溶解活性，但它们在体内试验中未显示出适当的组织溶解活性。这些化合物还显示出注射部位的严重炎症。结果，在这些所测试的胆汁盐当中选择CDCA和CA作为脂解注射剂的适当成分。对这些实验的总结呈现在表4中。表4：本研究中测试的胆汁盐的性质DCACDCAUDCAHDCATUDCACA体外细胞溶解作用+++++++++-+/-离体细胞溶解作用++++++n.d.*++n.d.*+体内细胞溶解作用++++++++n.d.*++pH稳定性<8.3<7.4<7.8<7.4n.d.*<7.0注射部位的炎症+/-+/-++++++n.d.*+/-不良反应:水肿+++++++++n.d.*+不良反应:皮肤+++++++n.d.*+*n.d.:未确定本文提供的结果被认为是评价各个胆汁盐的脂肪溶解的功效的首次研究。虽然洗涤剂的强度是胆汁盐的脂肪溶解作用的关键决定因素，但CA在体外、离体和体内条件下的不同剂量反应表明，各胆汁盐的溶解作用能够通过他们的环境调节。体内预料不到的高溶解活性和在CA注射过的区域上的减少的不良反应有利于开发更安全的脂解注射剂。本文提供的结果表明，在较低的pH(例如在本文公开的实验中使用的那些)下，能够使用较低浓度的胆汁盐，因为较低的pH能够增强胆汁盐的细胞溶解活性。然而，本实验中使用的较低pH不会增加胆汁盐制剂的副作用。这些结果表明，在适当的pH条件下，可以将副作用与细胞溶解活性区分开。因此，使用较低浓度和较低pH的胆汁盐能够减少副作用而不会降低细胞溶解活性。此外，中性pH能够减少与注射疼痛相关的副作用。本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用整体并入本文。虽然已经参照具体实施方式公开了本发明，但是显然本领域的其它技术人员可以在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计出本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施例和等同变型。当前第1页1 2 3