专利名称：ssc- miR-374b-5p 在制备减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明生物医药领域，涉及SSC-miR-374b-5p在制备减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用。
背景技术：
近年来，超重和肥胖是世界范围内快速增长的一个健康问题。当体内脂肪积聚过多和(或)分布异常、体重增加就容易导致肥胖症(obesity)，它是由遗传环境等因素共同作用的慢性代谢性疾病。椐WHO估计，目前全球肥胖症患者超过4亿，而超重人群达到16 亿，且预计这个数字到2015年将会翻倍。每年至少有260万人因肥胖症而死亡。Padwal等人(2003年)和Drew等人(2007年)的研究表明，肥胖会导致心血管疾病、高血压、高血脂、 糖尿病等疾病的产生，与诸多慢性疾病的产生有密切关系肥胖发病原因复杂各异。目前人类对肥胖相关疾病的治疗尚没有有效疗法，主要治疗手段有饮食干预、运动干预、药物干预及外科手术等。其中，药物治疗是常见的行之有效的治疗手段之一。因此，鉴于近年来肥胖症的严峻形势，研究如何有效的减少脂肪沉积并开发新型减肥药品或保健品药物就显得尤为重要。CCAAT 增强子结合蛋白家族(CCAAT enhancerbinding proteins, C/EBPs)是第一个被证明在脂肪分化转录调控中起重要作用的家族，它是一类能与DNA增强子区域结合的转录因子。C/EBPs属于bZIP蛋白家族，C端有一个碱性转录激活区和一个亮氨酸拉链结构，可形成同源或异源二聚体，通过DNA结合区结合于靶基因的调控元件。根据其结构和功能分为C/EBP a、C/EBP 3、C/EBP S等，分别在不同时间、空间表达，调控脂肪细胞分化。 最初发现C/EBP6的成脂作用是基于观察胰岛素、cAMP和地塞米松在脂肪细胞分化过程中对它们的诱导表达作用。胚胎纤维母细胞缺乏C/EBP P*C/EBP S，脂肪形成轻度减少；但当二者都缺乏时，脂肪细胞的形成严重受阻。在C/EBPs家族中，C/EBP 3、 6表达最早出现，在前脂细胞中表达，并且于分化早期出现短暂的表达水平增高，但在分化后期，C/EBPP减至初期水平的50%，而C/EBPS几乎检测不到。C/EBPa首先在肝细胞内发现，在不同组织中都有表达，并非脂肪细胞专一性的。C/EBPa能与aP2、S⑶l、Glut4、 Ieptin等脂肪细胞特征基因启动子处的位点相结合，激活上述基因的表达，而这些基因的 C/EBP a结合位点经突变后则无激活效应。没有受到诱导刺激因子作用的3T3-L1前脂肪细胞转染表达C/EBPa的质粒后可发生完全分化。C/EBPa在脂肪细胞分化较晚阶段才有表达，调控脂肪细胞终末分化。由此可见C/EBPa在促进脂肪细胞分化过程中的重要性。miRNA是一类长度约为21-23个核苷酸(nucleotide, nt)的内源性单链小分子 RNA,它主要通过与祀基因mRNA的3’端非翻译区(3，untranslational region, 3’ UTR)互补配对，引导RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)降解祀基因 mRNA或抑制其翻译，在转录后水平调节基因表达，参与生长发育、疾病发生、衰老、代谢稳态等多种生命活动的调控。MicroRNA的初始转录产物是pri-miRNA。MicroRNA成熟的第一步是由Drosha RNaseIII核酸内切酶剪切pre-miRNA形成60_70nt长的、具有茎环结构的 microRNA前体pre-miRNA, Ran-GTP和受体Exportin-5负责将pre-miRNA从细胞核转运出细胞质。然后，pre-miRNA在细胞质中经Dicer样RNA内切酶剪切后形成一个18_25nt的成熟miRNA。最后,成熟miRNA被整合进入核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)形成RISC, 执行基因沉默功能。目前研究证实microRNA在调控脂肪代谢及抑制脂肪细胞分化过程中扮演重要的调控角色。MiRNA-122是第一个被发现参与脂代谢调控的miRNA，在维持肝脏正常的基因表达模式有关键作用。在小鼠和灵长类动物中，通过反义寡核苷酸干扰体内miR-122可显著改变胆固醇和脂肪酸代谢。miR-370在脂代谢调控上的作用与miR-122相似。miR-370是通过间接地改变miR-122的表达从而影响脂代谢。转染miR-370可上调人肝细胞系HEPG2 的miR-122表达水平；相反，抑制miR-370表达也可抑制miR-122表达。同时，转染miR-370 还可上调肝细胞SREBP-lc和二脂酸甘油酸基转移酶2 (diacylgycerol acy I transferase 2，DGAT2),直接调节肉毒喊掠榈酸基转移酶 la (carnitine palmitoyl transferase la, Cptla)的表达水平。从这些研究结果可以看出，miRNA是一类重要而复杂的调控元件，直接和间接地参与脂代谢调控。miR-378/378*位于过氧化物酶体增殖物激活受体Y共激活因子 I a (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator I-alpha, PGCla)基因的内含子内。当脂肪生成时，miR-378/378*过表达可以提高甘油三酯的积累。 脂肪细胞系ST2转染miR-378/378*后，FAS、硬脂酰基辅酶A脱氢酶(stearoyl-coenzymeA desaturase, SCD-1)和脂肪酸结合蛋白-4(fatty acid binding protein 4, FABP4)等脂肪酸代谢基因表达显著上调。miR-143、miR-27和miR-335与脂代谢和脂肪细胞分化关系密切。向前脂肪细胞中转染miR-143反义寡核苷酸能下调细胞外信号调节激酶 5 (extracellular signal-regulated kinase, ERK5),抑制前脂肪细胞分化。miR-27 能抑制过氧化物酶体增殖物激活受体 Y (Peroxisome Proliferator-activated receptor y , PPAR Y )和转录因子 CCAAT/增强子结合蛋白 a (CCAAT/enhancer binding protein a , C/ EBP a)的表达。当脂肪细胞分化时，miR-27表达被下调。miR-335在肥胖小鼠的肝脏和脂肪组织表达上调。由此可见，miRNA可以参与脂代谢调控，在维持机体物质代谢和能量平衡方面发挥重要作用。同时，miRNA也参与免疫调控、肌肉老化和脂肪分化等广泛的生命活动中。但是目前尚未有文献报道microRNA-374b可以在脂肪代谢过程中具有调控作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供SSC-miR-374b-5p在制备减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用。ssc-miR-374b-5p在制备减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用。所述的ssc-miR-374b-5p序列为SEQ ID NO. I，其编码序列为SEQ ID NO. 2，其前体序列为SEQ ID NO. 3，其前体序列的编码DNA的正义链如SEQ ID NO. 5所示，反义链如SEQ IDN0. 6 所示。含ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的重组表达载体在制备减少脂肪沉积或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用。其中，所述的重组表达载体是将SEQ ID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的正义链和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的反义链退火后插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表达载体中所得。一种减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物，它的活性成分为 ssc-miR-374b_5p、miR-374b_5p 的编码序列、含 ssc-miR-374b_5p 前体序列的编码 DNA 的重组表达载体或含有miR-374b-5p的编码序列的表达盒中的至少一种。ssc-miR-374b-5p在抑制C/EBP-P在脂肪细胞分化过程中的表达中的应用。含ssc-miR-374b-5p前体序列的编码DNA的重组表达载体在抑制C/EBP- ^在脂肪细胞分化过程中的表达中的应用。其中，所述的重组表达载体是将SEQ ID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的正义链和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的反义链退火后插入到pSilencer 3. O-Hl siRNA表达载体中所得。所述MicroRNA、所述编码序列、所述重组表达载体和所述表达盒中的一种或几种的组合均可应用于抑制C/EBP-0蛋白翻译。所述MicroRNA针对的是C/EBP-0基因3-UTR 上的物种保守性结合位点(图2)，在哺乳动物中具有广泛的抑制作用。有益效果本发明首次发现SSc-miR-374b-5p可以有效的与脂肪细胞分化重要转录因子C/ EBP-^编码基因的转录产物mRNA相互结合，抑制带有C/EBP-0 3-UTR荧光素酶报告基因的活性。细胞水平实验结果表明，该microRNA可以结合C/EBP-0 3-UTR上进而抑制C/EBP-3 蛋白翻译，为其用于减少脂肪沉积及肥胖相关疾病的治疗和预防提供了实验依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的抗肥胖相关药物，具有重大的价值。
图I为在细胞电穿孔转染(Amaxa细胞核转染仪(AAD-1001S，Lonza，USA))过程中所使用的Hela 229细胞系。A =Hela 229 转染 miR_374b 后 24h 细胞图片；B =Hela 229 转染 miR_374b 后 48h 细胞图片；C Hela 229 细胞转染试剂盒(Amaxa Cell line Nucleofector Kit R)所带含有 GFP的阳性质粒荧光图。图2为生物信息学软件预测的ssc-miR-374b-5p在C/EBP- ^ 3-UTR上的结合位点及物种间的高度保守性。图3为证明ssc-miR-374b-5p与C/EBP-P 3-UTR结合的双荧光素酶检测结果。其中，miR-SC表示含阴性对照序列的重组载体，miR-374b表示含 ssc-miR-374b-5p前体序列的退火双链DNA的重组表达载体。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例3中，每个处理均设置三个重复，结果取平均值。实施例I、ssc-miRNA-374b_5p及其编码序列的发现一、ssc-miRNA-374b-5p 核苷酸序列的获得ssc-miRNA-374b-5p 序列5' -AUAUAAUACAACCUG CUAAGUG-3' (SEQ ID NO. I)。ssc-miRNA-374b-5p 的编码序列5 ' -ATATAATACAACCTG CTAAGTG-3 ' (SEQ IDN0. 2)。二、ssc-miRNA-374b-5p 前体序列的获得ssc-miRNA-374b_5p 前体序列5' -UCGGAUGGAUAUAAUACAACCUGCUAAGUGUCCUAGCACUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUUGUCCG UGUCUAUGGCUCUCG-3' (SEQ ID NO. 3)编码ssc-miRNA-374b_5p前体序列的正义链5' -GATCCTCGGATGGATATAATACAACCTGCTAAGTGTCCTAGCACTTATCAGGTTGTATTATCATT GTCCGTGTCTATGGCTCTCGTTTTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO. 5)编码ssc-miRNA-374b_5p前体序列的反义链5' -AGCTTTTCCAAAAAACGAGAGCCATAGACACGGACAATGATAATACAACCTGATAAGTGCTAGGA CACTTAGCAGGTTGTATTATATCCATCCGAG-3' (SEQ ID NO. 6)随机合成的一段与ssc-miRNA-374b-5p前体序列相同长度的核苷酸序列作为阴性对照序列 miR-SC :5' -GACUUACAGCCAGUUCCUAGUAUAGUGAA GCAGCAGAUGGUAUACUAGGAACUG GCUGUAAGC-3' (SEQ ID NO. 4)。编码miR-SC的正义链5' -GATCCGACTTACAGCCAGTTCCTAGTATAGTGAAGCAGCAGATGGTATACTAGGAACTGGCTGTA AGCTTTTTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO. 7) R5-AGCTTTTCCAAAAAAAGCTTACAGCCAGTTCCTAGTATACCATCTGCTGCTTCACTATACTAGGA ACTGGCTGTAAGTCG-3' (SEQ ID NO. 8)这个阴性对照已经通过Blast比对所有猪、人、大鼠及小鼠的基因组序列，与C/ EBP- ^ 3-UTR确认没有结合位点。实施例2、ssc-miRNA-374b-5p表达载体的构建将编码ssc-miRNA-374b-5p的前体序列的正义链和反义链经降落PCR(反应体系如下)方法退火，序列退火后可以形成与载体相连的粘性末端，将退火后的序列链接到 pSilencer 3. O-HlsiRNA表达载体上形成重组质粒,重组质粒具有氨节抗性。用重组质粒转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞(购于Promega公司)，涂布于含有氨苄的LB平板上，37°C 倒置12小时后挑取阳性克隆，菌液PCR送样测序。测序结果表明携带了目的片段SEQ ID NO. 5的重组质粒，并将其命名为重组质粒A。降落PCR反应体系灭菌单蒸水退火缓冲液(5 X)
编码miRNA前体的正义链(50 (imol/L) 编码miRNA前体的反义链(50 (imol/L)
20 (iL 10 (iL 10 (iL 10
总体积降落PCR反应程序
步骤温度
时间说明
95 0C
每8s下降O.l-C，降至25°C 4 °C
2min让oligo充分变性
约90 min 退火
约I h暂时存放根据同样的方法，将编码阴性对照的DNA模板插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表达载体上，测序正确后命名为重组质粒B。表达海肾荧光素酶的pRL-TK表达载体(Promega公司)，命名为重组质粒C。 实施例3、C/EBP- ^ 3-UTR (重组质粒D)的构建一、根据 C/EBP-P 基因(GenBank accession NM005194)设计含有 Xbal 酶切位点的弓I物序列上游引物序列GCTCTAGACGGAACTTGITCAAGCAGC (SEQ IDN0. 9);下游引物序列GCTCTAGA CAGAAACAACCCCGTAGGA (SEQ ID NO. 10)，模板为猪的基因组 DNA，PCR 扩增 C/ EBP-^基因自5^ 1312位至1701位核苷酸序列并克隆到pGL3-Control载体(Ambion公司)中Iuciferase基因下游的Xbal酶切位点处,得到重组质粒D。二、ssc-miRNA-374b-5p序列对脂肪细胞分化重要转录因子C/EBP-0基因表达的抑制作用处理一用Hela 229细胞(购于中国细胞库上海典藏细胞中心)铺细胞瓶， 细胞融合达到95%时(约3-4X105个)用0. 25%胰酶消化，经800Xg离心5分钟彻底去除培养基，100 u L电转液重悬细胞，用电穿孔转染法(Amaxa细胞核转染仪，细胞转染试剂盒(Amaxa Cell line Nucleofector Kit R)),将实施例 2 构建的重组质粒 A 100ng、 IOng重组质粒C和IOOng重组质粒D共转染入Hela 229细胞，计数，平均分配到24孔板中(2X IO4个/孔)；转染后24或48h收集细胞，通过检测Iuciferase的表达量来确定 ssc-miRNA-374b-5p对C/EBP-0基因表达的抑制作用。处理二(阴性对照)用Hela 229细胞(购于中国细胞库上海典藏细胞中心)铺细胞瓶，细胞融合达到95%时(约3-4X105个)用0. 25%胰酶消化，经800Xg离心5分钟彻底去除培养基，100 u L电转液重悬细胞，用电穿孔转染法(Amaxa细胞核转染仪，细胞转染试剂盒(Amaxa Cell line Nucleofector Kit R)),将实施例2构建的IOOng重组质粒 B、IOng重组质粒C和IOOng重组质粒D共转染入Hela 229细胞，计数，平均分配到24孔板中(2 X IO4个/孔)；转染后24或48h收集细胞，通过检测Iuciferase的表达量来确定阴性对照质粒对C/EBP-0基因表达的抑制作用。本实验结果见图I和图3.实验结果显示与对照组miR-SC相比，过表达ssc-miRNA-374b-5p序列可以极显著抑制带有其靶基因3' -UTR的荧光素酶报告基因的活性，且在转染后24h和48h结果一致，说明ssc-miRNA-374b-5p序列与其靶基因3' -UTR之间有很强的靶向结合作用，从而抑制了脂肪细胞分化重要转录因子C/EBP-0在脂肪细胞分化过程中的表达，减少脂肪沉积。
权利要求
1.ssc-miR-374b-5p在制备减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用。
2.含SSC-miR-374b-5p前体序列编码DNA的重组表达载体在制备减少脂肪沉积或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体是将SEQID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的正义链和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b_5p 前体序列编码DNA的反义链退火后插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表达载体中所得。
4.一种减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物，其特征在于它的活性成分为 ssc-miR-374b_5p、miR-374b_5p 的编码序列、含 ssc-miR-374b_5p 前体序列的编码 DNA 的重组表达载体或含有miR-374b-5p的编码序列的表达盒中的至少一种。
5.ssc-miR-374b-5p在抑制C/EBP-0在脂肪细胞分化过程中的表达中的应用。
6.含ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的重组表达载体在抑制C/EBP-0在脂肪细胞分化过程中的表达中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体是将SEQID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前体序列编码DNA的正义链和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b_5p 前体序列编码DNA的反义链退火后插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表达载体中所得。
全文摘要
本发明生物医药领域，涉及ssc-miR-374b-5p在制备减少脂肪沉积和/或抗肥胖相关性疾病的药物中的应用。本发明首次发现ssc-miR-374b-5p可以有效地与脂肪细胞分化重要转录因子C/EBP-β编码基因的转录产物mRNA相互结合，抑制带有C/EBP-β3-UTR荧光素酶报告基因的活性。细胞水平实验结果表明，该microRNA可以结合C/EBP-β3-UTR上进而抑制C/EBP-β蛋白翻译，为其用于减少脂肪沉积及肥胖相关疾病的治疗和预防提供了实验依据。本发明提供的microRNA有望作为新型的抗肥胖相关药物，具有重大的价值。
文档编号C12N15/63GK102600482SQ20121008295
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者孙钦伟, 杨晓静, 潘士锋, 赵茹茜, 马文强 申请人:南京农业大学