半乳糖凝集素免疫疗法的制作方法
本发明涉及免疫疗法。更具体地，本发明涉及靶向半乳糖凝集素-9以调节免疫应答且从而预防或治疗一种或多种疾病、紊乱或病症。
背景技术：
pd-1是已知下调t细胞功能的分子的大家族的成员。pd-1具有两个已知的配体pd-l1(b7-h1)(dong等人，1999；freeman等人，2000)和pd-l2(b7-dc)(latchman等人，2001；tseng等人，2001)，它们都属于b7共信号传导分子家族。可以在t细胞、b细胞、自然杀伤t细胞、树突细胞(dc)和活化的单核细胞上观察到pd-1的表达(keir等人，2008)。pd-1不在静息t细胞上表达，但在活化时可诱导(agata等人，1996)。pd-1连接的功能效应可以在t细胞活化后几小时内观察到，但pd-1细胞表面蛋白上调需要24小时(chemnitz等人，2004)。当pd-1同时与t细胞受体信号结合时，它可以触发抑制性信号，虽然当pd-1单独交联时没有发生信号传导(sharpe等人，2007)。一般而言，t细胞上的pd-1与其配体pd-l1之间的相互作用控制外周t细胞耐受的诱导和维持，并且在对病原体或癌症的免疫应答期间负调节t细胞的增殖和细胞因子产生(sharpe等人，2007)。pd-l2是pd-1的另一种配体，其通常被认为与pd-l1竞争结合pd-1。通常，pd-l2的免疫功能似乎与pd-l1的免疫功能重叠，并且似乎没有可归因于pd-l2本身的特定作用或功能。
技术实现要素：
本发明至少部分地由于意想不到的发现半乳糖凝集素-9是pd-l2的受体而产生。因此，pd-l2的至少一些免疫学效应可以通过多聚体pd-l2与半乳糖凝集素-9的结合而不是通过pd-1来介导。因此，本发明广泛地涉及靶向半乳糖凝集素-9，从而调节免疫系统。在一个广义的实施方案中，本发明涉及通过激活或刺激半乳糖凝集素-9而促进或增强哺乳动物的免疫力。在另一个广义的实施方案中，本发明涉及通过抑制或阻断半乳糖凝集素-9而抑制或阻止哺乳动物的免疫力。
本发明的一个方面提供了调节哺乳动物的免疫力的方法，包括调节哺乳动物中半乳糖凝集素-9的活性从而调节哺乳动物的免疫力的步骤。
本发明的一个具体方面提供了促进或增强哺乳动物的免疫力的方法，包括激活或刺激哺乳动物中半乳糖凝集素-9的活性从而刺激或增强哺乳动物的免疫力的步骤。
合适地，该方法包括向哺乳动物施用半乳糖凝集素-9激动剂从而激活或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用可溶性pd-l2或其生物学活性片段从而激活或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
合适地，可溶性pd-l2是包含n个单体的多聚体，其中n≥3。
在一个实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用结合半乳糖凝集素-9的激动剂抗体或抗体片段从而激活或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
合适地，这刺激和/或启动th1介导的免疫应答和/或免疫记忆。
本发明的另一个具体方面提供了至少部分地抑制或阻止哺乳动物的免疫力的方法，包括至少部分地抑制或阻断哺乳动物中半乳糖凝集素-9的活性从而抑制或阻止哺乳动物的免疫力的步骤。
合适地，该方法包括向哺乳动物施用半乳糖凝集素-9抑制剂或拮抗剂从而抑制或阻断哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。优选地，抑制剂或拮抗剂至少部分地阻止或干扰pd-l2和半乳糖凝集素-9之间的结合相互作用。
在一个实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用可溶性半乳糖凝集素-9或其生物学活性片段从而抑制或阻断哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用结合半乳糖凝集素-9的拮抗剂抗体或抗体片段从而抑制或阻断哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
本发明的相关方面提供了治疗或预防哺乳动物的疾病、紊乱或病症的方法，包括调节哺乳动物中半乳糖凝集素-9的活性从而预防或治疗所述疾病或病症的步骤。
在一个实施方案中，所述疾病、紊乱或病症对通过激活或刺激哺乳动物中半乳糖凝集素-9的活性促进或增强免疫力有反应。优选地，该方法包括向哺乳动物施用结合半乳糖凝集素-9的激动剂抗体或抗体片段从而激活或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或病症对通过抑制或阻断哺乳动物中半乳糖凝集素-9的活性抑制或阻止免疫力有反应。在一个具体实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用可溶性半乳糖凝集素-9或其生物学活性片段从而抑制或阻断哺乳动物中半乳糖凝集素-9的活性的步骤。在另一个具体实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用结合半乳糖凝集素-9的拮抗剂抗体或抗体片段从而抑制或阻断哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
本发明的又另一方面提供了包含半乳糖凝集素-9激动剂和免疫原的组合物。合适地，该组合物是引发对该免疫原的免疫应答的免疫原性组合物或疫苗。免疫原可以是病原体(例如灭活病毒或减毒细菌)或病原体的分子组分。合适地，该组合物包含合适的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一方面提供了设计、筛选、工程化或以其他方式产生半乳糖凝集素-9激动剂、抑制剂或拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤：(i)确定候选分子是否为激活或刺激半乳糖凝集素-9活性且从而能够刺激或增强哺乳动物的免疫力的激动剂；或(ii)确定候选分子是否为阻断或抑制半乳糖凝集素-9活性且从而能够至少部分地抑制或阻止哺乳动物的免疫力的拮抗剂或抑制剂。
在一个实施方案中，在步骤(i)中，候选分子模拟半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或激活。
在一个实施方案中，在步骤(ii)中，候选分子阻断或抑制半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或激活。
本发明的再另一方面提供根据前述方面的方法产生的半乳糖凝集素-9激动剂、抑制剂或拮抗剂。
本发明的再另一方面提供了包含前述方面的半乳糖凝集素-9激动剂、抑制剂或拮抗剂的组合物。合适地，该组合物包含合适的载体、稀释剂或赋形剂。
在整个本说明书中，除非另外指出，“包括”、“包含”和“含有”是概括地使用而不是排他地使用，使得所陈述的整数或整数组可以包括一个或多个其他非陈述的整数或整数组。
如本文中所使用的，不定冠词例如“一”和“一个”并不指代或指定单一或单个元件，而是可以指代或指定一个或多个元件。
附图说明
图1：pd-1和pd-l1调节针对夏氏疟原虫(p.chabaudi)和约氏疟原虫ym(p.yoeliiym)疟疾的保护性免疫。(a)wt小鼠(n≥9)和(b)pd-1ko小鼠群组感染非致死性105夏氏疟原虫或致死性104约氏疟原虫ymprbc，每1-2天取血涂片以监测寄生虫血症。40天后，使所有存活的小鼠休息140天，并用相同的寄生虫(x刻度上的箭头)再次攻击。误差条：±s.e.m。对数标度突出亚临床感染。所有野生型小鼠在致死攻击的7天内死亡
图2：通过对约氏疟原虫ym和约氏疟原虫17xnl感染后(p.i.)从第7天的总脾脏dc进行实时pcr将pd-l2mrna与3个管家基因的平均值来比较。数据显示为在两个独立实验中使用制备的rna获得的mrna水平的平均值和范围。显著性使用对来自重复实验的合并数据的非参数t检验进行分析。
图3：在非致死性感染中阻断pd-l2会加剧感染。用对照igg(黑色圆圈)或阻断性抗-pd-l2抗体(白色方形)处理后wt小鼠的平均寄生虫血症百分比。数据表示wt(总n＝10只小鼠)或pd-1ko(总n＝10)小鼠中2个独立实验之一(*p＝0.0048)。
图4：可溶性合成多聚体pd-l2保护免受致死性疟疾影响并产生持久的免疫力。用致死性约氏疟原虫ym感染b6小鼠群组(n＝12)，并在第3、5和7天给小鼠施用可溶性八聚体pd-l2或人igg(对照ig)。在感染清除和休息3个月后，用致死性约氏疟原虫ym感染再次攻击存活的小鼠(箭头；没有额外的spdl2)。
图5：可溶性合成多聚体pd-l2提供针对脑疟疾的症状的保护并延长存活。用伯氏疟原虫(p.berghei)疟疾感染b6小鼠群组(n＝9)(其至第8天导致脑症状)，并且在第3、5和7天给予小鼠可溶性pd-l2或人igg(对照ig)。每天监测小鼠的(a)脑症状和(b)存活。由于过量的tnf，小鼠最终死于dc功能的缺乏(wykes，2007)。
图6：cd4+和cd8+t细胞耗竭研究显示这些细胞在针对严重疟疾的保护中的作用。(a)用致死性约氏疟原虫ym感染并用rig处理(黑色圆圈)或用spd-l2(黑色方块)处理后具有cd4+t细胞(白色方形)或cd8+t细胞(白色圆圈)耗竭的wt小鼠中小鼠的平均存活百分比。
图7：通过spd-l2的保护不是通过阻断pd-l1。用致死性约氏疟原虫ym感染并用对照igg或spd-l2处理wt和pd-l1敲除小鼠群组。监测小鼠的寄生虫血症。
图8：半乳糖凝集素-9通过固定的pd-l2从t细胞免疫沉淀。将总小鼠t细胞群体的裂解物与固定的igg或pd-l2-fc融合蛋白混合。切取条带并消化用于质谱(massspectrophotometer)分析。半乳糖凝集素-9(2)对于与pd-l2的免疫沉淀是独有的。
图9：通过固定的pd-l2从t细胞免疫沉淀的半乳糖凝集素-9的western印迹。将总小鼠t细胞群体的裂解物与固定的igg或pd-l2-fc融合蛋白混合。将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素，其对于半乳糖凝集素-9是免疫标记的。
图10：spd-l2结合t细胞上的半乳糖凝集素-9。从初始小鼠的脾脏分离总t细胞群体，并用生物素化的spd-l2和apc-链霉亲和素或pe-抗半乳糖凝集素-9孵育。t细胞也用未标记的抗半乳糖凝集素-9抗体孵育，然后用生物素化的spd-l2和apc-链霉亲和素标记。所有样品也被标记以鉴别cd4+和cd8+t细胞。
图11：可溶性pd-l2增加由半乳糖凝集素-9介导的初始小鼠cd4+t细胞的分化及其tbet水平。初始cd4+t细胞用抗cd3、il-2和图上显示的刺激物培养。与大鼠igg处理相比，(a)spd-l2增加表达tbet的cd4+cd62llo细胞的百分比和(b)细胞内tbet的水平。该作用通过被确定为半乳糖凝集素-9抑制剂的抗半乳糖凝集素-9(克隆108a)抗体阻断。克隆rg9.1也增加了表达tbet的小鼠cd4+cd62llo细胞的百分比。
图12：可溶性合成pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗体提供针对致死性疟疾的症状的保护。用致死性约氏疟原虫ym感染b6小鼠群组(n＝3)，并在第3、5和7天给小鼠施用可溶性pd-l2、抗半乳糖凝集素-9或人igg(对照ig)。每天监测小鼠的疾病症状和存活并评分。当分数达到4时，对小鼠实施安乐死。通过被确定为半乳糖凝集素-9刺激剂(激动性抗体)的rg1模拟并改善spdl2对临床分数的正面效应。
图13：小鼠pd-l2-半乳糖凝集素-9是高度稳定的并且涉及半乳糖凝集素-9和pd-l2的多聚化。进行octetred研究以确定半乳糖凝集素-9和pd-l2之间的结合的生物化学性质。spd-l2与探针结合，并测量其与spd-1和sgalectin-9的相互作用。pd-l2-pd1结合曲线显示pd-l2在小于0.02秒(测定的灵敏度)内结合pd-1，并在小于0.02秒内解离。pd-l2-gal-9曲线显示半乳糖凝集素-9结合需要299.99秒来缔合和614.21秒来解离，表明pd-l2和半乳糖凝集素-9之间非常稳定的相互作用。峰的高度显示半乳糖凝集素-9的大聚集，这对于pd-1中未见到，表明半乳糖凝集素-9和pdl2在结合期间多聚化。
图14：由用小鼠spd-l2或抗半乳糖凝集素-9抗体处理的小鼠cd4+t细胞分泌的细胞因子。从小鼠脾脏分离cd4+t细胞，并用抗cd3和刺激物培养3天，收集上清液以测量细胞因子干扰素-γ、il-2和tnf-α。误差条表示sem，数据代表2个实验中的1个。
图15：(a)从用人spd-l2处理的人cd4+t细胞分泌的细胞因子。cd4+t细胞从人pbmc分离，并用pma和离子霉素培养3天以模拟tcr的活化。然后用spd-l2或对照培养细胞，并在第3天收集上清液以测量细胞因子干扰素-γ(ifn-γ)、il-2、tnf-α和il-4。误差条表示sem，数据代表来自2个实验的合并数据。(b)从用抗小鼠半乳糖凝集素-9处理的人cd4+t细胞分泌的ifn-γ。cd4+t细胞从人pbmc分离，并用次优浓度的抗cd3培养3天以模拟tcr的活化。然后用人spd-l2或抗小鼠半乳糖凝集素-9培养细胞，并在第3天收集上清液以测量细胞因子。误差条表示sem，数据表示1个实验。
图16：抗半乳糖凝集素-9激活抗体而不是抗tim3阻断性抗体保护免受致死性疟疾的影响。在感染后第3、5和7天，用对照大鼠igg、阻断性抗tim-3抗体或激活抗半乳糖凝集素-9抗体处理的wt小鼠中约氏疟原虫ym疟疾的典型过程的平均寄生虫血症百分比。误差条表示sem，数据代表tim3的2个实验中的1个和抗半乳糖凝集素-9的3个实验中的1个。
图17：抗半乳糖凝集素-9处理降低乳腺癌进展。将小鼠群组用(a)pymt来源的或(b)eo771.lmb乳腺癌异位移植，并用对照igg或抗半乳糖凝集素-9抗体处理。每1-2天监测小鼠以监测肿瘤进展。qimr-b伦理要求小鼠在移植到乳房中的肿瘤达到～525mm2时实施安乐死。误差条表示sem。
图18：pd-l2的阻断抑制感染约氏疟原虫17xnl的小鼠脾脏中寄生虫特异性的cd4+t细胞的扩增。分析感染约氏疟原虫17xnl并用大鼠igg或抗pd-l2阻断性抗体处理的wt小鼠中的各种参数。所有数据以散点图显示，条形表示中值。(a，b)第7天(n＝4)(a)和第14天(n＝7)(b)每脾中表达tbet的cd4+cd62lhi和cd4+cd62llot细胞的数量。(c)在存在初始dc的情况下在elispot培养物中响应于寄生虫抗原(msp119)分泌干扰素-γ(ifn-γ)的cd4+t细胞数(n＝7)。(d，e)血清约氏疟原虫17xnl感染的小鼠(n＝7)中的(d)ifn-γ和(e)il-10的水平。(f)每个脾中表达cd25和foxp3(调节性t细胞)的cd4+t细胞数(n＝7)。第14天的数据表示两个合并的独立实验。使用基于双侧的非参数型mann-whitneyu检验分析显著性(*p<0.05；**p<0.005；***p<0.0005)。f检验发现组之间显著不同的方差。
图19：pd-l2调节约氏疟原虫17xnl疟疾期间的th1免疫力。(a，b)在(a)wt小鼠和pd-l2ko小鼠(n＝4)或(b)用大鼠igg或抗pd-l2阻断性抗体处理的wt小鼠(n＝5)中约氏疟原虫17xnl疟疾的典型过程中的临床症状分数。(c-f)散点图显示用大鼠igg或抗-pd-l2阻断性抗体处理的wt小鼠或用约氏疟原虫17xnl感染14天的pd-l2ko小鼠中的cd4+t细胞的分析。(c)每个脾中表达tbet的cd4+cd62lhi或cd4+cd62llot细胞的平均数。(d)在存在初始dc的情况下，每个脾中在elispot培养物中响应寄生虫抗原(msp119)分泌ifn-γ的cd4+t细胞的平均数。(e-f)在存在初始dc的情况下，每个脾中在elispot培养物中响应寄生虫抗原(pb1)分泌ifn-γ的cd8+t细胞的平均数。(e)约氏疟原虫17xnl感染后第14天获得的细胞，有和没有pd-l2阻断(n＝7)。(f)约氏疟原虫17xnl感染后第14天从pd-l2ko小鼠和对照获得的细胞。除了pd-l2ko小鼠进行一次外，从2个独立实验汇集数据。误差条表示sem(*p<0.05)。使用非参数型mann-whitneyu检验分析显著性。
图20：spd-l2通过cd4+t细胞介导保护和存活。在感染约氏疟原虫后第3、5和7天，用对照人igg(hig)或spd-l2处理的wt小鼠中的(a)存活曲线和(b-d)平均寄生虫血症百分比。然后在感染后第1天开始用(b)大鼠ig、(c)耗竭性抗cd4抗体或(d)耗竭性抗cd8抗体(n＝4)共处理小鼠，每3-4天共处理直到感染后第14-18天。数据表示获得相似结果的两个独立实验之一。使用对数秩(mantel-cox)检验，基于来自合并试验的数据分析spd-l2+大鼠igg处理组和对照组(给予大鼠和人igg)或耗竭cd4+t细胞的spd-l2处理组之间的存活的显著性。
图21：spd-l2通过促进th1cd4+和cd8+t细胞功能保护小鼠免于致死性疟疾的影响。分析在感染约氏疟原虫ym并在感染后第3、5和7天用对照人igg或spd-l2处理的wt小鼠中的各种参数(感染后第7天)(n＝8)。所有数据以散点图显示，条形表示中值。(a)在初始dc存在下，在elispot培养物中响应寄生虫抗原msp119分泌ifn-γ的cd4+t细胞的数目；(b)通过掺入edu测量的在初始dc存在下在培养物中响应寄生虫抗原msp119增殖的cd4+t细胞的数目；(c)每个脾中表达cd25和foxp3的cd4+t细胞的数目。(d)每个脾中寄生虫特异性pb1-四聚体+cd8+t细胞的数目，和(e)在初始dc存在下在培养物中响应寄生虫肽pb1分泌ifn-γ的cd8+t细胞的数目(通过elispot测定)；(f)表达cd11a和颗粒酶b的cd8+t细胞的数目，cd11a是当前激活的标志物。数据表示两个合并的独立实验，除了四聚体和颗粒酶b标记进行一次外。使用基于双侧的非参数型mann-whitneyu检验分析显著性(*p<0.05；**p<0.005)。f检验发现组之间显著不同的方差。
发明详述
pd-l2是程序性死亡受体-1(pd1)和rgmb的配体，并且本文中提出半乳糖凝集素-9(gal-9)是迄今未知的pd-l2的受体。当用致死性疟疾病株攻击时，可溶性pd-l2处理的小鼠不死亡，并且提示pd-l2通过cd4+t细胞介导保护作用，因为当cd4+t细胞耗竭时，pd-l2介导的保护作用丧失。因此，提出给予可溶性pd-l2(spdl2)或激动性抗半乳糖凝集素-9抗体可起到免疫刺激剂的作用和/或启动th1介导的免疫应答和/或免疫记忆。这可能在刺激对癌症、感染剂和寄生虫的免疫应答中有效，包括产生和维持免疫记忆，特别是针对癌症。还提出给予半乳糖凝集素-9的阻断性或拮抗剂抗体可以预防或抑制对于pd-l2所见的效应。结合pd-l2并阻断其与半乳糖凝集素-9的相互作用的抗体可以具有与半乳糖凝集素-9拮抗剂抗体类似的效果。这可以有助于抑制免疫，例如可用于治疗或预防自身免疫性疾病、炎症和/或过敏。
为了本发明的目的，“分离的”是指已从其天然状态移除或以其他方式进行人工操作的材料。分离的材料可以基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随的组分，或者可以被操作以便与通常在其天然状态下伴随的组分一起处于人工状态。分离的材料可以是天然的、化学合成的或重组的形式。
“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，如本领域熟知的d-或l-氨基酸。
“肽”是具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。
“多肽”是具有多于五十(50)个氨基酸的蛋白质。
如本文所用，“半乳糖凝集素-9”或“gal-9”是指由其对β-半乳糖苷如n-乙酰乳糖胺(galβ1-3glcnac或galβ1-4glcnac)的结合特异性定义的半乳糖凝集素蛋白家族的蛋白质。这些蛋白质由于其在稳定性和碳水化合物结合方面对二硫键的依赖性而被称为s型凝集素。已经在哺乳动物中发现了由lgals基因编码的15种半乳糖凝集素，其中已在人类中鉴定了半乳糖凝集素-1、-2、-3、-4、-7、-8、-9、-10、-12和-13。人半乳糖凝集素-9通常包含355个氨基酸的序列(称为标准或“长形式”序列)，但存在缺少残基149-180的“短形式”变体。合适的情况下，在本发明的上下文中，半乳糖凝集素-9由淋巴细胞或nk细胞表达。淋巴细胞可以是cd4+t细胞、cd8+t细胞或b细胞。人半乳糖凝集素-9氨基酸序列的非限制性实例可以在uniprotkb登录号o00182下找到，且小鼠半乳糖凝集素-9氨基酸序列的非限制性实例可在uniprotkb登录号o08573下找到。
本文所用的“抗体”是或包含免疫球蛋白。术语“免疫球蛋白”包括哺乳动物免疫球蛋白基因复合物的任何抗原结合蛋白产物，包括免疫球蛋白同种型iga、igd、igm、igg和ige及其抗原结合片段。术语“免疫球蛋白”中包括嵌合的或人源化的或另外地包含改变的或变体的氨基酸残基、序列和/或糖基化的免疫球蛋白，无论是天然存在的还是通过人类干预(例如通过重组dna技术)产生的。
抗体片段包括fab和fab'2片段、双抗体、三链抗体和单链抗体片段(例如scv)，但不限于此。通常，抗体包含各自包含cdr1、2和3氨基酸序列的轻链和重链可变区。优选的抗体片段包含至少一个轻链可变区cdr和/或至少一个重链可变区cdr。
抗体和抗体片段可以是多克隆或优选单克隆的。单克隆抗体可以使用例如在
在另一物种中产生或源自另一物种的抗体和抗体片段可以被修饰以便可以施用于一个物种而不引起对“外源”抗体的有害免疫应答。在人的情况中，这是在另一物种中产生或源自另一物种的抗体的“人源化”。这样的方法是本领域公知的，并且通常包含将非人抗体互补决定区(cdr)重组“嫁接”到人抗体支架或骨架上。
在一些实施方案中，标记抗体或抗体片段。
标记物可以选自包括色原体、催化剂、生物素、地高辛、酶、荧光团、化学发光分子、放射性同位素、药物或其他化疗剂、磁珠和/或直接视觉标记物的组。
本发明的一个方面提供了调节哺乳动物的免疫力的方法，包括调节哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性从而调节哺乳动物的免疫力的步骤。
在一个实施方案中，“调节免疫力”是指促进或增强哺乳动物的免疫力。在本文中，半乳糖凝集素-9活性例如通过激动剂被刺激或提高。
在另一个实施方案中，“调节免疫力”是指至少部分地遏制、抑制或阻止哺乳动物的免疫力。在本文中，半乳糖凝集素-9活性例如通过半乳糖凝集素-9拮抗剂或抑制剂至少部分地被阻断或抑制。
因此，本发明的一个具体方面提供了促进或增强哺乳动物的免疫力的方法，包括激活、提高或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性从而刺激或增强哺乳动物的免疫力的步骤。
合适地，该方法包括向哺乳动物施用半乳糖凝集素-9激动剂从而激活或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
在本文中，“激动剂”是指至少部分地激活、提高或刺激半乳糖凝集素-9活性的分子。激动剂可以是半乳糖凝集素-9的天然配体如pd-l2或可以模拟天然配体如pd-l2的作用。在一个具体实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用可溶性pd-l2或其生物学活性片段从而激活或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。合适地，pd-l2是多聚体，优选包含n个单体，其中n≥3。优选地，多聚体pd-l2包含三个、四个、五个、六个、七个或八个pd-l2单体。在一个具体实施方案中，pd-l2包含八个单体(即n＝8或八聚体)。在这种情况中，多聚体pd-l2可以诱导或共价形成，例如通过单体的化学交联，包括使用接头氨基酸或肽以促进每个单体的共价偶联。在其他实施方案中，多聚体pd-l2的作用可以通过如肽或核酸(例如寡核苷酸)适体的试剂或通过结合pd-l2和半乳糖凝集素-9两者的双特异性抗体来模拟，或通过如肽或核酸(例如寡核苷酸)适体的试剂来模拟。激动剂可以是可结合半乳糖凝集素-9从而激活或刺激半乳糖凝集素-9活性的任何其他分子，例如激动剂抗体或抗体片段。在一个具体实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用结合半乳糖凝集素-9的激动剂抗体或抗体片段从而激活或刺激哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。
在一些实施方案中，激动剂可以在施用于哺乳动物后刺激或增强免疫应答。免疫应答可以包括诱导针对癌症或病原体(例如引起感染和/或寄生虫病的病原体)的免疫记忆，特别是当病原体通过避免、消除或回避免疫记忆而规避免疫系统时。非限制性实例是疟疾，其消除免疫记忆从而允许之后的再感染。
在癌症的情况下，向癌症患者施用激动剂可产生、诱导和/或维持免疫记忆，使得当非自身信号低或缺乏时，肿瘤细胞被识别为外来的。
在另一个实施方案中，半乳糖凝集素-9激动剂可以作为佐剂与疫苗或其他免疫原性组合物中的免疫原组合施用。这可以提高疫苗或免疫原性组合物的有效性，并且还可以消除或最小化强化免疫接种的需要。在该实施方案的特定形式中，激动剂的施用可以挽救或恢复未充分刺激免疫原或病原体的免疫记忆的失败的或次优的疫苗或疫苗接种。免疫原可以是病原体的组成分子(例如其细胞表面蛋白、免疫原性肽或其他组分，例如在“亚单位疫苗”中，包含多个b-和/或t-表位的多表位、vlp、衣壳或壳粒)、灭活的病原体(例如灭活病毒、减毒寄生虫感染的rbc或减毒细菌)或能够引发对病原体的免疫应答的任何其他分子或结构。例如，参考证明了施用pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗体激动剂在改善疟疾免疫中的功效的实施例。
向哺乳动物施用激动剂可刺激初始t细胞进行th1谱系选择和/或定型。如本领域技术人员将理解的，th1谱系包括产生和分泌多种因子之一的cd4+t细胞，所述因子包括干扰素(ifn-γ)、il-2和tnf-α，但不限于此。th1细胞在针对细胞内细菌、原生动物寄生虫和病毒的免疫应答中特别重要。th1细胞由il-12和il-2触发，进而刺激免疫效应细胞如巨噬细胞、粒细胞、cd8+t细胞、表达igg的b细胞、树突细胞和其他cd4+t细胞。
从上述可以理解，激活或刺激半乳糖凝集素-9(例如通过本文公开的激动剂)可以治疗或预防哺乳动物的疾病、紊乱或病症。
如本文所用，“治疗”是指在疾病、紊乱或病症的症状至少开始发生后至少改善症状的治疗性干预、作用过程或方案。如本文所用，“预防”是指在疾病、紊乱或病症的症状发作之前开始的治疗性干预、作用过程或方案，以便阻止、抑制或延迟疾病、紊乱或病症或症状的发生或进展。这种预防性治疗可以称为“预防法”或“预防性”治疗。在具体实施方案中，免疫或疫苗接种是预防性或预防的免疫疗法。
在广义的实施方案中，疾病、紊乱或病症由病原体引起。病原体可以是病毒、细菌或寄生虫。寄生虫的非限制性实例包括原生动物，例如疟疾寄生虫，包括疟原虫属(plasmodiumspp)，例如恶性疟原虫(p.falciparum)、卵形疟原虫(p.ovale)、诺氏疟原虫(p.knowlesii)、三日疟原虫(p.malariae)和间日疟原虫(p.vivax)，但不限于此。其他寄生虫包括巴贝虫属(babesiaspp)、内阿米巴属(entamoeba)、贾第虫属(giardiaspp)和锥虫属(trypanosomes)，包括利什曼原虫属(leishmaniaspp)，但不限于此。
病毒病原体的非限制性实例包括：人免疫缺陷病毒(hiv)、埃博拉病毒、流感病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乙型肝炎病毒、风疹病毒、鼻病毒、黄病毒如丙型肝炎病毒(hcv)、西尼罗病毒、日本脑炎病毒和登革病毒、巨细胞病毒(cmv)和eb病毒(ebv)，但不限于此。
细菌病原体的非限制性实例可以是如奈瑟氏球菌属、博代氏杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、沙门氏菌属、链球菌属、志贺氏菌、分枝杆菌属、支原体属、梭菌属、螺杆菌属、包柔氏螺旋体属、耶尔森菌属、军团菌属、嗜血杆菌属、立克次体属、李斯特菌属、布鲁氏菌属、弧菌属和密螺旋体属的属，包括如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、幽门螺旋杆菌、炭疽杆菌、百日咳博代氏杆菌、白喉棒状杆菌、假结核棒状杆菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌、肺炎链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、副血链球菌、酿脓链球菌、草绿色链球菌、单核细胞增生李斯特菌、流感嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、痢疾杆菌、结核杆菌、麻风杆菌、亚洲结核杆菌、胞内分枝杆菌、肺炎支原体、人型支原体、脑膜炎双球菌、淋球菌、立氏立克次体、流产布鲁氏杆菌、犬布鲁氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、嗜肺军团杆菌(legionellapneuophila)、肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌、梅毒螺旋体、密螺旋体(treponemapertanue)、沙眼衣原体、霍乱弧菌、斑点密螺旋体(treponemacarateum)、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒杆菌、伯氏疏螺旋体和鼠疫耶尔森氏菌的种，但不限于此。
在另一广义的实施方案中，所述疾病、紊乱或病症是癌症。如本文一般使用的，术语“癌症”、“肿瘤”、“恶性肿瘤”和“恶性疾病”是指特征为反常或异常的细胞增殖、分化和/或迁移，通常伴随反常或异常分子表型的疾病或病症，或与该疾病或病症相关的细胞或组织，该反常或异常分子表型包括与肿瘤发生、肿瘤标志物的表达、肿瘤抑制物表达或活性的丧失和/或反常或异常的细胞表面标志物表达相关的一种或多种遗传突变或其他遗传变化。癌症和肿瘤的非限制性实例包括肉瘤、癌、腺瘤、白血病和淋巴瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤和其他神经癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、头颈癌、肾癌、前列腺癌和黑素瘤。合适地，癌症响应于半乳糖凝集素-9的活化或刺激，例如通过本文公开的激动剂。在一些实施方案中，癌症响应于由半乳糖凝集素-9的活化或刺激引起的免疫记忆的诱导或增强。
本发明的另一个具体方面提供了至少部分地抑制或阻止哺乳动物的免疫力的方法，包括至少部分地抑制或阻断哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性从而抑制或阻止哺乳动物的免疫力的步骤。
合适地，该方法包括向哺乳动物施用半乳糖凝集素-9抑制剂或拮抗剂从而抑制或阻断哺乳动物中的半乳糖凝集素-9活性的步骤。优选地，抑制剂或拮抗剂至少部分地阻止或干扰pd-l2和半乳糖凝集素-9之间的结合相互作用。另外地或可选地，半乳糖凝集素-9抑制剂或拮抗剂至少部分地阻止或干扰通常在响应pd-l2结合时发生的半乳糖凝集素-9信号传导。在一些实施方案中，半乳糖凝集素-9抑制剂或拮抗剂可以是直接结合半乳糖凝集素-9的试剂(例如抗半乳糖凝集素-9抗体或抗体片段)，或可以是直接结合pd-l2(例如抗pd-l2抗体片段)以抑制或阻断pd-l2多聚化和/或与半乳糖凝集素-9结合的试剂。在具体的实施方案中，半乳糖凝集素-9抑制剂或拮抗剂可以包括：(i)可溶性半乳糖凝集素-9或其抑制性片段；(ii)结合半乳糖凝集素-9从而抑制或阻断pd-l2与半乳糖凝集素-9之间的结合和/或半乳糖凝集素-9信号传导的拮抗剂抗体或抗体片段或其他试剂；(iii)抑制或阻断pd-l2与半乳糖凝集素-9之间的结合和/或半乳糖凝集素-9信号传导的单体或二聚体pd-l2；(iv)结合pd-l2并由此阻止pd-l2结合半乳糖凝集素-9的抗体或抗体片段或其他试剂；和/或(v)结合pd-l2以阻止或抑制pd-l2多聚化的抗体或抗体片段或其他试剂。
因此，在一个实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用可溶性半乳糖凝集素-9或其抑制性片段从而抑制或阻断哺乳动物中pd-l2与半乳糖凝集素-9之间的结合的步骤。在一个实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用结合半乳糖凝集素-9的拮抗剂抗体或抗体片段从而抑制或阻断哺乳动物中pd-l2与半乳糖凝集素-9之间的结合和/或半乳糖凝集素-9信号传导的步骤。在另一个实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用单体或二聚体pd-l2从而抑制或阻断哺乳动物中pd-l2与半乳糖凝集素-9之间的结合和/或半乳糖凝集素-9信号传导的步骤。在另一个实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用结合pd-l2的抗体或抗体片段从而阻止pd-l2结合半乳糖凝集素-9的步骤。在又一个实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用结合pd-l2的抗体或抗体片段或其他试剂以阻止或抑制哺乳动物中pd-l2多聚化的步骤。
在某些实施方案中，抑制或阻止哺乳动物中的免疫力可促进或辅助疾病、紊乱或病症的预防或治疗。在具体实施方案中，疾病、紊乱或病症可以是自身免疫性疾病、紊乱或病症，炎性疾病、紊乱或病症，包括过敏性疾病、紊乱或病症。
应当理解，由于在导致自身免疫性和/或炎性疾病、紊乱和病症的潜在免疫机制中的共同性，在自身免疫性和炎性疾病、紊乱和病症之间可能存在重叠。然而，仅作为实例，自身免疫性疾病、紊乱或病症包括干燥综合征、i型糖尿病、强直性脊柱炎、桥本氏甲状腺炎、克罗恩氏病、肌萎缩性侧索硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化、格雷夫斯病、爱迪生氏病、白塞氏综合征、vogtkoyanagi-harada(vkh)疾病、类风湿性关节炎和牛皮癣性关节炎，但不限于此。炎性疾病、紊乱或病症的非限制性实例包括炎性肠病、动脉粥样硬化、骨盆炎性疾病、乳糜泻、哮喘、慢性阻塞性肺病和过敏，但不限于此。
在一个具体实施方案中，所述疾病、紊乱或病症响应于t-bet或包含t-bet的信号传导途径的阻断或抑制。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，t盒转录因子t-bet是1型样免疫的关键调节剂，在t和b淋巴细胞以及树突细胞和自然杀伤细胞中效应细胞命运的建立和/或维持中起关键作用。t-bet可以在维持th1效应子功能和分化中起作用，包括cd4和γδt细胞中ifn-γ的产生，但不限于此。例如，t-bet缺陷保护免于自身免疫性和/或炎性疾病，而t-bet过表达促进自身免疫性和/或炎性疾病。如将在实施例中更详细描述的，阻断pd-l2/半乳糖凝集素-9途径会阻断t-bet，因此其具有提供治疗自身免疫性和/或炎性疾病的新方法的潜力。
可以通过施用包含半乳糖凝集素-9激动剂、拮抗剂和抑制剂以及合适的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物来实现如上所述的半乳糖凝集素-9激动剂、拮抗剂和抑制剂的施用。
一般来说，载体、稀释剂或赋形剂可以是可被安全用于全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂、缓冲剂、粘合剂或包封物质。根据具体的给药途径，可以使用本领域熟知的多种载体、稀释剂和赋形剂。它们可以选自下组：糖，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽，明胶，滑石，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，海藻酸，磷酸盐缓冲溶液，乳化剂，等渗盐水和盐如矿物酸盐，包括盐酸盐、溴酸盐和硫酸盐，糖，糖醇，有机酸如乙酸、丙酸和丙二酸，和无热原水。描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingco.njusa,1991)。
在一些实施方案中，组合物可以进一步包含一种或多种免疫调节剂，包括佐剂和免疫刺激核酸，包括但不限于以下：tlr激动剂，脂多糖及其衍生物如mpl，弗氏完全佐剂或不完全佐剂，十六烷基胺，十八烷基胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基双十八烷基溴化铵，n,n-双十八烷基(dicoctadecyl)-n’,n’-双(2-羟乙基-丙二胺)，甲氧基十六烷基甘油和普朗尼克多元醇；多胺如吡喃，葡聚糖硫酸盐，聚ic卡波姆，肽如胞壁酰二肽和衍生物，二甲基甘氨酸，特夫素，油乳剂，矿物凝胶如磷酸铝、氢氧化铝或明矾，淋巴因子，咪喹莫特，guardiquimod，quila和免疫刺激复合物(iscoms)。
可以采用任何安全的给药途径向受试者提供包含半乳糖凝集素-9激动剂、拮抗剂或抑制剂的组合物。例如，可以采用口服、直肠、胃肠外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、经皮等。
待施用于哺乳动物的半乳糖凝集素-9激动剂、拮抗剂或抑制剂的浓度或量可由本领域技术人员容易地确定，并且将考虑诸如要治疗的疾病、紊乱或病症的性质和/或哺乳动物的体重、年龄、性别和/或一般健康状况和体质的因素。
在一个实施方案中，药物组合物可以是疫苗或其他免疫原性组合物。合适地，疫苗或免疫原性组合物包含半乳糖凝集素-9激动剂、合适的载体、稀释剂或赋形剂和能够在哺乳动物中引发免疫应答的免疫原。优选地，免疫应答是包括免疫记忆的引发的保护性免疫应答。免疫原可以是病原体的组成分子(例如其细胞表面蛋白、免疫原性肽或病原体的其他组分，例如在“亚单位疫苗”中，包含多个b-和/或t-表位的多表位，vlp，衣壳或壳粒)、灭活的病原体(例如灭活病毒，减毒寄生虫感染的rbc或减毒细菌)或能够引发对病原体的免疫应答的任何其他分子。例如参考证明了施用pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗体激动剂在改善疟疾免疫中的功效的实施例。
本发明的另一方面提供了设计、筛选、工程化或以其他方式产生半乳糖凝集素-9激动剂、抑制剂和/或拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤：(i)确定候选分子是否为激活或刺激半乳糖凝集素-9的活性且从而能够刺激或增强哺乳动物的免疫力的激动剂；或(ii)确定候选分子是否为阻断或抑制半乳糖凝集素-9的活性且从而能够至少部分地抑制或阻止哺乳动物的免疫力的拮抗剂或抑制剂。
广义地，如上所述，根据该方法设计、筛选、工程化或以其他方式产生的半乳糖凝集素-9激动剂、抑制剂和/或拮抗剂可能能够刺激或增强哺乳动物的免疫力，或者能够至少部分地抑制或阻止哺乳动物的免疫力。
在一个具体实施方案中，在步骤(i)中，候选分子模拟半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或激活。
在一个具体实施方案中，在步骤(ii)中，候选分子至少部分地阻断或抑制半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或活化。
候选分子可以是蛋白质，包括肽或多肽诸如如上所述的抗体或抗体片段，小有机分子，碳水化合物如单糖、二糖、三糖或多糖，脂质，核酸，适体或包含这些中的一种或多种的任何分子，但不限于此。
适用于设计和/或筛选候选调节剂的技术的非限制性实例可以使用本领域公知的x射线晶体学、nmr谱学、计算机辅助的结构数据库筛选、计算机辅助建模或者检测分子结合相互作用的生物化学或生物物理技术。
鉴定分子相互作用的生物物理和生物化学技术包括竞争性放射性配体结合测定，共免疫沉淀，基于荧光的测定包括荧光共振能量转移(fret)结合测定，电生理学，分析型超速离心，标记转移，化学交联，质谱，微量热法，表面等离子体共振和基于光学生物传感器的方法以及诸如在currentprotocolsinproteinscienceeds，coligan等人(johnwiley&sons，1997-2013)的第20章中提供的量子点生物传感器。生物化学技术如双杂交和噬菌体展示筛选方法在currentprotocolsinproteinscienceeds(coligan等人，johnwiley&sons，1997-2013)的第19章中提供。
因此，所述方法的初始步骤可包括鉴定根据广泛的结构和/或功能属性(例如结合半乳糖凝集素-9和/或与pd-l2竞争或以其他方式结合半乳糖凝集素-9以预防或抑制pd-l2多聚化的能力)选择的多个候选分子。
该方法可以包括测量或检测响应于候选分子的与半乳糖凝集素-9相关的一种或多种生物活性的变化的另一步骤。这些可以包括激活或抑制半乳糖凝集素-9细胞内信号传导、细胞因子产生、保护免受肿瘤攻击、增强用病原体或病原体衍生的分子(例如疫苗)的免疫、抑制自身免疫性、炎症或过敏反应、体外或体内t细胞记忆的诱导，但不限于此。用于测量或检测与半乳糖凝集素-9相关的一种或多种生物活性的这种变化的方法和方案是本领域技术人员公知的，其中至少一些详细提供在下面的实施例中。
应当理解，根据上文所述的方法，半乳糖凝集素-9激动剂、拮抗剂和/或抑制剂可以是有用的。
本文公开的本发明可以在表达半乳糖凝集素-9或其功能同源物的任何哺乳动物中实施。优选地，哺乳动物是人。
参考以下非限制性实施例，以便使本发明的具体实施方案易于理解并付诸实施。
实施例
pd-l2和半乳糖凝集素-9
科学共识是spd-l2可能具有有益效果，但这是通过对于pd1的配体竞争：当pd-l1结合pd1时，其关闭免疫应答，而pdl2可通过与pd-l1竞争结合pd1而具有相反的作用。似乎几乎没有pd-l2本身的阳性刺激作用的报道。关于半乳糖凝集素-9，这被认为是tim3的配体，其中tim3是有助于由半乳糖凝集素-9结合诱导或介导的t细胞耗竭的免疫调节剂。为了避免t细胞耗竭，许多开发工作致力于阻断半乳糖凝集素-9/tim3与抗体的相互作用，从而增强免疫应答。这与本发明略有不同，本发明试图激活半乳糖凝集素-9以实现改善的免疫应答。然而，最近的论文发现半乳糖凝集素-9和tim3不相互作用(至少在人类中)，因此共识可能正在改变(leitner等，2013)。gabriel等人在2009年的综述中，提出了向小鼠、兔子和大鼠施用半乳糖凝集素-9具有与本文所述相反的效果(至少在活化的t细胞中)，并且预期在初始t细胞中也具有相反的作用。此外，gabriel等人推断，在胸腺微环境中半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素3、半乳糖凝集素8和半乳糖凝集素9诱导双阴性(cd4-cd8-)或双阳性(cd4+cd8+)胸腺细胞凋亡，表明这些半乳糖凝集素可能在调节中心耐受中起作用。再次，该观点与本发明相反。
疟疾
几种疾病如疟疾、hiv和tb每年导致全球数百万人的发病和死亡。已经证明疫苗的开发是非常具有挑战性的，因为这些病原体已经进化出几种机制来规避免疫。程序性细胞死亡-1(pd-1)途径参与hiv和疟原虫属(plasmodiumspp)(疟疾的致病因子)通过其规避免疫的机制。因此，我们使用疟疾的小鼠模型来研究该途径可以如何损害免疫力。
疟疾每年感染3亿至5亿人，且杀死数百万人。已经有疟疾疫苗的>40个临床试验，大多数基于抗体介导的保护，但只有一个达到iiib期。甚至终身暴露于疟疾也可能不会诱导保护性抗体反应(egan等人,1995；egan等人,1996)，且感染红内期恶性疟原虫(pf)的幼儿发生预先存在的抗-疟疾抗体水平的迅速下降(akpogheneta等人，2008；kinyanjui等人，2007)。使用含有来自220个个体的血浆探测的约23％的恶性疟原虫蛋白质组的蛋白质微阵列的更详细研究证实在疟疾季节期间抗体对这些蛋白质的反应性急剧上升，但是是短期的(crompton等人，2010)。测量了来自疟疾流行地区儿童的抗原特异性记忆b细胞(mbc)的以前研究发现多次暴露于疟疾并不产生循环抗原特异性mbc的稳定群体(dorfman等人，2005)。此外，纵向研究最近显示，pf特异性mbc和抗体滴度在急性疟疾后增加，然后在6个月内收缩至略高于感染前水平的点，表明pf特异性mbc和长寿抗体区室两者的无效的逐步扩增，这可以解释为什么儿童免疫力差和需要几年才能发育(weiss等人,2010)。与主要基于非洲的这些研究相反，在疟疾的流行性低得多的泰国，已知过去6年中经历恶性疟原虫和/或间日疟原虫的临床攻击的个体具有抗原特异性抗体和/或抗原特异性mbc的稳定频率(wipasa等人，2010)。
cd4+t细胞由几种辅助亚型组成，其形成针对特定病原体的免疫应答。在疟疾期间，cd4+t细胞亚群在保护、发病机理以及免疫应答规避中具有多重作用。已经证明cd4+t细胞是小鼠中实验性疟疾期间干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)的主要来源(muxel等人，2011)，其涉及针对这种疾病的保护。在感染夏氏疟原虫(p.chabaudi)疟疾的小鼠中的研究已经表明ifn-γ和tnf-α协同诱导脾中的一氧化氮合酶表达以控制最高寄生虫负荷(jacobs等人，1996)。类似地，在人类中，早期ifn-γ对pf的应答与更好的抗寄生虫免疫力相关(mccall等人，2010)。ifn-γ有助于形成广泛的针对疟疾的保护性反应的网络(mccall和sauerwein，2010)。特别值得注意的是调查慢性疟疾对msp1特异性转基因cd4+t细胞的影响的研究(stephens和langhorne，2010)。将这些寄生虫特异性t细胞接种到thy1.1同系小鼠中，然后用105个夏氏疟原虫感染的红细胞感染。在第30-34天用氯喹处理一半小鼠以清除慢性疟疾。在60天后，转基因t细胞的流式细胞术分析发现，与已经清除感染的药物处理的小鼠相比，在未处理的小鼠中大约25％的记忆cd44+il-7r+cd4+t细胞损失(stephens和langhorne，2010)。这项研究强调，正在进行的感染导致能够保护免受再感染的一些寄生虫特异性的记忆t细胞的损失。
程序性死亡1(pd-1)和疟疾
pd-1参与疟疾的病理发生。为了理解pd-1在针对慢性和致死性疟疾的免疫以及长期保护免于再感染中的作用，使c57/bl6(wt)小鼠和pd-1基因缺失的c57/bl6小鼠(pd-1ko)群组感染非致死性105夏氏疟原虫(慢性疟疾)或致死性约氏疟原虫ym寄生的红细胞(prbc)，并且每1-2天检查血液的寄生虫血症。40天后，使所有存活的小鼠休息140天以允许初始免疫细胞消退，只有记忆细胞存活。然后在第180天用相应的寄生虫再感染这些小鼠(图1a和b中的箭头)。我们发现感染非致死性夏氏疟原虫的所有wt小鼠在约35天内清除原发感染(图1a)。当这些wt小鼠在第180天再感染时，所有小鼠发展出寄生虫血症，尽管比首次感染的水平低得多(图1a)。相比之下，pd-1ko小鼠在15天内清除夏氏疟原虫感染，在约第30天时只有20％的小鼠经历低度再发性感染(图1b)。在再感染时，9/9个pd-1-ko小鼠没有显示寄生虫血症(图1b)，并且当血液转移到初始小鼠时具有无虫免疫(数据未显示)。
当用致死性约氏疟原虫ym感染wt小鼠时，所有小鼠在感染的7天内死亡(图1a)。相反，10/10个pd-1ko小鼠从致死性约氏疟原虫ym感染和180天后的再感染中存活。明显地，只有40％的再攻击小鼠经历低水平的寄生虫血症(图1b)。这些研究表明pd-1途径推进慢性和致死性疟疾，并阻止针对再感染的最佳的长期保护。
疟疾期间cd4+t细胞的耗竭
检查在疟疾过程中pd-1表达的最先研究之一使用小鼠模型来显示表达il-7rlo的cd4+和cd8+t细胞上的pd-1表达(chandele等人，2011)。这些pd-1表达细胞(特别是cd8+t细胞)在感染后30天内几乎完全丧失(chandele等人，2011)。然而，该研究没有测量功能性反应以确定t细胞耗竭。类似地，随后的研究表明，在马里和肯尼亚pf感染个体的血液中，pd-1也在cd4+(butler等人，2012；illingworth等人，2013)和cd8+t细胞(illingworth等人，2013)上表达，但没有提供耗竭的功能性证据。
为了验证这些观察结果，采用红内期疟疾的鼠模型来研究pd-1和lag-3的表达增加对cd4+t细胞的影响(butler等，2012)。在小鼠的约氏疟原虫和夏氏疟原虫疟疾中，用抗体联合阻断pd-l1和lag-3抑制性分子加速了寄生虫血症的清除(butler等，2012)。pd-l1和lag-3的这种双重阻断提高了与增强的抗体介导的免疫相关的cd4+滤泡t辅助细胞(tfh)数目(butler等，2012)。此外，在感染后第8天和第9天用抗疟药物氯喹处理的感染小鼠显示较低水平的cd4+t细胞功能障碍(butler等，2012)。这些研究表明淋巴细胞耗竭调节针对疟疾的免疫。
随后的研究使用pd-1缺失的小鼠(pd-1ko)以最终确定pd-1是否在调节免疫中起作用，因为pd-l1可以与b7-1(butte等人，2007)和pd-1(iwai等，2003)两者特异性地相互作用以抑制t细胞活化。研究了夏氏疟原虫疟疾，因为这种感染发展成慢性感染。显示pd-1介导寄生虫特异性cd4+t细胞在疟疾的慢性期(35天)中增殖和分泌ifn-γ和tnf-α的能力的降低，表明这些细胞的耗竭(horne-debets等人,2013)。然而，与综合的pd-l1/lag-3阻断研究相反，未观察到tfh数量的变化。这种明显矛盾的一个可能的解释是，与wt小鼠相比，pd-1ko小鼠具有显著更高比例的调节性t滤泡细胞(tfr细胞)(horne-debets等人，2013)。已知tfr细胞在体外是抑制性的并且在体内限制tfh细胞和gcb细胞的数量(linterman等人，2011)。或者，由于pd-l1也可以与b7-1特异性地相互作用以抑制t细胞活化(butte等人，2007)，该途径可以控制pd-1ko小鼠中的tfh数量。
cd8+t细胞和耗竭
pd-1介导的细胞耗竭与cd8+t细胞的耗竭最相关。然而，如前所述，cd8+t细胞在血内期疟疾的清除中的作用没有被广泛认知，尽管它们在脑型疟疾的发病机理和脾脏结构的损害中的作用(beattie等人，2006)是已知的。关键的是，最近显示pd-1在疟疾的急性期期间介导寄生虫特异性cd8+t细胞的数量和功能能力的95％的损失，这加剧了导致慢性疟疾的感染(horne-debets等，2013)。该研究检查了与野生型(wt)相比，pd-1ko小鼠中慢性疟疾的进展，其中100％的小鼠发展成慢性感染。有趣的是，<30％的pd-1ko小鼠发展成慢性感染，并且这些小鼠中的寄生虫血症水平比wt小鼠的低>100倍。然而，pd-1ko小鼠中cd8+t细胞的耗竭提高峰值寄生虫血症2倍，并且100％的pd-1ko小鼠发展成慢性疟疾(horne-debets等人，2013)。总体而言，在疟疾的慢性期期间，pd-1介导的四聚体+cd8+cd62l-t细胞数量减少80％，cd8+细胞响应于寄生虫增殖的能力降低95％(horne-debets等人,13)。特别值得注意的是，即使pd-1ko小鼠具有比wt小鼠更多的功能性cd4+t细胞和类似的寄生虫特异性抗体滴度，但如果cd8+t细胞耗竭，它们仍然发展成慢性疟疾。
最后，pd-1ko小鼠具有比wt小鼠更多的表达颗粒酶b的cd8+t细胞，表明涉及感染细胞的细胞毒性杀伤。这些观察突出了cd8+t细胞在针对慢性疟疾的保护中的关键作用。相比之下，以前的研究发现阻断pd-l1增强由病原性cd8+t细胞介导的实验性脑型疟疾(hafalla等人，2012)，表明该途径保护免受脑型疟疾。肯尼亚的研究突出了这些发现的临床意义，其发现来自感染疟疾的个体的人cd8+t细胞表达pd-1(illingworth等人，2013)。因此，cd8+t细胞的作用需要特别考虑，因为它可以解释为什么尽管多年暴露于强烈的pf传播，仍没有获得性的无菌免疫的证据(tran等人，2013)。可能的是抗体和cd4+t细胞提供针对症状性疟疾(symptomaticmalaria)的保护，但是cd8+t细胞是无菌免疫所需的。因此，在pd-1介导的cd8+t细胞耗竭的情况下，从未获得无菌免疫，如最近报道的(tran等，2013)。
dc和疟疾
已经确定，在疟疾期间cd4+t细胞清除主要的峰值寄生虫血症，b细胞清除残余的寄生虫。由于t细胞活化需要dc，我们比较了5种小鼠寄生虫株中的dc功能，并发现了致死性和非致死性株与寄生虫物种之间的表型和dc功能的二分性(wykes等人，2007a；wykes等人，2007b)，且如综述的(wykes和good，2008)。这些研究还发现，来自非致死性约氏疟原虫17xnl和夏氏疟原虫感染的dc是完全功能性的，且特别地分泌大量的il-12(wykes等人，2007a；wykes等人，2007b)。相比之下，来自感染了寄生虫的三种致死性株(约氏疟原虫ym、文氏疟原虫和伯氏疟原虫)的小鼠的dc缺乏功能性，因为它们不能引发t细胞或分泌il-12(wykes等人，2007a；wykes等人，2007b)。当来自非致死性约氏疟原虫17xnl感染的小鼠的dc转移到初始小鼠时，受体小鼠在致死性感染攻击下存活，并且该作用由il-12介导(wykes等人，2007a)。此外，其他组还显示在疟疾期间dc功能受损(good等人,2005；ocana-morgner等人,2003；urban等人,1999；urban等人,2001)。
已知pd-l2主要由dc表达，而pd-l1在包括dc的一系列细胞上表达。因此，然后检查来自初始小鼠和感染小鼠的dc的pd-l2表达。测量来自初始小鼠和非致死性约氏疟原虫17xnl或致死性约氏疟原虫ym感染的小鼠的dc中的pd-l2mrna水平(图2)。来自致死性感染的dc显示pd-l2mrna增加约50％，而来自非致死性感染的dc具有在蛋白质表达中近300％提高的反应。这项研究表明较高的pd-l2表达与较好的疟疾存率活相关。
疟疾中pd-l2的保护作用
为了解决由dc表达的pd-l2是否是保护性的，wt小鼠用非致死性疟疾感染，并用pd-l2特异性阻断抗体处理以抑制该分子的功能。对于该实验，几个wt小鼠群组用约氏疟原虫17xnl和夏氏疟原虫感染，并在感染后1天和每3-4天用抗pd-l2或对照大鼠igg(对照ig)处理直到感染后第14-18天。
接受对照ig的所有wt小鼠(图3a和b)在30-37天内清除明显的感染。然而，给予约氏疟原虫17xnl和pd-l2阻断抗体的所有小鼠由于严重的症状在25天内死亡或被安乐死(图3a)。相反，尽管所有具有慢性夏氏疟原虫疟疾的小鼠在pd-l2阻断中幸存，但是它们具有比对照小鼠高16％的初级峰寄生虫血症(注意对数标度；*表示p＝0.0048)，在感染的慢性期中的更高的寄生虫血症水平，并需要4天的更多时间清除感染(图3b)。
为了确定约氏疟原虫ym或伯氏疟原虫感染是否因为dc上缺乏或低pd-l2表达而是致死的，使这些小鼠补充spd-l2(图4和5)。为此，用约氏疟原虫ym或伯氏疟原虫感染几个wt小鼠群组，并且在感染后第3、5和7天给予可溶性重组pd-l2-人-fc合成蛋白。虽然感染约氏疟原虫ym和给予对照人igg(对照ig)的所有wt小鼠在11天内死亡，但给予多聚体spd-l2的92％的小鼠存活并在25天内清除感染，具有显著较低的峰值寄生虫血症(图4a和b；p<0.001)。然后使所有存活的小鼠休息150天，并用相同剂量的致死性约氏疟原虫ym疟疾(没有另外的pd-l2；图4a)再次攻击。所有小鼠以最小寄生虫血症(<1％)存活，而所有新的对照小鼠(对照ig-r)死于感染。有趣的是，二聚体pd-l2具有负面作用，而更高多聚体(例如八聚体spd-l2)具有强的有益效果。
对具有伯氏疟原虫疟疾的小鼠的分析发现，所有对照小鼠在8天内(图5a)发展成脑型疟疾症状(包括褶皱毛皮、痉挛、昏迷)，并在第10天死于感染(图5b)。相比之下，所有用spd-l2处理的伯氏疟原虫感染的小鼠从未发生脑症状，控制感染约15天，但是在第25天全部死于不受控的寄生虫血症。未测试其他剂量。
这些研究证实pd-l2表达是免疫和从疟疾存活所需的。在表达该蛋白的小鼠中阻断pd-l2介导致死性或加重感染。相反，如果小鼠在其dc不表达pd-l2时补充spd-l2，则它们从致死性感染中存活或保持没有脑症状。
pd-l2通过cd4t细胞介导保护
为了确定spd-l2是否通过t细胞提高免疫力，约氏疟原虫ym感染的小鼠在没有或存在cd4+或cd8+t细胞的情况下给予spd-l2。对于该实验，在约氏疟原虫ym感染前1天给予wt小鼠cd4+或cd8+t细胞耗竭性抗体或用大鼠ig(大鼠ig)处理，并且每3-4天处理直到感染后第14-18天。然后在感染后第3、5和7天给予小鼠spd-l2或对照人ig。
接受对照ig(图6a)的所有wt小鼠死亡或在第14天必须被安乐死。相比之下，给予spd-l2的约60％的约氏疟原虫ym感染的小鼠存活并在30天内清除感染。然而，如果感染的wt小鼠给予spd-l2但耗尽cd4+t细胞，所有小鼠死亡或必须被安乐死(图6a和b)，因为他们发展成严重的临床症状。相比之下，cd8+t细胞的耗竭不影响通过spd-l2处理从致死性疟疾存活，但小鼠确实经历更高的寄生虫血症(图6c)。总之，这些观察结果证明了spd-l2通过cd4+t细胞介导保护和存活，对cd8+t细胞功能具有一些影响。这些研究在非常年轻的小鼠中进行(由于成熟小鼠的可获得性不足)，其中spd-l2处理后的中值存活率低于成年小鼠。
通过spd-l2的保护不是通过阻断pd-l1功能来介导的
鉴于dc上pd-l2的表达或spd-l2处理可介导保护性免疫，我们假设pd-l2可通过阻断pd-l1介导的免疫抑制来介导保护。为了测试该假设，用约氏疟原虫ym感染两个pd-l1敲除小鼠(pd-l1ko；n＝4)群组，并用三个剂量的pd-l2或对照igg处理。所有对照小鼠到第7天死于严重的临床症状和高寄生虫血症水平(～78％)(图7)。相比之下，用pd-l2处理的感染pd-l1ko小鼠控制寄生虫血症(24％)但是到第10天死亡。这项研究表明由pd-l2介导的保护独立于pd-l1。
cd4+t细胞上的半乳糖凝集素-9是pd-l2的新受体
鉴于pd-l2针对疟疾是保护性的，而独立于pd-l1，我们假设它在初始t细胞上有第二受体。为了测试这个假设，我们制备了从初始c57bl/6小鼠分离的t细胞的裂解物，并使用固定的pd-l2或人igg免疫沉淀该受体(图8)。在3个独立实验中对5个可重复条带重复进行免疫沉淀，包括免疫球蛋白重链和轻链(条带1和4)、spd-l2(条带5)和肌动蛋白(条带3)。半乳糖凝集素-9(条带2)通过pd-l2免疫沉淀，但在3个独立实验中没有通过人igg免疫沉淀的等同条带。对照中指定为n2°和n2的条带是组蛋白。最后，为了证实通过spd-l2免疫沉淀的条带2是半乳糖凝集素-9，实验进行重复，但是将凝胶转移到硝酸纤维素上并用抗半乳糖凝集素-9抗体标记western印迹(图9)。这些研究证实通过从t细胞免疫沉淀的条带2的测序发现的39kd条带是半乳糖凝集素-9，且潜在地是pd-l2的新结合伴体。
初始t细胞上的半乳糖凝集素-9是pd-l2的受体
为了确定spd-l2是否结合完整t细胞上的半乳糖凝集素-9，从初始小鼠的脾脏分离总t细胞群体，并用生物素化的spd-l2和apc-链霉亲和素或pe-抗半乳糖凝集素-9孵育(图10)。流式细胞术分析发现，尽管spd-l2结合约12.8％的初始cd4+t细胞，但半乳糖凝集素-9仅在约1.9％的这些细胞上表达。用过量的未标记的抗半乳糖凝集素-9抗体预处理初始t细胞减少了spd-l2标记约3％，证实spd-l2结合t细胞上的半乳糖凝集素-9。先前发表的研究显示，从初始小鼠的脾脏获取的cd4+t细胞的约10-20％表达可结合pd-l2的pd-1。最后，在该测定中，spd-l2不结合大数量的cd8+t细胞。
spd-l2和抗半乳糖凝集素-9介导初始cd4+和cd8+t细胞的存活和分化
在涂覆有抗cd3(5μg/ml)的96孔板中培养分离自初始小鼠的t细胞以提供抗原信号以及il-2。培养物还补充(a)作为对照的板结合的大鼠igg，(b)板结合的spd-l2，(c)板结合的spd-l2和用抗半乳糖凝集素-9(克隆108a)抗体形式的半乳糖凝集素-9抑制剂处理的细胞，(d)半乳糖凝集素-9激动剂抗体(克隆rg9.1)，和(e)抗半乳糖凝集素-9(克隆rg9.35)。spd-l2增加表达tbet的cd4+cd62llo细胞的百分比(图11a)和(b)与大鼠igg对照(图11b)相比细胞内tbet的水平(图11b)。该作用被抗半乳糖凝集素-9(克隆108a)抗体阻断。克隆rg9.1还增加表达tbet的cd4+cd62llo细胞的百分比和细胞内tbet的水平(图11a和b)。
用板结合的pd-l2和rg.1(rg9.1)处理的细胞的生存力在36小时后高于其他培养物，因此这些培养实验的一些用具有低得多的cd3水平刺激(1μg/ml)对72小时培养物重复。如图12所示，与对照培养物相比，spd-l2和rg1(rg9.1)抗体均提高cd4+和cd8+t细胞的生存力。
可溶性pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗体保护免受致死性疟疾
为了确定信号传导半乳糖凝集素-9是否具有与可溶性pd-l2相同的作用，用约氏疟原虫ym感染三个wt小鼠群组，并且在感染后第3、5和7天静脉内给予200μgspd-l2、抗半乳糖凝集素-9或大鼠igg。每天监测小鼠，并对疾病的临床症状进行评分，包括褶皱毛皮、驼背或缺乏活力。给予spd-l2或激动性抗半乳糖凝集素-9(克隆rg9.1)的小鼠显示最少症状，并且当所有对照小鼠死亡或被安乐死时，这些组中的2/3小鼠存活(图12)。
半乳糖凝集素-9是spd-l2的结合伴体
进行octetred研究以确定小鼠半乳糖凝集素-9和小鼠pd-l2之间的结合的生物化学性质。spd-l2与探针结合，并测量其与spd-1和sgalectin-9的相互作用。如图13所示，结果显示pd-l2和pd-1之间几乎瞬时的结合和解离。相反，半乳糖凝集素-9结合需要约200秒与pd-l2结合和>614秒解离，表明非常稳定的相互作用。最显著地，尽管pd-l2-pd-1相互作用的分子比率为1:1，但半乳糖凝集素-9和pd-l2相互作用涉及在结合期间半乳糖凝集素-9的聚集或多聚化。这有助于解释为什么spd-l2的多聚体形式对疟疾具有保护作用，而单体或二聚体形式可能不保护。我们的通过单体和多聚体spd-l2的保护的比较研究发现，与其中77-92％的小鼠受到保护(图4)的多聚体spd-l2相比，单体spd-l2不能保护小鼠免于致死性约氏疟原虫ym疟疾(n＝4)或预防脑型疟疾(n＝3)。此外，单体spd-l2加剧脑型疟疾，表明其阻断spd-l2与半乳糖凝集素-9的相互作用。因此，所施用的spd-l2的形式可以用于控制免疫应答的性质(例如，可以施用多聚体形式以提供对疟疾或癌症的保护，且可以施用单体形式以下调免疫系统以治疗炎症或自身免疫性疾病，例如哮喘或克罗恩氏病)。在这点上，在体内促进pd-l2多聚化的试剂也可用于本发明，例如使用适体和双特异性抗体。适体是小的寡核苷酸，其可以特异性结合宽范围的靶分子，并且作为治疗剂提供一些优于抗体的优点。这些可以模拟多聚体pd-l2。
抗半乳糖凝集素-9抗体激活培养物中的小鼠cd4+t细胞以分泌th1细胞因子
由dc表达的半乳糖凝集素-9也是t细胞上的tim-3的配体(zhu等人，2005)。可溶性半乳糖凝集素-9诱导的th1细胞的死亡在体外依赖于tim-3，并且体内施用半乳糖凝集素-9蛋白导致产生干扰素γ的t细胞的选择性损失(zhu等人，2005)。t细胞表达的半乳糖凝集素-9的作用不太清楚。我们最初测试了3种抗半乳糖凝集素-9抗体，并发现2/3被激活(数据未显示)。我们分析了在体外具有最强刺激活性的共刺激性抗半乳糖凝集素-9抗体对纯化的t细胞的影响。我们评估了对照igg、可溶性小鼠pd-l2-ig或抗小鼠半乳糖凝集素-9mab对从小鼠脾脏分离并在用抗cd3抗体涂覆的塑料板上培养的cd4+t细胞的影响。培养3天后，测试上清液的细胞因子。与采用igg的对照培养物相比，固定的pd-l2和抗半乳糖凝集素-9能够显著增加il-2(～4倍)、ifn-γ(～4倍)和tnf-α(60％)分泌。这些研究证实pd-l2和抗半乳糖凝集素-9为小鼠t细胞提供了共刺激信号，以改善th1反应，如先前针对小鼠pd-l2报道的(shin等人，2003)。
对人cd4+t细胞进行的类似测定也显示spd-l2可增加th1细胞因子的分泌(图15a)。
由于我们没有找到刺激人cd4+t细胞的细胞因子产生的抗人半乳糖凝集素-9抗体，我们测试了抗小鼠半乳糖凝集素-9抗体(图15b)。这种抗小鼠半乳糖凝集素-9抗体诱导干扰素-γ(但不是其他细胞因子)分泌至通过人spd-l2诱导的水平。
抗半乳糖凝集素-9保护免受疟疾
为了证实抗半乳糖凝集素-9抗体能够提供通过用可溶性pd-l2处理所见的相同的保护(图4)，用致死性约氏疟原虫ym感染wt小鼠并用对照大鼠ig、阻断抗tim-3或抗小鼠半乳糖凝集素-9处理(图16a和b)。在重复实验中，3个剂量的抗半乳糖凝集素-9抗体介导75％的小鼠的存活，相比之下，通过抗体介导的tim-3阻断没有提供保护作用，tim-3是半乳糖凝集素-9的另一受体。与对照大鼠ig处理的小鼠相比，tim-3阻断没有提供显著的保护。
抗半乳糖凝集素-9降低肿瘤进展
鉴于th1cd4+t细胞免疫对于清除肿瘤也很重要，激活抗半乳糖凝集素-9抗体然后在两个同基因小鼠乳腺癌模型中测试。四个剂量的抗半乳糖凝集素-9抗体可以阻滞原位地注射到每个受试小鼠的第四左乳腺脂肪垫中的可触知的pymt源的乳腺癌的生长(图17a)。与同种型对照组相比，在第16-22天给予的抗半乳糖凝集素-9处理在第27和35天之间减缓肿瘤进展。先前的研究已经调查了treg细胞消融与ctla-4或pd-1/pd-l1阻断组合是否影响相同的原位植入的pymt源的乳腺癌(bos等人，2013)。据发现虽然treg细胞消融显著延迟原发性和转移性肿瘤进展，但检查点阻断并不影响致癌基因驱动的肿瘤生长。然后我们测试三个剂量的抗半乳糖凝集素-9(第8-10天给予)是否可以阻滞侵袭性转移eo771.lmb乳腺腺癌的生长(johnstone等，2015)。虽然所有对照小鼠到第15天被安乐死，但与第15天对照相比，处理的小鼠在第15-16天具有小35％的肿瘤(图17b)。总体而言，激活抗半乳糖凝集素-9处理降低原位植入乳腺癌的进展。
阻断pd-l2可抑制tbet+th1应答
为了证实pd-l2在体内确实控制tbet和th1免疫，我们用约氏疟原虫17xnl疟疾感染小鼠，并且当血液中可检测到寄生虫时用单克隆抗体阻断pd-l2。对于该实验，用约氏疟原虫17xnl感染wt小鼠，并且在感染后(p.i.)后4天给予抗pd-l2或对照大鼠igg，并且每3-4天给予直到感染后第14-18天。首先，检查cd4+t细胞的tbet表达，thet是th1cd4+t细胞的效应子功能所必需的转录因子，已知th1cd4+t细胞介导对疟疾的保护(ing和stevenson，2009；stephens和langhorne，2010)。还对t细胞评估cd62l的表达(cd62l是在初始t细胞上发现的标志物)，并且其还区分中枢记忆(cd62lhi)和效应记忆(cd62llo)t细胞。在感染7天后，存在具有pd-l2阻断的脾的tbet表达cd4+t细胞数目降低的趋势(图18a)。然而，到第14天，对照小鼠与pd-l2阻断的小鼠相比，具有每脾脏分别高2.2倍的表达tbet的cd62lhi和高3倍的cd62llocd4+t细胞(图18b)。类似地，对照小鼠比pd-l2阻断的小鼠具有高>5倍的分泌ifn-γ的寄生虫特异性cd4+t细胞数目(如在第14天通过elispot测定测量的)(图18c)。在pd-l2阻断的小鼠中，可由几种细胞类型分泌的血清ifn-γ水平在第7天降低，并且到第14天在两组小鼠中都低(图18d)。相比之下，具有pd-l2阻断的小鼠到第14天时比对照小鼠具有高>2倍的血清il-10(图18e)。该结果与每脾脏中2.6倍高的调节性t细胞(treg)数目相关(图18f)。与感染的wt小鼠相比，用约氏疟原虫17xnl感染的pd-l2ko小鼠的研究还发现在第14天每脾脏中表达tbet和分泌ifn-γ的寄生虫特异性cd4+t细胞数目显著降低(图19c，d)。最后，对于pd-l2ko小鼠或利用抗体的pd-l2阻断，到感染的第14天存在分泌ifn-γ的寄生虫特异性cd8+t细胞数目减少的趋势(图19e，f)。
总之，我们的数据显示pd-l2表达对约氏疟原虫17xnl疟疾感染期间的有效th1cd4+t细胞应答是必需的。重要的是，pd-l2是表达tbet的cd4+t细胞的最佳扩增所需的，因为pd-l2的阻断阻止了约氏疟原虫17xnl感染的第7天和第14天之间这些细胞数目的增加。值得注意的是，功能性、寄生虫特异性分泌ifn-γ的cd4+t细胞在第7天存在，但在不存在pd-l2信号时到第14天减少，表明这种信号改善这些关键效应子细胞的扩增和存活。鉴于这些发现，夏氏疟原虫感染的小鼠最可能在pd-l2阻断中存活，因为大量的寄生虫在10天内清除，但约氏疟原虫17xnl实验表明pd-l2仅在第一周后改善长期免疫。因此，仅在感染的第一周后需要pd-l2维持th1cd4+t细胞数目。
t盒转录因子t-bet已经作为1型样免疫的关键调节子出现，在t和b淋巴细胞以及树突细胞和自然杀伤细胞中建立和/或维持效应子细胞命运中起关键作用。t-bet可能在th1效应子功能的维持中起关键作用。t-bet-缺陷小鼠显示受损的th1分化，包括主要在cd4和γδt细胞中的缺陷ifn-γ产生。
th1反应长期以来与自身免疫性综合征关联。通常被认为是th1相关综合征的乳糜泻和克罗恩氏病显示出增强的t-bet活性和/或表达。在th1相关的ibd小鼠模型中，cd4+cd62l+细胞过继转移到严重的联合免疫缺陷(scid)受体中显示t-bet缺陷保护免于疾病的影响，而t-bet过表达促进疾病。这在多发性硬化(rack等人，2014)、炎症性关节炎(wang等人，2006)、糖尿病(juedes等人，2004)、
spd-l2介导的从致死性疟疾的存活需要cd4+t细胞
为了确定t细胞对多聚体spd-l2介导的约氏疟原虫ym疟疾存活的贡献，在spd-l2处理的感染小鼠中使cd4+或cd8+t细胞耗竭。对于该实验，用约氏疟原虫ym感染多组wt小鼠，并用spd-l2或人igg(hig)处理。这些小鼠在第1天和每3-4天也给予cd4+或cd8+t细胞消耗抗体或大鼠ig，直到感染后第14-18天。以前的研究证实所用的抗体会耗竭这些细胞。所有接受hig和大鼠ig的感染wt小鼠到第14天死亡或需要安乐死(图20a和b)。相比之下，当停止监测时，给予spd-l2和对照大鼠ig的75％的约氏疟原虫ym感染小鼠在30天内清除寄生虫血症并存活>50天(图6a和b)。然而，如果cd4+t细胞耗竭则小鼠不受spd-l2保护，并且由于临床症状的严重性必须被安乐死(图20a，c)。相反，cd8+t细胞的耗竭不显著影响由spd-l2提供的保护作用，尽管这些小鼠总是在大致第11-21天时具有比对照小鼠更高的寄生虫血症(图20a，d)。总之，这些发现证明spd-l2可以通过cd4+t细胞与cd8+t细胞的可能较小的贡献促进约氏疟原虫ym感染的保护、存活和寄生虫控制。
spd-l2通过改善的cd4+和cd8+t细胞功能介导保护和存活
为了确定spd-l2发挥其治疗效果的机制，在第3天和第5天用对照ig或spd-l2处理约氏疟原虫ym感染的小鼠，并在对照小鼠中严重临床症状发作前第7天收集脾脏。从脾脏中分离t细胞，并用来自初始小鼠的脾dc和寄生虫特异性抗原(msp119)或肽(pb1，sqllnakyl)或没有另外的抗原进行培养。用spd-l2处理增加了可以在培养物中响应msp119的寄生虫特异性cd4+t细胞的数目，与用对照ig处理的小鼠相比，分泌ifn-γ的cd4+t细胞数量高约2.7倍，如通过elispot测定测量的(图21a)。类似地，体外edu摄取测定证实spd-l2处理的小鼠具有响应于寄生虫抗原而增殖的更高数量的寄生虫特异性t细胞(图21b)。然而，群组之间的treg数目没有差异(图21c)。此外，spd-l2处理的小鼠还展现出高于对照组6倍的寄生物特异性cd8+t细胞(即，结合显示寄生虫特异性肽f4的mhc四聚体(db)数量(lau等人，2011))(图21d)。然而，在7天内这些细胞的ifn-γ分泌(图21e)或颗粒酶b表达(图21f)没有显著增加。总之，这些结果表明spd-l2通过促进分泌ifn-γ的cd4+t细胞的发育来保护小鼠免于致死性疟疾，这表明已知对于防止疟疾至关重要的th1效应子功能得到改善(kumar和miller,1990；stephens和langhorne,2010；su和stevenson,2002)。类似地，增加的cd8+t细胞解释了在约第11天至第21天用spd-l2处理的小鼠中观察到保护的适度改善(图18d)。
本说明书通篇旨在描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限于任何一个实施方案或特征的特定集合。在不脱离本发明的宽泛精神和范围的情况下，可对在此描述和示出的实施方案进行各种改变和修改。
本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献通过整体引用并入本文。
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