相关申请案交互参照本申请案主张美国暂时专利申请号62/068,987于2014年10月27日之优先权，其内容在此并入本案以作为参考数据。本发明是有关一种新颖之植物防御讯息胜肽及其应用。
背景技术：
：：所有多细胞生物皆演化出感知及反应细胞外化学讯息之机制。其中，胜肽为动物中最常见之细胞间交互作用调节者，系因其在序列、长度、及/或转译后修饰(ptms)提供更多变化，以代表不同生理反应(boller，2005)。相对于动物中发现之胜肽，植物中仅找到少数讯息胜肽(farrokhi等人，2008a；butenko等人，2009)。据估计，多数在细胞间沟通扮演杰出角色之内源性植物讯息胜肽仍未被发现。由于阿拉伯芥(arabidopsis)基因体之完整序列显示，故植物具有比动物多达十倍之预测之胜肽受体(shiuandbleecker，2003)及运输蛋白(initiative，2000)。此外，于现今找到之植物胜肽中，仅相当少数被发现在防御讯息上具功用。此主要基于一事实，即防御讯息胜肽系大多衍生自蛋白酶对较大之前驱物蛋白之选择作用，其系低量表现且高度动态。已知蕃茄受损可诱发抗虫害(anti-herbivore)反应，其系由胜肽激素系统素(systemin)，以及小分子激素茉莉酸(jasmonicacid；ja)及其甲酯(meja)调节(pearce等人，1991；orozco-cardenas等人，2001)。系统素(systemin)是第一个发现的植物讯息胜肽，也是第一个经确认之损伤相关分子模式(damageassociatedmolecularpatterns；damps)激发子。目前植物被认为可利用多种讯息胜肽对抗虫害及病原体攻击(cheong等人，2002；francia等人，2007；chassot等人，2008)，但在损伤受迫期间，胜肽对于调节抗虫害及抗病原体反应之细节仍待厘清。于其他植物物种已发现数种damp胜肽，并指出在蕃茄内具生物活性(bollerandfelix，2009b；campos等人，2014)；这些胜肽包括hypsys(pearce等人，2001a；narvaez-vasquez等人，2007)、ralf(pearce等人，2001b)及pep1(huffaker等人，2006；a.p.trivilin，2014)。pep1于阿拉伯芥中清楚发现与病原体相关，且近来其于蕃茄中预测之假定原蛋白发现涉及抗病原体反应(a.p.trivilin，2014)。然而，其胜肽于蕃茄中之内源性含量尚未被证实由组织损伤或meja诱发，meja系蕃茄中整体损伤讯号及反应之潜在诱发剂(scheerandryan，1999)。截至目前为止，尚未有研究以全面定量方式剖析植物在诱发压力反应前及/或后之细胞整体胜肽表现之变化。有必要找寻新的植物防御讯息胜肽，其不仅增进植物逆境生物学，还能有助于发展替代方法，以改进逆境耐受性及抗性，减少农用化学品之使用(pearce等人，1991；pearce等人，2001a；huffaker等人，2006)。技术实现要素：于本发明中，不可预期地发现一种衍生自蕃茄病原性相关蛋白1(pathogenesis-relatedprotein1；pr-1)之胜肽可调节植物免疫反应对抗生物性威胁，如病原体感染，其含有一横跨许多植物物种之保留之11个胺基酸之讯息胜肽模体(pxgnxxxxxpy)(seqidno:1)。发现具此模体之胜肽可作为植物防御讯息胜肽，其于施加至植物时，可藉增加免疫反应如产生h2o2或植物激素或活化一或多种抗虫害或抗病原体基因而增加植物防御活性。亦发现cnyx模体为内源性蛋白酶辨识的重要序列，以切割一前驱物(如全长之pr-1)，产生具活性之植物防御讯息胜肽。因此，具15个胺基酸模体之胜肽(cnyxpxgnxxxxxpy)(seqidno:28)亦可施加至植物，其中经由内源性蛋白酶之特定切割，可产生一植物防御讯息胜肽(具pxgnxxxxxpy模体，seqidno:1)。此外，以具cnyx模体(seqidno:55)但缺乏11个胺基酸讯息胜肽模体(pxgnxxxxxpy)(seqidno:1)之胜肽作为负调节子，以向下调节植物防御活性。因此，于一态样，本发明提供一经分离之植物防御讯息多胜肽，其包含如seqidno:1所示之11个胺基酸模体(pxgnxxxxxpy)。于一些具体实施例中，本发明之植物防御讯息多胜肽系选自于由seqidno:2-27组成之群组。本发明亦提供一经分离之植物防御讯息多胜肽，其包含如seqidno:28所示之15个胺基酸模体(cnyxpxgnxxxxxpy)。于一些具体实施例中，本发明之植物防御讯息多胜肽系选自于由seqidno:29-54组成之群组。于另一态样，本发明系有关一组合物，其包含一本文所述之植物防御讯息多胜肽。于又另一态样，本发明系有关一处理植物以增加植物防御活性之方法，包含施加该植物一植物防御讯息多胜肽或一含本文所述之植物防御讯息多胜肽之组合物。于一些具体实施例中，防御活性包括抗虫害或抗病原体反应，例如，产生过氧化氢(h2o2)、产生植物激素，如茉莉酸酯(jasmonate；ja)，ja共轭结合胺基酸异白胺酸(ja-ile)或水杨酸(sa)、或表现抗虫害或抗病原体蛋白，如蛋白酶抑制剂1(pi-1)、蛋白酶抑制剂2(pi-2)、病原相关蛋白1b(pr-1b，cape1前驱物基因)、β-1,3-聚葡萄糖酶(pr-2)、cys蛋白酶(pr-7)、第二类几丁质酶(chi2；1)、乙烯反应因子5(erf5)、或avrpto依赖型pto作用蛋白3(avrpto-dependentpto-interactingprotein3；adi3)。于一些具体实施例中，防御活性不仅存在于局部经处理之位点，还存在于整体未经处理之叶部，例如，产生植物激素、水杨酸(sa)、或表现抗病原体蛋白，如病原相关蛋白1b(pr-1b，cape1前驱物基因)、及乙烯反应因子5(erf5)。于一些具体实施例中，cnyx为蛋白酶抑制剂设计之核心结构，以用于防止蛋白酶作用减少防御活性。于一些具体实施例中，可施加本发明方法之植物包括单子叶植物(monocotyledon)及双子叶植物(dicotyledon)。单子叶植物之实例包括但不局限于，米、麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、竹子、甘蔗、洋葱、韭菜、及姜。双子叶植物之实例包括但不局限于，阿拉伯芥(arabidopsisthaliana)、茄子、烟草植物、辣椒、西红柿、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗、菠菜、甜菜、马铃薯、芹菜、胡萝卜、水芹、香菜、中国白菜、白菜、萝卜、西瓜、冬瓜、黄瓜、南瓜、丝瓜、草莓、大豆、绿豆、芸豆、及豌豆。于一些具体实施例中，植物防御讯息多胜肽系以浓度约50nm或以上、100nm或以上、150nm或以上、200nm或以上、或250nm或以上存在于组合物。于一些具体实施例中，在组合物喷洒至植物后，植物防御反应可于2小时内诱发并持续24小时以上。于一些具体实施例中，本发明之防御讯息多胜肽可结合盐类处理而施加，以增进抗病原体活性。因此，亦提供一结合物，包含本文所述之防御讯息多胜肽及盐类，且除了施加本文所述之植物以外，本文所述之本发明方法可进一步包含以盐类处理植物。于特定具体实施例中，防御讯息多胜肽系混合适量之盐，且混合物(以溶液或粉末形式)系施加至植物，如藉喷洒或浸入方式。盐之特定实例为nacl，其浓度约25mm或以上、50mm或以上、100mm或以上、150mm或以上。于一进一步态样，本发明系有关一向下调节植物防御活性之方法，包含处理植物一胜肽，其具cnyx模体但缺乏11个胺基酸讯息胜肽模体(pxgnxxxxxpy)，其量可有效减少或抑制一蛋白酶切割前驱物胜肽(如cnyxpxgnxxxxxpy或全长之pr-1)之酵素活性，以产生具上述11个胺基酸模体之pxgnxxxxxpy之植物防御讯息胜肽。本发明之一或多个具体实施例之细节系阐述如下。本发明之其他特征或优势将因下列数个具体实施例及所附申请专利范围之详尽说明而显见。附图说明前述
发明内容及下列实施方式，将因结合附图而能更佳理解。就说明本发明之目的而言，所示之图示具体实施例系较佳之呈现。然而，应理解到，本发明未局限于所示之精准安排及手段。下列图示中：图1显示内源性cape1等同度之验证及由损伤与损伤加上meja引发之表现量。未损伤(uw)、机械性损伤(mw)、及损伤加上meja(w)处理之蕃茄内源性cape1表现量之lc-srm-ms定量分析。数据代表三生物样本之平均值与sd。根据student’st检定，uw、mw、及w样本间之统计上显著差异系以***(p<0.001)表示。图2显示cape1生物活性引发叶组织h2o2产生之研究。蕃茄落叶系分别以水(对照组)、机械损伤(mw)、1.25mmmeja、250nm系统素、及250nmcape1胜肽处理4小时。于处理后，施加1mg/ml之二胺基联苯胺(diaminobenzidine；dab)以观察h2o2累积。实验系以三生物重复数表示，以确认取得类似结果。图3显示喷洒cape1所诱发之蕃茄植物抗病原体及抗虫害防御基因。定量抗虫害及抗病原体防御基因之相对表现量，系藉比较未经处理植物及以水或250nmcape1处理4、8、及24小时(各时间点之n＝5)植物之表现量。以内部对照组ef-1α进行标准化。根据student’st检定，以cape1及水处理之样本间之所有统计上显著差异系以*(p<0.05)、**(p<0.01)、或***(p<0.001)表示。图4显示喷洒cape1所诱发之蕃茄植物抗虫害及抗病原体防御反应。(a)喂养水或250nmcape1处理之蕃茄叶后之幼虫大小(larvalsizes)变化。每天记录三十只幼虫之幼虫重(larvalweights)。(b)植物之pstdc3000感染表型，其系于病原体接种前预喷洒水或100nmcape1胜肽2小时(n＝3)。细菌数，其以每克叶组织之菌落形成单位对数值(logcfu)表示，代表三生物样本之平均值及sd。根据student’st检定，cape1及水处理之样本间之所有统计上显著差异系以*(p<0.05)或***(p<0.001)表示。图5显示经切割之植物以cape1及系统素诱发茉莉酸酯激素累积。cape1及系统素诱发之ja及ja-ile浓度。植物以10mm磷酸盐缓冲液(buffer)、365nm系统素(sys)、或含365nmcape1之缓冲液处理2及4小时，其系经由切开之茎进行(n＝3)。以lc-srm-ms量化ja及ja-ile之量，并根据掺入标准品h2ja之含量计算。数据代表三独立生物重复数之平均值及sd。根据student’st检定，相较于相应之以水(或缓冲液)处理之样本，统计上显著差异系以**(p<0.01)或***(p<0.001)表示。图6显示蕃茄以cape1及flg22诱发之sa累积、抗病原体基因、及反应。(a)cape1及flg22诱发之sa量。经切割之植物以10mm磷酸盐缓冲液(buffer)或含365nmcape1或365nmflg22之缓冲液处理8小时，其系经由切开之茎进行(n＝3)。以lc-srm-ms量化sa之量，并根据掺入sa同位素标准品(d6-sa)之含量计算。(b)量化wrky53与pr-1b之相对表现，系比较未经处理之落叶与经水、250nmcape1、或250nmflg22处理2小时之落叶(n＝4)。以内部对照组ubi3进行标准化。(c)植物之pstdc3000感染表型于病原体接种前预喷洒水、100nmcape1、或100nmflg22胜肽2小时(n＝3)。于接种后4天观察感染症状。于接种后4天计算细菌数，并以每克叶组织之菌落形成单位对数值(logcfu)表示。数据代表三生物样本之平均值及sd。根据student’st检定，相较于相应之以水(或缓冲液)处理之样本，统计上显著差异系以**(p<0.01)或***(p<0.001)表示。图7显示cape1可驱动蕃茄之整体免疫反应。将植物分为局部叶及整体叶，整体叶以塑料袋覆盖以阻隔处理，且局部叶以水或250nmcape1处理24小时。(a)cape1可诱发局部及整体蕃茄叶之sa量。sa量系以lc-srm-ms量化，并以掺入之标准品d6sa之含量计算。(b)藉比较未处理之叶及以水、250nmcape1处理24小时之叶而量化erf5及pr-1b之相对表现。以内部对照组ubi3进行标准化。图8显示多样性品种基于蕃茄cape1之保留性cape序列及原蛋白质(proproteins)之鉴定。(a)cape1原蛋白质(蕃茄pr-1b)(seqidno:57)之序列及经分类之模体。(b)十七个选定之cape原蛋白质之种系分析，该原蛋白质系由mega5.2产生，其系使用最大近似法(maximumlikelihoodmethod)并根据惠兰及高盛模型(whelanandgoldmanmodel)。自举值(bootstrapvalues)设定为1,000个重复数。(c)以weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)产生30个cape1同系物之序列标识及标志图。sp：讯息胜肽；cap结构域：富含半胱胺酸之分泌蛋白、抗原5、及病原相关1蛋白结构域。图9显示阿拉伯芥cape同系物之鉴定及atcape1(seqidno:19)及atcape9之抗病原体活性。(a)源自阿拉伯芥cap蛋白之推定之atcape胜肽，其含有保留之切割(cnyx)(seqidno:55)及讯息胜肽(pxgnxxxxxpy)模体(seqidno:28)。根据其等同度，cape之最高等同度系源自at4g33730，称作atcape1；cape之最低等同度系源自at2g14610(pr1)，称作atcape9。红色字母代表相较于solcape1之不同胺基酸。(b)植物于病原体接种前以水、100nmatcape1、atcape9、或100nmflg22胜肽预喷洒2小时之pstdc3000感染表型(n＝3)。于接种4天后观察感染症状。于接种4天后计算细菌数，并以每克叶组织之菌落形成单位对数值(logcfu)表示。数据代表三生物样本之平均值及sd。根据student’st检定，相较于相应之水处理样本之统计上显著差异系以**(p<0.01)或***(p<0.001)表示。图10显示盐类可诱发阿拉伯芥atcape1产生。(a)前驱物proatcape1之产生，且cape1oxcnyd于无(-)或有不同nacl浓度24小时之下，由proatcape1切割成atcape1胜肽。推定之cape系以红色显示。数字代表以eyfp标记之前驱物蛋白(45.7kda)及以eyfp标记之经切割前驱物(26.3kda)之预期分子量。(b)以指定时间内生长于有(+)及无(-)125mmnacl之含atcape1-eyfp融合体之转基因株(cape1oxcnyd)蛋白质萃取物进行西方墨点分析。上方及下方系约略45.7kda及26.3kda大小之层带，其分别代表proatcape1-eyfp融合蛋白及atcape1-eyfp融合蛋白之预期大小。以gfp抗体检测融合蛋白。α-微管蛋白，填载对照品。(c)芽及根之内源性atcape1相对量。以无(1/2ms)及有125mmnacl生长24小时之种苗进行之lc-ms/ms量化分析。is：内标准品。结果系显示二生物重复数之平均值。误差杠，平均值±se。星号代表盐类处理及未处理样本间之统计上显著差异(student’st检定；**p≤0.01)。图11显示盐类处理可诱发atcapes以增进阿拉伯芥之植物免疫反应。以50mmnacl处理5天大之阿拉伯芥种苗24小时，接着以或不以250nmatcape1处理6小时。于pstdc3000接种4天后观察感染症状。于接种7天后计算细菌数，并以每克叶组织之菌落形成单位对数值(logcfu)表示。数据代表三生物样本之平均值及sd。图12显示前驱物proatcape1之产生，及cape1oxcnyd与cape1oxcnad转基因植物之经切割之proatcape1，其中eyfp系分别融合至含野生型(cnyd，seqidno:61)及突变型(cnad，seqidno:62)连接序列之proatcape1。取样个别转基因株之t3种苗，并以gfp抗体进行西方墨点法。以考马斯蓝(coomassieblue)染色作为蛋白质填载控制。图13显示表现于蕃茄之pr-1b抑制性防御基因之切割模体(cnyx.)。蕃茄叶以107cfu/mlpstdc3000hrcc-或缓冲液处理2小时后进行qrt-pcr，分析pr-1b及wrky53之相对表现量，该蕃茄叶系分别以水、100nmcape1、或1μmcnydpv预先处理2小时。具体实施方式除非另有定义，本文所使用的所有技术性及科学性术语具有本发明领域之技术人员所能常规理解之意义。除非另有指明，本文所使用的单数形式「一」、「一者」、及「该」包括复数参考体。因此，举例而言，参考「一组分」包括复数个本领域技术人员习知之此类组分及其等同物。「包含」或「含有」等词一般而言用于代表包括/涵盖，意指容许存在一或多个特征、成分、或组分。「包含」或「含有」等词涵盖「组成自」或「由～组成」。本文所使用的「多胜肽」及「胜肽」等词可互换使用。本文所使用的「防御讯息胜肽/多胜肽」乙词是指约10个或以上胺基酸残基长度之胜肽或多胜肽，其实质上具防御讯息胜肽活性，如活化抗虫害或抗病原体基因，或诱发植物激素以增进免疫活性。较佳地，本文所述之防御讯息胜肽或多胜肽包括至多约150个胺基酸残基、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或40、或30、或20、或15个胺基酸残基。本研究系开发以ms为主之胜肽体学(peptidomics)，其以一假想胜肽数据库结合标靶诱饵搜寻策略(target-decoysearchstrategy)及差异数据库相符评分(differentialdatabasematchscoring)，以探索防御讯息胜肽。此平台之验证系藉鉴定损伤加上甲基茉莉酸酯(meja)处理之蕃茄(solanumlycopersicum)所诱发之防御胜肽。利用此平台，数种胜肽包括系统素，系经鉴定及量化为损伤加上meja诱发型。仅损伤或损伤加上meja诱发之胜肽之一者发现可活化免疫讯息以防御生物性威胁。据此，本发明提供一种分离之胜肽，其具如seqidno:1(pxgnxxxxxpy)所示之保留模体，其可作为防御讯息胜肽。本发明亦提供一种分离之胜肽，其具如seqidno:28(cnyxpxgnxxxxxpy)所示之保留模体，其亦可应用于植物，其中可发生藉蛋白水解酶之专一性切割，使得产生具seqidno:1之防御讯息胜肽，以提供植物所需之防御活性。参见表1。表1模体seqinnopxgnxxxxxpy1cnyxpxgnxxxxxpy28于一些具体实施例中，本文所述之植物防御讯息胜肽系选自于由seqidno:2-27或seqidno:29-54组成之群组。参见表2。表2本文所述之植物防御讯息胜肽可藉化学合成方法制造，其系使用蛋白质化学领域习知之技术，如固相合成或于均质液中和成。或者，本发明之胜肽可以重组技术制备。于此方面，系提供含编码本发明多胜肽之核苷酸序列之重组型核酸及含此重组型核酸之宿主细胞。宿主细胞可于适当条件下培养，以表现感兴趣之多胜肽。多胜肽之表现可为组成性(constitutive)，使其持续产生或诱发，其需要刺激以启动表现。于诱发表现情况下，当例如需加入诱导剂物质如异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside；iptg)或甲醇至培养基时，可启动蛋白质产生。可从宿主细胞回收及纯化多胜肽，系藉本领域习知之许多技术，例如层析法，如hplc或亲合性管柱。于一些具体实施例中，本发明之胜肽若实质上无细胞材料或化学前驱物或其他涉及胜肽制程之化学物质，则可称作「经分离」或「经纯化」。可理解的是，「经分离」或「经纯化」等词未必反映出胜肽「绝对地」经分离或经纯化之程度，例如藉移除所有其他物质(如杂质或细胞组分)之方式。于一些情况下，举例而言，经分离或经纯化之胜肽包括一含胜肽之制备物，其具小于50％、40％、30％、20％、或10％(重量)之其他蛋白质(如细胞蛋白质)、具小于50％、40％、30％、20％、或10％(体积)之培养基、或具小于50％、40％、30％、20％、或10％(重量)之化学前驱物或其他涉及合成程序之化学物质。使用时，本发明之防御讯息胜肽可与农业上可接受之载体混合以形成农业组合物，其系施加于有需求之植物。农业上可接受之载体之实例包括但不局限于，水、酒精、矿物质、或植物油、碳酸钙、滑石、粉末氧化镁、石膏及硅藻土。农业组合物之形式可为乳剂、液体、油、水溶性粉剂、湿性粉剂、流动剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、气雾剂、熏蒸剂(fumigants)、糊剂、及其类似物。根据本发明，本发明之防御讯息胜肽或含其之组合物可施加至植物，以增加植物防御活性。其有效诱发整体免疫反应，以加强防御生物性威胁。具体而言，相较于未施加本发明之防御讯息胜肽或含其之组合物之对照组植物，施加本发明之防御讯息胜肽或含其之组合物之植物呈现增强之防御活性。于特定具体实施例中，本文所述之防御活性包括产生过氧化氢(h2o2)、产生植物激素，如茉莉酸酯(jasmonate；ja)，ja共轭结合胺基酸异白胺酸(ja-ile)或水杨酸(sa)、或表现抗虫害或抗病原体蛋白，如蛋白酶抑制剂1(pi-1)、蛋白酶抑制剂2(pi-2)、病原相关蛋白1b(pr-1b，cape1前驱物基因)、β-1,3-聚葡萄糖酶(pr-2)、cys蛋白酶(pr-7)、第二类几丁质酶(chi2；1)、乙烯反应因子5(erf5)、或avrpto依赖型pto作用蛋白3(avrpto-dependentpto-interactingprotein3；adi3)。参见图3。特别的是，本发明适于增加植物抗性以对抗各种病原体，包括但不局限于，细菌、昆虫、线虫、真菌、及其类似物。于特定具体实施例中，相较于喂食预先处理水之植物叶之对照组昆虫幼虫，喂食预先处理本发明防御讯息胜肽之植物叶之昆虫幼虫体型减少约20％。参见图4(a)。于特定具体实施例中，相较于未施加本发明防御讯息胜肽之对照组植物，于细菌接种后，预先喷洒本发明防御讯息胜肽之植物呈现降低之感染症状及减少之每一鲜重(perfreshweight)细菌数。参见图4(b)。本发明之防御讯息胜肽系施加至多种植物物种。本发明方法可施加之植物包括单子叶植物与双子叶植物两者。单子叶植物之实例包括但不局限于，稻米、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、竹子、甘蔗、洋葱、韭菜、及姜。双子叶植物之实例包括但不局限于，阿拉伯芥、茄子、烟草植物、红辣椒、蕃茄、牛蒡、茼蒿、生菜、桔梗、菠菜、甜菜、马铃薯、芹菜、胡萝卜、水芹菜、香菜、中国白菜、白菜、萝卜、西瓜、冬瓜、黄瓜、南瓜、丝瓜、草莓、大豆、绿豆、芸豆、及豌豆。于一些具体实施例中，本文所述之防御讯息胜肽系以约50nm或以上、100nm或以上、150nm或以上、200nm或以上、或250nm或以上之浓度含于组合物中。于一些具体实施例中，含有本文所述防御讯息胜肽之组合物系喷洒至有需求之植物1分钟或以上，且防御反应可于2小时内诱发并维持超过24小时。据此，本发明中以本文所述防御讯息胜肽处理植物以增加植物防御活性之方法提供多个优势，至少包括：(1)其有效诱发植物整体免疫反应以防御多种生物性威胁；(2)其系藉简单地施加本发明防御讯息胜肽至有需求之植物之方式进行；(3)低剂量之本发明防御讯息胜肽即足够；(4)本发明之防御讯息胜肽长度短且可易于藉化学合成制造；以及(5)毋须转基因技术或农化品，其可能导致环境问题。于一些具体实施例中，太强的植物防御活性并非优选的情形，原因是可能降低生长。因此，需要适当调节防御活性。于本发明中，发现cnyx(seqidno:55)为设计蛋白酶抑制剂之核心结构，以预防进程(processing)及减少防御活性。因此，具cnyx模体(seqidno:55)但缺乏提供指定活性之活化型pxgnxxxxxpy模体(seqidno:1)之胜肽可作为蛋白酶抑制剂/竞争剂，以减少或抑制内源性蛋白酶切割前驱物胜肽并产生活化型防御讯息胜肽pxgnxxxxxpy(seqidno:1)之活性，从而调节植物防御活性。据此，本发明系有关向下调节植物防御活性之方法，包含处理植物一具cnyx模体(seqidno:54)但缺少11个胺基酸讯息胜肽模体(pxgnxxxxxpy)(seqidno:1)之胜肽，其用量能有效地减少或抑制酵素切割前驱物胜肽(如cnyxpxgnxxxxxpy(seqidno:15)或全长之pr-1)之活性，以产生前述之植物防御讯息胜肽pxgnxxxxxpy(seqidno:1)。于一些具体实施例中，作为本发明蛋白酶抑制剂之胜肽，其较佳地具至多约50个胺基酸残基、或40个、或30个、或20个、或15个、或10个胺基酸残基，例如，至少4个胺基酸残基，具体而言，5、6、7、8、9、或10个胺基酸残基。于一具体实例中，seqidno:55(cnydpv)可作为本发明蛋白酶抑制剂之胜肽。本发明进一步以下列实例阐述，其提供之目的在于证实而非局限。鉴于本发明之揭露，本领域之技术人员应理解到，于特定具体实施例中进行许多改变，其系经揭露且仍可获得相同或类似结果，而不背离本发明之精神及范畴。实施例多细胞生物体之许多重要细胞间通讯事件系由胜肽介导，但仅少数胜肽于植物中发现。为了解决鉴定植物讯息胜肽之困难，发明人开发一新颖之胜肽体学方法，并以此方法找寻植物防御讯息胜肽。除了典型之胜肽系统素以外，确信于蕃茄(solanumlycopersicum)鉴定出数个新颖胜肽，经量化为损伤及meja诱发型。衍生自病原相关蛋白1(pr-1)家族之损伤或损伤加上meja诱发型胜肽，发现于蕃茄诱发显著抗病原体及轻微抗虫害反应。此研究凸显pr-1于免疫讯息之角色，并提出植物内源性胜肽之潜在应用，系致力于防御作物生产之生物性威胁。由于pr-1于多个生物体中高度保留，且at-pr1之推定胜肽亦发现于阿拉伯芥中具生物活性，发明人之结果指出，此胜肽可用于增进其他植物物种之抗压性。1.材料及方法1.1化学品、酵素、及材料三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(tcep)、甲基甲烷硫基磺酸盐(mmts)、3,3-二胺基联苯胺(dab)、氢氧化钾(koh)、氢氧化钠(naoh)、氯化氢(hcl)、10xmurashige与skoog(ms)基础盐类微营养混合物、金氏琼脂b(kingagarb)培养基、异丙醇、乙醇、氯仿、甲基茉莉酸酯(meja，95％溶液)、tritonx-100、β-酪蛋白、水杨酸(sa)、2-羟基苯甲酸-[2h6](d6-sa)、及茉莉酸(ja)系购自sigma-aldrich(st.louis，mo)。二氢茉莉酸(h2ja)系购自olchemim(olomouc，czechrepublic)。分析级甲醇、乙腈(acn)、及三氟乙酸(tfa)系购自merck(darmstadt，germany)。lc-ms级can伴随0.1％甲酸(fa)系购自j.t.baker(phillipsburg，nj)。整个作业中使用milli-q系统(millipore，bedford，ma)之去离子水(18.1mω·cm电阻率)。c18ziptip及millexha0.45μm滤膜系购自millipore(billerica，ma)。tripurernaisolationreagent及faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)kit系购自roche(indianapolis，in)。rna纯化试剂rnamate系购自biochain(hayward，ca)。superscriptiiireversetranscriptasekit系购自invitrogen(carlsbad，ca)。fast‐runhotstartpcrmix系购自postech(taipei，taiwan)。miracloth系购自calbiochem(lajolla，ca)。客制之sep-pakc18匣60cc(20g)系购自waters(wexford，ireland)。凝胶过滤xk16/40管柱及填充凝胶(sephadexg-25fine)系购自gehealthcarebio-sciencesab(uppsala，sweden)。胰蛋白酶性烯醇酶(trypticenolase)及[glu1]-纤维蛋白胜肽(gfp)系购自waters(milford，ma)。胰蛋白酶(经修饰，定序级)系购自promega(madison，wi)。系统素(avqskppskrdppkmqtd，seqidno:58)、cape1(pvgnwigqrpy，seqidno:2)、atcape1(pagnyigarpy，seqidno:19)atcape9(prgnyvnekpy，seqidno:27)、切割模体(cnydpv，seqidno:56)、及内标准品(paaayigaray，seqidno:59)系由yao-hongbiotechnology(taipei，taiwan)合成且纯化至>95％纯度。纯度>95％之flg22(qrlstgsrinsakddaaglqia，seqidno:60)系购自karebaybiochem,inc.(monmouthjunction，nj)。合成胜肽之纯度系进一步以nanouhplc-ms检查其大于95％。1.2植物材料及生长条件蕃茄(solanumlycopersicumcv.cl5915)种子系由avrdc–theworldvegetablecenter(tainan，taiwan)提供。蕃茄植物系维持在白天25℃/夜晚20℃之温度，并使用12小时照光/12小时黑暗之光周期。蕃茄种子系于土壤中发芽，并于生长箱中生长2周。在检测内源性胜肽方面，将2周大植物转移且维持在人工气候室内6周。用于胜肽处理之蕃茄植物系持续生长于生长箱中5周。欲检查阿拉伯芥之胜肽活性，阿拉伯芥(哥伦比亚生态型(ecotypecolumbia))种子系于土壤中发芽，并生长于白天22℃/夜晚20℃温度之生长箱中4周，其系8小时照光/16小时黑暗之光周期。在盐类处理方面，种子以30％漂白剂(clorox)表面除菌8分钟，接着以除菌之ddh2o清洗五次。种子系于半量之murashige与skoog(1/2ms)培养基中发芽，其系22℃下之16小时光周期(80-100μmolm-2s-1照度)。1.3植物处理欲萃取伤口诱发型胜肽，蕃茄植物以剪刀剪穿叶肉表面产生机械性伤口，并以含1.25mmmeja之0.1％tritonx-100溶液喷洒15小时(pearce等人，2001a)。在直接量化蕃茄之cape1方面，以未损伤、损伤、或损伤加上meja处理各15小时之植物研究胜肽诱发。欲以cdna微数组分析经检验胜肽之可能功能，将蕃茄落叶分别浸入水或含250nmcape1之水溶液中1、2、4、及8小时。欲确认胜肽诱发之基因表现，以250nmcape1或水喷洒0、4、8、及24小时后，收集蕃茄植物。欲比较不同处理所诱发之ros，以水(对照组)、机械性损伤(mw)、1.25mmmeja、250nm系统素、或250nmcape1处理蕃茄落叶4小时。欲测试胜肽诱发之抗虫害活性，于喂养昆虫前，以250nmcape1或水喷洒24小时，之后收集蕃茄植物。欲比较胜肽诱发之pi基因，将蕃茄落叶浸入250nmcape1、250nm系统素、或水中1、2、及4小时。欲比较胜肽诱发之茉莉酸酯，以10mm磷酸盐缓冲液、365nm系统素、或含365nmcape1之缓冲液处理经切割之蕃茄植物2及4小时，其系通过切开之茎进行(schaller等人，1995；howe等人，1996)。欲比较胜肽诱发之水杨酸，以10mm磷酸盐缓冲液、365nmflg22、或含365nmcape1之缓冲液处理蕃茄植物8小时，其系通过经切割之植物所切开之茎进行。欲比较胜肽诱发之wrky53及pr-1b基因，将蕃茄落叶浸入250nmcape1、250nmflg22、或水中2小时。欲测试胜肽诱发之抗病原体活性，于处理病原体前，三组蕃茄植物以100nmcape1、100nmflg22、或水喷洒2小时。欲测试胜肽于阿拉伯芥所诱发之抗病原体活性，于处理病原体前，植物分别以100nmatcape1、atcape9、100nmflg22、或水喷洒2小时。阿拉伯芥种苗以50mmnacl处理24小时，并于盐类处理后以或不以250nmatcape1或atcape9处理6小时。欲测试经切割之模体为蛋白酶抑制剂，于病原体处理前，蕃茄植物以1μmcnydpv喷洒2小时。1.4蕃茄及阿拉伯芥之内源性胜肽萃取收集未损伤及损伤加上meja处理之蕃茄叶，并分别于液态氮存在下以掺合机(waringcommercial，newhartford，ny)研磨成粉末。将冷冻之叶粉(150g)溶于200ml之1％tfa，并以掺合机均质化2分钟成叶汁。将叶汁通过四层棉布及一层miracloth过滤。经过滤之叶汁随即于4℃下以10,000×g离心20分钟。上清液以10nnaoh调至ph4.5，并于4℃下以10,000×g离心20分钟。接着，上清液以tfa再调至ph2.5，并于纯化前将150μg之胰蛋白酶性β-酪蛋白胜肽加入上清液以作为胜肽量之内部对照品。欲避免胰蛋白酶残余物与内源性蛋白质或胜肽反应，胰蛋白酶性β-酪蛋白胜肽系藉tfa酸化，并以c18ziptip纯化。在以sep-pak匣纯化上清液前，固定相首先以60ml0.1％tfa平衡。将上清液装载至sep-pak匣、以120ml0.1％tfa清洗、及以200ml之含60％甲醇之0.1％tfa冲提。将冲提液真空蒸发以移除甲醇，其系首先使用真空离心浓缩仪(mivacduoconcentrator，genevac，gardiner，ny)，接着以冻干机(eyela，miyagi，japan)干燥(pearce等人，1991)。欲以数据依赖型采集(datadependentacquisition；dda)模式操作之lc-ms分析总内源性胜肽，将冻干之粗萃取物溶于1ml之0.1％tfa、于4℃下以10,000×g离心10分钟、及通过millexha0.45μm滤膜过滤，而后分离胜肽。在胜肽分离方面，将过滤之胜肽萃取物注射至sephadexg-25管柱，并以1ml/min之0.1％tfa冲提，伴随1个分液/分钟之方式收集。由22-31分钟之冲提时间可收集10个分液，并以真空离心浓缩仪蒸发至干燥。各分液系藉c18ziptip纯化以进行lc-ms/ms分析。在以选择型反应监测(selectedreactionmonitoring；srm)模式操作之lc-ms分析标靶胜肽方面，从未损伤、仅损伤、及损伤加上meja处理之蕃茄叶萃取内源性胜肽，其系使用相同程序但无凝胶过滤分离。将10天大之培养于1/2ms培养基上之垂直生长之阿拉伯芥种苗移至无蔗糖之1/2ms液态培养基，以进行水耕系统培养。每4天更换培养基。种植后3周，收取植物组织。在盐类处理方面，交换存在或不存在125mmnacl之新鲜1/2ms培养基，且该处理延长至24小时。样本于掺合机中以200ml之1％(v/v)冷却之三氟乙酸(tfa；sigma-aldrich)均质化2分钟。欲标准化样本制备之变异，且为了液相层析术-串联质谱(lc-ms/ms)分析之更佳量化准确性，于分离粗胜肽时，将20μl之1pmoleμl–1内标准品(合成胜肽：paaayigaray，seqidno:59)加入萃取缓冲液，其中该标准品具atcape1之二个胺基酸取代位置g3a及n4a。萃取物随即通过四层miracloth(calbiochem，sandiego，ca，usa)过滤，以移除植物碎屑。该程序遵照前述之步骤(pearce等人，2001a,b)。于4℃下以8500rpm离心20min后(beckmancoulter，avantij-26xp)，将上清液ph值调整至4.5。萃取物随即于4℃下以8500rpm再次离心20min，并将上清液ph值调整至2.5。接着，将上清液结合于客制之sep-pakc18固相萃取匣(waters，milford，ma，usa)，其系根据下列步骤：c18匣首先以0.1％(v/v)tfa调整、结合于上清液，接着以0.1％(v/v)tfa清洗。最后，多胜肽系以60％(v/v)甲醇/0.1％(v/v)tfa冲提。于高度真空下，以回旋蒸发方式将最终溶析物中之胜肽蒸发至干燥，并将团块再悬浮于0.1％(v/v)tfa。多胜肽系进一步藉快速蛋白质液相层析术(purifier)分液，以粒径排除管柱移除蛋白质污染物(superdexpeptide10/300gl；gehealthcare，littlechalfont，uk)。将含多胜肽或具类似于atcape1大小之少量蛋白质之分液收集且合并。合并之溶析物系于高度真空下回旋蒸发并再悬浮于0.1％(v/v)tfa，以供ziptip(millipore，billerica，ma，usa)移除盐类污染。在最终蒸发及再悬浮于0.1％(v/v)甲酸(fluka)后，进行标靶lc-ms/ms分析。标靶lc-ms/ms分析。1.5以lc-ms/ms剖析内源性胜肽在内源性胜肽分析方面，进行lc-ms/ms分析，其系以nanouhplc系统(nanoacquityuplc，waters，millford，ma)联机至混合型四极飞行时间质谱仪之奈米电撒源(synapthdmsg1，waters，manchester，uk)。synapthdmsg1仪器系以阳离子模式及dda法操作，以检测内源性胜肽。将样本装载至填充20mm之5μmsymmetryc18颗粒之180μm×50mm隧道熔块捕获管柱(tunnelfrittrapcolumn)(waters，millford，ma)，并联机以填充250mm之1.7μmbehc18颗粒(waters，millford，ma)之75μm×250mm隧道熔块分析管柱分离，其系使用95分钟之300nl/min梯度流速及5-90％acn/0.1％fa比例(chen等人，2012)。当检测到前驱物离子电荷为2+、3+、及4+且强度大于20计数时，将dda撷取参数设定为一次全ms扫描(m/z400-1600)，其中扫描时间为0.6秒钟，并转换成三次产物离子扫描(m/z100-1990)，其中扫描时间为1.2秒钟。由synapthdmsg1产生之数据系首先以masswolf(version4.3.1)转换成mzxml格式(pedrioli等人，2004)，之后藉由uniqua以synapthdmsg1之预设参数处理(chang等人，2013)。将uniqua处理之波谱转换成mascot通用模式(.mgf)，其系使用transproteomicspipeline(tpp)版本4.4修订版1之mzxml2search(pedrioli，2010)。在检测阿拉伯芥cape1方面，以耦接在线毛细管nanouhplc系统(waters)之ltqvelospro质谱仪(thermoscientific，waltham，ma，usa)用于胜肽鉴定及定量。以配备自制c18阱匣(5μm颗粒，symmetryc18；waters)及自制c18逆相分析管柱(1.7μm颗粒，beh130c18；waters)(chen等人，2012)之毛细管lc系统用于传输溶剂及标靶胜肽，其中线性梯度为历时95分钟之8至90％(v/v)之溶于0.1％(v/v)甲酸之乙腈之奈米流速(约300nlmin–1)。分析管柱系耦接至奈米电洒离子化源，且数据撷取系以全ms扫描进行，接着为标靶前驱物离子之ms/ms扫描。选择atcape1(pagnyigarpy(seqidno:19)；m/z589.8)及内标准品(paaayigaray(seqidno:59)；m/z562.4)之前驱物离子进行后续之标靶ms/ms扫描。以碎片离子m/z563.2、676.3、及900.5，以及m/z537.2、650.3、及813.34进行atcape1及内标准品之进一步个别鉴定及定量。1.6假设及诱饵(decoy)数据库蕃茄假设性胜肽数据库(tomht数据库)之组成系取自internationaltomatoannotationgroup(itag)蛋白质数据库(发行版2.3，总蛋白质项目＝34,728)之所有蛋白质c端序列之50个残基，并加上胎牛β-酪蛋白序列。随机数据库(randatabases)系藉将标靶数据库之序列洗牌产生，其系使用matrixscience(london，uk)提供之perlscript(decoy.pl)。1.7内源性胜肽鉴定及定量经处理之mgf档案系进行tomht数据库搜寻，而不以mascotms/ms离子搜寻(matrixscience，服务器版本2.3)指定酵素切割规则。胜肽前驱物及片段之ms/ms离子搜寻之质量偏差值为±0.1da。以随机数据库之mascot搜寻结果评估随机匹配胜肽之截止值评分。1.8植物激素萃取于胜肽处理后，从叶组织萃取代谢物以量化植物激素。萃取程序系由先前公开之步骤修改(pan等人，2010)。叶组织(约0.6g鲜重)系于液态氮存在下磨成粉末，并移至50ml螺旋盖管。将冷冻之叶粉末溶于6ml萃取溶剂，并加入d6-sa(3ng至0.6g叶组织)及h2ja(15ng至0.6g叶组织)以作为内标准品。样本于4℃下以100rpm之速度摇晃30分钟萃取，之后各样本加入12ml二氯甲烷并于4℃下以100rpm摇晃30分钟。样本系于4℃下以13,000×g离心5分钟，并形成二相。将下层相小心地移至新试管，并以真空离心浓缩仪蒸发约1小时至干燥。将干燥之样本溶于300μl甲醇、良好地混合、及于4℃下以10,000×g离心5分钟，之后将上清液移至样本小瓶，以利lc-ms/ms进行标靶定量分析。1.9以lc-ms/ms定量标靶胜肽及植物激素在标靶胜肽定量方面，nanouhplc法系与内源性胜肽分析方式相同，且ms(ltqvelospro，thermofisherscientific，sanjose，ca)设定为一次全ms扫描(m/z400-1600)并增加扫描速度，并切换为一次选择性反应监测(selectedreactionmonitoring；srm)扫描，其中扫描速度正常。在srm靶向cape1方面，选择双电荷cape1前驱物离子m/z(m/z643.84)进行碎裂反应(fragmentation)，并监测产物离子m/z620.34、733.37、及1090.57。藉由结合产物离子之srm尖峰面积，评估损伤及未损伤样本之cape1相对含量。在植物激素定量方面，使用线型离子阱-轨道阱质谱仪(orbitrapelite，thermofisherscientific，bremen，germany)并耦接连线uhplc系统(acquityuplc，waters，millford，ma)。植物激素系藉hsst3管柱分离(waters，millford，ma)，其使用之梯度为0.5-25％can历时0-2min、25-75％can历时2-7分钟、及75-9.5％can历时7-7.5分钟。质谱仪系以负离子模式操作，并设定一次全ft-ms扫描(m/z100-600)，其具60,000分辨率，且针对五个前驱物，切换成五次ft-ms产物离子扫描(于30,000分辨率)：m/z为137.02(针对sa)、209.12(针对ja)、322.20(针对ja-ile)、141.05(针对d6-sa解离成d4-sa)、及211.13(针对h2ja)。选择sa之137.02至93.03、ja之209.12至59.01、ja-ile之322.20至130.09、d6-sa之141.05至97.06、及h2ja之211.13至59.01等m/z碎片反应进行定量。计算ja、ja-ile、及sa对d6-sa与h2ja含量之绝对含量。1.10定量实时pcr(qrt-pcr)以定量实时pcr(qrt-pcr)验证一些特定基因之表现。以三生物样本重复数进行qrt-pcr分析。qrt-pcr系以sybrgreen试剂及abi7500realtimepcr系统(fostercity，ca)进行。pcr循环步骤为50℃历时2min且94℃历时10min以进形初始步骤，接着95℃历时15s且60℃历时1min并进行40次循环。不同样本之基因表现系以内部对照组ef-1α或ubi3进行标准化。所使用之引子列于表3。以熔化曲线验证pcr产物之特异性。表3：qrt-pcr引子1.11体内检测h2o2将3,3-二胺基联苯胺(dab)溶于1nhcl，并以naoh调整至ph3.8，其最终浓度为1mg/ml。植物于处理后，落叶系于阴暗条件下持续供应dab溶液8小时，之后以煮沸之乙醇(96％)脱色10分钟。将叶冷却至室温，并保存于新鲜乙醇中。1.12食植行为(herbivory)处理斜纹夜盗蛾(spodopteralitura)幼虫卵系取自台湾农业药物毒物试验所(taiwanagriculturalchemicalsandtoxicsubstancesresearchinstitute)(taichungcounty，taiwan)。以30只大小一致之第一龄期阶段幼虫进行抗昆虫生物试验研究。幼虫每24小时以收取自水或cape1预喷洒植物之蕃茄叶持续喂食且历时5天。每天记录所有幼虫重量，并计算幼虫重量平均值。于喂养5天后，观察幼虫大小。1.13病原体生长及感染(challenge)细菌病原体西红柿细菌性斑点菌(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000；pstdc3000)或pstdc3000hrcc-系于28℃下生长于含100mg/l利福平(rifampicin)之金氏b(king’sb；kb)琼脂培养基2天。于感染前，细菌系于28℃下培养于kb液体培养基，其中以230rpm摇晃隔夜。将细菌离心沈淀，并再悬浮于10mmmgso4，其中a600＝0.25(约108cfu/ml)。于真空下，将植物浸入含105cfu/mlpstdc3000之10mmmgso4稀释悬浮液中30秒钟，内含0.005％silwetl-77。pstdc3000或hrcc-系生长于水或胜肽处理之植物数天以观察症状，之后根据前述方法收集叶之细菌并评估细菌效价(zimmerli等人，2000)。1.14西方墨点分析将10天大之cape1oxcnyd或cape1oxcnad种苗加至培养基，其具或不具不同nacl浓度，并于不同时间点具或不具125mmnacl。收集之样本系伴随yszgrindingmedia(ee-tec，ezeag0500)于2ml微离心管中以超音波(kurabo，sh-48)碎裂。于制备期间，将样本浸入液态氮以快速冰冻。样本随即于95℃下之萃取缓冲液(50mmtris-hcl，ph7.5、150mmnacl、20mmedta、1％[w/v]sds、及10％[v/v]甘油)中均质化5分钟。以12,000rpm离心10min后，将上清液移至新的微离心管。将50微克之总蛋白质装载至10％sds-聚丙烯酰胺凝胶，并以西方墨点法分析。以gfp抗体(roche；11814460001)检测重组型proatcape1标记之eyfp，并以山葵过氧化酶键接之小鼠抗体(invitrogen；616520)作为二级抗体。欲确认总蛋白质之均等填载，随后以α-微管蛋白抗体(sigma-aldrich；t5168)探测同一墨染片。1.15登录号本文之序列数据可于internationaltomatoannotationgroup(itag)蛋白质数据库或genbank/embl数据库中发现。本文推定之阿拉伯芥cape胜肽之序列数据可于阿拉伯芥基因体计划(arabidopsisgenomeinitiative)中发现，其登录号如下：at4g33730.1、at4g25780.1、at4g33720.1、at4g25790.1、at5g57625.1、at4g30320.1、at2g14580.1(prb1)、at5g26130.1、及at2g14610.1(pr1)。2.结果2.1鉴定损伤加上meja诱发之蕃茄叶胜肽定量分析显示一新颖之胜肽及一习知之胜肽(系统素)，其显示于未损伤植物无明显表现，但在损伤加上meja处理后高度表现。新颖之胜肽系源自病原相关蛋白1b(pr-1b)，其显示类似于系统素的表现反应。由于pr-1b系归类为富含半胱胺酸之分泌型蛋白、抗原5、及病原相关1蛋白(cap)超家族(gibbs等人，2008)之成员，此胜肽系称作cap衍生型胜肽1(cape1)。在cape1鉴定方面，除了y1与b1离子以外，多数y与b片段离子可匹配至cape1序列之理论片段。利用此方法，用于整体胜肽鉴定之组织量系<150g。欲确认经匹配之序列，以ms/ms分析合成之cape1，且所得之图谱完全符合于内源性cape1。若无胜肽预片段化(pre-fractionation)，由未损伤、机械性损伤、及损伤加上meja处理之蕃茄植物萃取之总胜肽系直接以nanouhplc-srm-ms分析，其系靶向特异性cape1碰撞诱发解离(collisionalinduceddissociation；cid)反应。定量结果显示，cape1于未损伤植物中表现量低，但在损伤或损伤加上meja处理后明显诱发(图1)。2.2cape1之生物活性处理cape1可诱发蕃茄叶产生h2o2，系如dab染色之检测(图2)。藉微数组所得之诱发基因之分析结果显示，cape1可提升数个基因之表现，该基因习知涉及抗虫害及抗病原体防御反应。cape1主要诱发涉及压力反应、防御反应、先天性免疫反应、细菌防御、及系统性后天抗性(systemicacquiredresistance；sar)之基因表现。反转录定量pcr(qrt-pcr)分析可进一步确认的是，于处理cape1后可活化抗虫害基因蛋白酶抑制剂1与2(pi-1与pi-2)及病原体相关基因病原相关蛋白1b(pr-1b，cape1前驱物基因)、β-1,3-聚葡萄糖酶(pr-2)、cys蛋白酶(pr-7)、第二类几丁质酶(chi2；1)、乙烯反应因子5(erf5)、及avrpto依赖型pto作用蛋白3(adi3)(图3)。抗虫害反应系藉30只斜纹夜盗蛾之平均幼虫重量而评估，该幼虫系喂以预处理水或cape1之蕃茄叶。预先喷洒cape1之蕃茄植物可抑制幼虫生长，并减少幼虫重量约20％(图4a)。欲证实植物抗性亦可藉cape1而强化，二组蕃茄植物系以水或合成之cape1预先喷洒2小时。于处理后，二植物组进行病原体西红柿细菌性斑点菌(pstdc3000)之冲击。如图4b所示，预处理水之蕃茄植物显示严重病原体感染症状。欲比较系统素与cape1之抗虫害反应，使用切开之蕃茄植物，系因先前已使用切开之植物处理胜肽溶液以测试系统素之生物活性(schaller等人，1995；howe等人，1996)。ja及ja-ile据观察可于处理系统素2小时后明显诱发，但以cape1处理则4小时后诱发，且表现量低于系统素约4倍(图5)。其结果显示，cape1可为诱发免疫性至病原性之新颖damp讯息，其次，cape1可比拟典型之病原体/微生物相关分子模式(pathogen/microbeassociatedmolecularpattern；pamp/mamp)胜肽「flg22」(hayashi等人，2001)。如图6a所示，当供应至切开之植物时，cape1及flg22明显诱发sa。于图6b，flg22高度诱发蕃茄之wrky转录因子53(wrky53)表现而非pr-1b。此结果与蕃茄功能基因体数据库(tomatofunctionalgenomicsdatabase；tfgd)之公开rna-seq数据一致(fei等人，2011)，其系基于「处理不同细菌及pamps之蕃茄叶转录体(transcriptome)定序」(rosli等人，2013)。rna-seq数据显示，蕃茄以flg22处理30分钟或6小时后，可诱发wrky53，但无法明显诱发pr-1b、adi3、及erf5。然而，cape1无法诱发wrky53，但高度诱发其前驱物基因pr-1b。以cape1或flg22喷洒植物2小时，使其对pstdc3000感染产生抗性(图6c)。抗病原体反应，包括sa生合成及防御基因(erf5及pr-1b)表现，可藉cape1整体诱发。此数据显示，cape1为调节整个植物中不仅是局部还有整体防御反应之讯息胜肽(图7)。2.3cape1原蛋白质成熟之cape1胜肽系源自蕃茄pr-1b之c端。此原蛋白质系由n端讯息胜肽、cap结构域、及延伸之c端构成(图8a)。molecularevolutionarygeneticsanalysisversion5.2(mega5.2)之种系分析(tamura等人，2011)及pr-1b蛋白之c端比对证实，于单子叶至双子叶之不同开花植物中，完整蛋白及延伸之c端系高度保留(图8b)。有趣的是，pxgnxxxxxpy模体(seqidno:1)于cape1序列中系保留，且于切割位点前之三残基序列具保留之cnyx模体(seqidno:55)(图8c)。此显示，cnyx.pxgnxxxxxpy-(seqidno:28)可为功能性模体，其可标记其他物种之生物活性胜肽。2.4阿拉伯芥之cape胜肽欲证实源自cnyx.pxgnxxxxxpy模体(seqidno:28)之胜肽可具生物活性，选用阿拉伯芥cape同系物atcape1及atcape9。相较于solcape1，atcape1及atcape9具有最高及最低序列同源性。两胜肽皆显示增加对pstdc3000感染之免疫性(图9)。欲确认此atcape1前驱物之蛋白水解过程，发明人产生一转基因植物cape1oxcnyd，其中野生型proatcape1融合至c端强化型黄色荧光蛋白(eyfp)，其系藉35s启动子持续地过量产生。此数据显示，当于预期之切割位点发生切割时，有二层带之mws分别接近标记eyfp之前驱物蛋白(45.76kda)及atcape1融合至eyfp(26.3kda)(图10a及10b)。于阿拉伯芥，处理盐类可诱发atcape1产生，且甚而引发atcape1由根运输至芽(图10c)。处理盐类亦可增进阿拉伯芥之抗病原体活性(图11)，其可能系因盐类压力可诱发cape1产生及运输。此结果显示，cape胜肽之移动可调节整体免疫反应。2.5保留之切割模体之重要性欲确认保留之切割模体之重要性，发明人接着产生转基因株，称作cape1oxcnad，其中eyfp系融合于proatcape1，但在cnyx模体有一突变(y160a)。发明人接着检查经突变之proatcape1–eyfp之表现。于所有三个别之转基因株中，仅检测到mw为45.76kda之单一层带(图12)。该些结果显示，经鉴定之atcape1系源自其前驱物proatcape1，其系经由在保留之cnyx模体之切割(seqidno:55)，且芳族胺基酸残基酪胺酸于过程中相当重要。发明人亦以保留之cnyx模体(seqidno:55)设计蛋白酶抑制剂，以预防蕃茄之进程。结果显示，蕃茄植物在处理cnydpv后，防御基因之表现下降(图13)。3.讨论于本研究中，定量之胜肽体学分析显示三胜肽，包括系统素，其于未损伤之植物未显著表现，但在损伤加上meja处理后高程度表现。此胜肽系抗虫害反应之整体活化之讯息分子(pearce等人，1991)。系统素为抗虫害讯息瀑流放大之上游因子，且整体讯息传递系由茉莉酸(ja)介导(li等人，2003；stratmann，2003)。发明人于此显示损伤加上meja处理之诱发前及后，内源性系统素(一已知之损伤诱发型胜肽)之浓度变化。系统素之检测亦证实，本研究提出之平台，能检测防御讯息胜肽。第二个胜肽，其发现于处理时向上调节，系源自叶绿体光系统ii次单元x。此胜肽与叶绿体诱发活性氧系(reactiveoxygenspecies；ros)相关联。第三个胜肽(称作cape1)系源自病原相关蛋白1b(pr-1b)，其系功能不明之蛋白。由cape1诱发之h2o2及防御基因反应显示，此胜肽调节植物防御反应。h2o2为ros，其涉及损伤、昆虫攻击、及病原体感染期间之数个防御反应(doke等人，1996；lambanddixon，1997；orozco-cardenasandryan，1999)。本研究显示cape1为damp诱导剂，系因其由损伤诱发且活化防御反应。尽管蕃茄中有数个胜肽被视为damps，不过胜肽damp之证据主要基于考虑到前驱物基因系由损伤或合成之推定胜肽之生物活性所诱发(pearce等人，1991；huffaker等人，2006；a.p.trivilin，2014)。微数组及qrt-pcr分析显示，cape1可诱发防御基因产生免疫反应，以对抗虫害及病原体。cape1可诱发ja及sa激素，其说明何以抗虫害及抗病原体基因系藉处理胜肽而诱发。ja及sa生合成路径习知具拮抗性(robert-seilaniantz等人，2011；thaler等人，2012)，但其亦可于植物免疫讯息网络之sa-ja-乙烯骨干中发挥协同作用，从而复位向(redirecting)防御输出(verhage等人，2010)。相较于分别以系统素及flg22活化抗虫害及抗病原体反应，cape1显示轻度抗虫害反应，但活化可比拟之抗病原体反应。由cape1诱发之轻度抗虫害反应可由pi基因及ja激素之诱发量比以系统素处理的低而加以说明。cape1明显诱发数个病原体相关标记基因，包括pr-2、pr-7、chi2；1、及cape1前驱物(pr-1b)。不同于flg22，其诱发wrky53(xiao等人，2007)，cape1引发之免疫性不会诱发pti反应基因wrky53但诱发pr-1b。此意指flg22及cape1分别作为pamp/mamp及damp之诱导剂，从而于抗病原体反应中调节不同机制。此外，erf5，其系gcc盒(agccgcc)结合蛋白，系由cape1诱发。发明人显示，erf5为cape1防御反应之媒介物，系因gcc盒，其系发现于许多茉莉酸(ja)/乙烯(et)诱导性及pr基因之启动子之同侧作用组件(cis-actingelement)。erf5亦证实正向调节sa讯息及植物免疫性以对抗细菌病原体pstdc3000，并藉活化数个pr基因改进植物之病原体抗性(moffat等人，2012；son等人，2012)。于蕃茄，观察到erf5之过度表现，以诱发pr基因，并提供青枯病菌(ralstoniasolanacearum)抗性(li等人，2011)。本研究提出另一增进植物抗性之方法，系经由erf5，其可由低浓度之胜肽而不以转基因调节。此外，adi3，其系编码效应子引发之免疫性(eti)反应之组分，可负向调节程序性细胞死亡(programmedcelldeath；pcd)(devarenne等人，2006)，系于处理cape1后诱发。adi3为细胞死亡抑制剂(celldeathsuppressor；cds)且其定位系透过adi3t-环圈延伸所发现之核定位讯息，其系经磷酸化以活化激酶(ek-ramos等人，2010b)。adi3cds功能之去活化系藉pto之交互作用而初始化，其仅在当pto与pst效应子蛋白avrpto作用时发生。此cds活性之去活化可导致hr，其功能系局限病原体扩散。通过adi3功能去活化之hr经证实可藉过度表现adi3而补偿(devarenne等人，2006；ek-ramos等人，2010a)。于本研究中，发现cape1可活化「防御-无-死亡(defense-no-death)」表型，以增进植物对抗细菌病原体pstdc3000之抗性，而不诱发hr(yu等人，1998)。此表型可由抗病原体及细胞死亡抑制基因之转录程度及sa之量的增加而说明。其亦显示，整体性诱发之免疫反应可藉cape1活化，系因sa及ja分别为诱发sar及诱发性整体抗性(inducedsystemicresistance；isr)之必需激素(pieterse等人，2009)。植物昆虫及病原体为每年全球实质作物损失及越来越多环竟问题之成因，以农用化学品打击生物压力遭遇越来越多局限。cape1可用于活化抗性以对抗蕃茄之生物性威胁。此外，cape1及其原蛋白质之高度保留序列显示，cape1亦可存在于其他物种并具生物活性。此研究证实pr-1b于蕃茄防御讯息之角色，亦证实源自阿拉伯芥之推定之cape胜肽pxgnxxxxxpy-模体(seqidno:1)可于阿拉伯芥诱发抗性以对抗pstdc3000。此外，处理盐类可诱发atcape1产生，并由植物根运输至之地上部。此结果显示cape胜肽于多样性植物物种整体免疫调节之角色。保留之切割模体cnyx(seqidno:55)亦经鉴定为植物免疫性之重要序列，其系藉调节进程而达成。尽管at-pr1被视为抗病原体反应之常见标记基因，其功能先前尚未厘清。本研究突显pr1及cap蛋白于整体防御讯息之生物学角色。参考文献a.p.trivilin,s.h.a.m.g.m.(2014)。componentsofdifferentsignallingpathwaysregulatedbyaneworthologueofatpropep1intomatofollowinginfectionbypathogens.plantpathology.aebersold,r.,andmann,m.(2003)。massspectrometry-basedproteomics.nature422,198-207.boller,t.(2005)。peptidesignallinginplantdevelopmentandself/non-selfperception.curropincellbiol17,116-122.boller,t.,andfelix,g.(2009a)。arenaissanceofelicitors:perceptionofmicrobe-associatedmolecularpatternsanddangersignalsbypattern-recognitionreceptors.annualreviewofplantbiology60,379-406.boller,t.,andfelix,g.(2009b)。arenaissanceofelicitors:perceptionofmicrobe-associatedmolecularpatternsanddangersignalsbypattern-recognitionreceptors.annurevplantbiol60,379-406.butenko,m.a.,vie,a.k.,brembu,t.,aalen,r.b.,andbones,a.m.(2009)。plantpeptidesinsignalling:lookingfornewpartners.trendsinplantscience14,255-263.campos,m.l.,kang,j.h.,andhowe,g.a.(2014)。jasmonate-triggeredplantimmunity.journalofchemicalecology.chang,w.h.,lee,c.y.,lin,c.y.,chen,w.y.,chen,m.c.,tzou,w.s.,andchen,y.r.(2013)。uniqua:auniversalsignalprocessorforms-basedqualitativeandquantitativeproteomicsapplications.analchem85,890-897.chassot,c.,buchala,a.,schoonbeek,h.j.,metraux,j.p.,andlamotte,o.(2008)。woundingofarabidopsisleavescausesapowerfulbuttransientprotectionagainstbotrytisinfection.theplantjournal:forcellandmolecularbiology55,555-567.che,f.y.,lim,j.,pan,h.,biswas,r.,andfricker,l.d.(2005)。quantitativeneuropeptidomicsofmicrowave-irradiatedmousebrainandpituitary.molecular&cellularproteomics:mcp4,1391-1405.chen,c.j.,chen,w.y.,tseng,m.c.,andchen,y.r.(2012)。tunnelfrit:anonmetallicin-capillaryfritfornanoflowultrahigh-performanceliquidchromatography-massspectrometryapplications.analchem84,297-303.cheong,y.h.,chang,h.s.,gupta,r.,wang,x.,zhu,t.,andluan,s.(2002)。transcriptionalprofilingrevealsnovelinteractionsbetweenwounding,pathogen,abioticstress,andhormonalresponsesinarabidopsis.plantphysiol129,661-677.conesa,a.,gotz,s.,garcia-gomez,j.m.,terol,j.,talon,m.,androbles,m.(2005)。blast2go:auniversaltoolforannotation,visualizationandanalysisinfunctionalgenomicsresearch.bioinformatics21,3674-3676.devarenne,t.p.,ekengren,s.k.,pedley,k.f.,andmartin,g.b.(2006)。adi3isapdk1-interactingagckinasethatnegativelyregulatesplantcelldeath.emboj25,255-265.ding,y.,choi,h.,andnesvizhskii,a.i.(2008)。adaptivediscriminantfunctionanalysisandrerankingofms/msdatabasesearchresultsforimprovedpeptideidentificationinshotgunproteomics.journalofproteomeresearch7,4878-4889.doke,n.,miura,y.,sanchez,l.m.,park,h.j.,noritake,t.,yoshioka,h.,andkawakita,k.(1996)。theoxidativeburstprotectsplantsagainstpathogenattack:mechanismandroleasanemergencysignalforplantbio-defence--areview.gene179,45-51.du,z.,zhou,x.,ling,y.,zhang,z.,andsu,z.(2010)。agrigo:agoanalysistoolkitfortheagri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>11<212>prt<213>沙特沃思葡萄<400>12proproglyasntyrvalglyglnargprotyr1510<210>13<211>11<212>prt<213>大油菜<400>13proargglyasntyrvalasnglulysprotyr1510<210>14<211>11<212>prt<213>芜菁<400>14proargglyasntyrvalasnglulysprotyr1510<210>15<211>11<212>prt<213>大豆<400>15proproglyasntyrvalglyglnargprotyr1510<210>16<211>11<212>prt<213>苜蓿<400>16proproglyasntyrvalglyglnlysprotyr1510<210>17<211>11<212>prt<213>玉米<400>17proproglyasnpheargglyglnargprotyr1510<210>18<211>11<212>prt<213>水稻<400>18proargglyasnilevalglyargargprotyr1510<210>19<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>19proalaglyasntyrileglyalaargprotyr1510<210>20<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>20proproglyasntyrileglyglnlysprotyr1510<210>21<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>21proproglyasntrpvalglyglutrpprotyr1510<210>22<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>22proproglyasntyrvalglyglulysprotyr1510<210>23<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>23proproglyasntyrvalglyglulysprotyr1510<210>24<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>24proproglyasnpheleuglyarglysprotyr1510<210>25<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>25proproglyasntyralaasnglnlysprotyr1510<210>26<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>26proproglyasntyrargglyargtrpprotyr1510<210>27<211>11<212>prt<213>阿拉伯芥<400>27proargglyasntyrvalasnglulysprotyr1510<210>28<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>15-aa模体<220><221>杂项特征<222>(4)..(4)<223>xaa可为任何天然存在之胺基酸s<220><221>杂项特征<222>(6)..(6)<223>xaa可为任何天然存在之胺基酸<220><221>杂项特征<222>(9)..(13)<223>xaa可为任何天然存在之胺基酸<400>28cysasntyrxaaproxaaglyasnxaaxaaxaaxaaxaaprotyr151015<210>29<211>15<212>prt<213>西红柿<400>29cysasntyraspprovalglyasntrpileglyglnargprotyr151015<210>30<211>15<212>prt<213>西红柿<400>30cysasntyraspprovalglyasntrpvalglygluargprotyr151015<210>31<211>15<212>prt<213>辣椒<400>31cysasntyraspprovalglyasntrpvalglyglnargprotyr151015<210>32<211>15<212>prt<213>小米椒<400>32cysasntyraspprovalglyasntrpvalglyglnargprotyr151015<210>33<211>15<212>prt<213>马铃薯<400>33cysasntyraspprovalglyasntrpvalglyglnargprotyr151015<210>34<211>15<212>prt<213>茄科茄属马铃薯<400>34cysasntyraspprovalglyasntyrvalglyglnargprotyr151015<210>35<211>15<212>prt<213>心叶烟<400>35cysasntyraspproproglyasnphevalglyglnserprotyr151015<210>36<211>15<212>prt<213>烟草<400>36cysasntyraspproproglyasnvalileglyglnserprotyr151015<210>37<211>15<212>prt<213>酿酒葡萄<400>37cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglnargprotyr151015<210>38<211>15<212>prt<213>葡萄混合种<400>38cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglnargprotyr151015<210>39<211>15<212>prt<213>沙特沃思葡萄<400>39cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglnargprotyr151015<210>40<211>15<212>prt<213>大油菜<400>40cysasntyraspproargglyasntyrvalasnglulysprotyr151015<210>41<211>15<212>prt<213>芜菁<400>41cysasntyraspproargglyasntyrvalasnglulysprotyr151015<210>42<211>15<212>prt<213>大豆<400>42cysasntyralaproproglyasntyrvalglyglnargprotyr151015<210>43<211>15<212>prt<213>苜蓿<400>43cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglnlysprotyr151015<210>44<211>15<212>prt<213>水稻<400>44cysasntyrasnproproglyasnpheargglyglnargprotyr151015<210>45<211>15<212>prt<213>水稻<400>45cysasntyrgluproargglyasnilevalglyargargprotyr151015<210>46<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>46cysasntyraspproalaglyasntyrileglyalaargprotyr151015<210>47<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>47cysasntyraspproproglyasntyrileglyglnlysprotyr151015<210>48<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>48cysasntyraspproproglyasntrpvalglyglutrpprotyr151015<210>49<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>49cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglulysprotyr151015<210>50<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>50cysasntyraspproproglyasntyrvalglyglulysprotyr151015<210>51<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>51cysasntyraspproproglyasnpheleuglyarglysprotyr151015<210>52<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>52cysasntyraspproproglyasntyralaasnglnlysprotyr151015<210>53<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>53cysasntyrtyrproproglyasntyrargglyargtrpprotyr151015<210>54<211>15<212>prt<213>阿拉伯芥<400>54cysasntyraspproargglyasntyrvalasnglulysprotyr151015<210>55<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>cnyx模体以作为蛋白酶抑制剂<220><221>杂项特征<222>(4)..(4)<223>xaa可为任何天然存在之胺基酸<400>55cysasntyrxaa1<210>56<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>cnydpv以作为蛋白酶抑制剂<400>56cysasntyraspproval15<210>57<211>159<212>prt<213>西红柿<400>57metglyleupheasnileserleuleuleuthrcysleumetvalleu151015alailephehissercysglualaglnasnserproglnasptyrleu202530alavalhisasnaspalaargalaglnvalglyvalglyprometser354045trpaspalaasnleualaserargalaglnasntyralaasnserarg505560alaglyaspcysasnleuilehisserglyalaglygluasnleuala65707580lysglyglyglyaspphethrglyargalaalavalglnleutrpval859095sergluargprosertyrasntyralathrasnglncysvalglygly100105110lyslyscysarghistyrthrglnvalvaltrpargasnservalarg115120125leuglycysglyargalaargcysasnasnglytrptrppheileser130135140cysasntyraspprovalglyasntrpileglyglnargprotyr145150155<210>58<211>18<212>prt<213>西红柿<400>58alavalglnserlysproproserlysargaspproprolysmetgln151015thrasp<210>59<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>内标准品<400>59proalaalaalatyrileglyalaargalatyr1510<210>60<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>flg22<400>60glnargleuserthrglyserargileasnseralalysaspaspala151015alaglyleuglnileala20<210>61<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>野生型连接序列<400>61cysasntyrasp1<210>62<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>经突变之连接序列<400>62cysasnalaasp1<210>63<211>19<212>dna<213>人工序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