包含大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分用于预防或治疗神经炎症或者神经退行性疾病的药物组合物的制作方法

本发明涉及一种包含大花马齿苋(portulacagrandiflorahook.)提取物或其馏分作为活性成分的用于预防、治疗或者减轻神经炎症或者神经退行性疾病的药物组合物和食品组合物。

背景技术：

当组织(细胞)受到侵入物(细菌、真菌、病毒、不同类型的过敏原等)损坏或感染的时候，炎症反应与局部血管和体液内不同的炎症介质以及免疫细胞相关联，表现出一系列复杂的生理反应，例如酶的活化、炎症介质的分泌、体液的渗透、细胞迁移、组织破坏等，以及外部症状，例如红斑、水肿、发烧、疼痛等。在正常情况中，炎症反应用于通过去除侵入物并再生损伤的组织来恢复生物体的功能，但是如果抗原未被去除，或者如果由于体内物质炎症反应过度或者持续，其反而会促使黏膜损伤，并由此部分地发展成例如癌症等的疾病。

近年来，已经发现炎症反应为引起神经退化的主要机制之一。也就是说，在中枢神经系统中存在的免疫细胞，即小神经胶质细胞可以由不同的外因和内因物质而被活化，并且已活化的小神经胶质细胞生成并释放例如炎症细胞因子tnf-α和il-1β、一氧化氮、前列腺素、过氧化物等的物质(gao等,jneurochem,81,1285-97,2002；nelson,pt.等,annmed,34,491-500,2002；griffin,w.s.等,jneuroinflammation,3,5,2006)。此类物质的产生在短期内会引起免疫反应，但是所述物质过量或者持续的产生会引起相邻神经细胞的死亡，从而导致神经退化。而且，因为由死亡的神经细胞所释放的物质会诱导小神经胶质细胞再次活化，所以神经退化会陷入持续的恶性循环。事实上，已经报道小神经胶质细胞的活化是与不同的退行性神经疾病相关的，例如阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿病、卢·格里克病、克雅二氏病(cjd)、多发性硬化症等。

因此，考虑到神经炎症反应在神经退行性疾病中的重要性，通过降低促炎介质在所述小神经胶质细胞中的表达水平，使治疗可能由此引发的神经炎症和神经退行性疾病成为可能。

同时，大花马齿苋是马齿苋属的一年生草本植物，原产地为南美洲，并由在全世界分布的约40个品种构成。大花马齿苋的完整植株被称为向天盏(scutellariarivularis)，其已被用作药物。已经报道大花马齿苋的主要组分黄曲霉素b1和环磷酰胺对啮齿动物具有抗突变作用(liu等,中国中药杂志,1990,640,617-622)。然而，大花马齿苋在预防或治疗神经炎症或者神经退行性疾病方面并不存在已知的应用。

技术实现要素：

技术问题

本发明人为了开发能够防止或者治疗痴呆的方法已经努力进行了大量的研究工作，并且发现大花马齿苋提取物或其馏分抑制了神经炎症反应，并且还具有提高和改善记忆力以及学习能力的作用。因此，基于这样的事实完成本发明。

技术方案

本发明的一个目的在于提供一种包含大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分的药物组合物，用于预防或治疗神经炎症或神经退行性疾病。

本发明的另一个目的在于提供一种包含大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分的食品组合物，用于预防或减轻神经炎症或神经退行性疾病。

本发明的另一个方面在于提供一种包含大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分的组合物，用于提高和改善记忆力以及学习能力。

有益效果

根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分抑制炎症相关因子(例如no，pge2，inos和/或cox-2基因或蛋白)的表达，而不会产生任何副作用，因为提取物或者馏分源自被用作天然医药成分的天然产物。而且，根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分可被用于预防或治疗神经炎症或神经退行性疾病，因为提取物或者馏分在提高和改善记忆力以及学习能力方面具有良好效果。

附图说明

图1为当使用大花马齿苋甲醇提取物进行处理时，对sh-sy5y神经细胞系中大脑神经细胞的保护作用的示意图。

图2为当使用大花马齿苋甲醇提取物进行处理时，对bv-2小神经胶质细胞中no生成的抑制作用的示意图。

图3为当使用大花马齿苋甲醇提取物进行处理时，对bv-2小神经胶质细胞中pge2生成的抑制作用的示意图。

图4a和4b为当使用大花马齿苋甲醇提取物进行处理时，对bv-2小神经胶质细胞中inos蛋白和mrna表达的抑制作用的示意图。

图5a和5b为当使用大花马齿苋甲醇提取物进行处理时，对bv-2小神经胶质细胞中cox-2蛋白和mrna表达的抑制作用的示意图。

图6为当使用大花马齿苋甲醇提取物进行处理时，对sh-sy5y神经细胞系中β-ctf表达的抑制作用的示意图。

图7a和7b为当使用大花马齿苋甲醇提取物进行处理时，对sh-sy5y神经细胞系中bace1表达的抑制作用的示意图。

图8a至8d为通过使用y型迷宫试验示出大花马齿苋提取物或其馏分对工作记忆力的改善作用的示意图。

图9a至9d为在东莨菪碱诱导的记忆损伤模型中，使用y型迷宫试验示出大花马齿苋提取物或其馏分对工作记忆力的改善作用的示意图。

图10a至10d为使用避暗试验示出大花马齿苋提取物或其馏分对记忆力以及学习能力的改善作用的示意图。

图11a至11d为在东莨菪碱诱导的记忆损伤模型中，使用避暗试验示出大花马齿苋提取物或其馏分对记忆力以及学习能力的改善作用的示意图。

图12为在aβ25-35诱导痴呆模型中，使用y型迷宫试验示出大花马齿苋提取物或其馏分对工作记忆力的改善作用的示意图。

图13为在aβ25-35诱导痴呆模型中，使用避暗试验示出大花马齿苋提取物或其馏分对记忆力和学习能力的改善作用的示意图。

最佳实施方式

为了实现上述的目的，根据本发明的一个方面，提供了一种包含大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分的药物组合物，用于预防或者治疗神经炎症或神经退行性疾病。

特别地，根据本发明用于预防或者治疗神经炎症或神经退行性疾病的药物组合物可以包括大花马齿苋提取物和/或其馏分。

在本发明中，“大花马齿苋”为马齿苋属的一年生草本植物，原产地为南美洲，并由在全世界分布的约40个品种构成。大花马齿苋的茎为肉质的，呈圆柱形并且是红色的，朝外生长，通常在底部分支，并且对于大的茎来说会延伸至高达30cm的长度。叶为肉质的并且是线性的，不具有绒毛，大量的白色绒毛由叶腋长出。一个或两个或更多个花通常聚集在茎的末端。红色或者白色的花在夏季开放，并且具有两个呈宽椭圆形的花杯以及五个具有尖端呈倒卵球形的花瓣。而且，大花马齿苋的整个植株被称为向天盏，其已被用作药物。

在本发明中，术语“大花马齿苋提取物”涉及通过提取大花马齿苋获得的提取物。大花马齿苋提取物为通过使用极性溶剂例如水、具有1(c1)至4(c4)个碳原子的低级醇(例如甲醇、乙醇和丁醇)或者其混合比为约1:0.1至1:10的混合溶剂作为洗脱溶剂，在20至100℃、优选室温的提取温度下提取大花马齿苋的地面部分约12小时至4天、优选3天的提取周期而获得的。在本文中，极性溶剂或者混合溶剂的体积为地面部分干重的约2至20倍、优选约3至5倍，并且提取使用例如热水提取、冷提取、回流冷却提取、或者超声提取等的提取方法来进行。例如，提取对预防或治疗神经炎症或神经退行性疾病具有活性的物质的任何方法都可以不加限制地使用。优选地，大花马齿苋提取物可以是通过使用冷提取来提取大花马齿苋1至5次，在真空下过滤所获得的提取物，并在20至100℃、优选室温下于真空旋转蒸发器中在真空下浓缩过滤后的提取物获得的产物，从而获得溶解于水、低级醇或者其混合溶剂中的大花马齿苋粗提取物。提取物的类型可能是有限的，只要根据本发明，提取物对预防或治疗神经炎症或神经退行性疾病具有活性。例如，提取物可以包括所有的提取物，稀释的或者浓缩的提取物溶液，通过干燥提取物而获得的干燥物质，或者其粗提纯产物或提纯产物。大花马齿苋提取物可以从天然的、杂交的和改良的植物的任何部分提取出，并且例如可以由根部、地上部分、茎、花、枝、叶、果实或者植物组织培养物等提取出。

在本发明中，术语“馏分”是指通过从包括不同组分的混合物中分离出特定组分或者特定组合的分馏方法所获得的产物。本发明的大花马齿苋馏分可以通过使大花马齿苋提取物悬浮，并使用极性溶剂(例如水、甲醇、乙醇等)或非极性溶剂(例如己烷、乙酸乙酯等)将提取物分馏至极性溶剂馏分和非极性溶剂馏分中而获得。特别地，大花马齿苋馏分可以通过使大花马齿苋粗制提取物悬浮于蒸馏水等中，以悬浮液体积的约1至100倍、优选约1至5倍添加极性或非极性溶剂(例如水、具有1(c1)至4(c4)个碳原子的醇、氯仿、乙酸乙酯、己烷、丁醇或其混合溶剂)，并提取和分离极性或非极性溶剂-可溶层1至10次、优选2至5次而获得。

而且，本发明的馏分可以通过进一步进行常规分馏方法来获得(harbornej.b.plantpathology,1998,3rded.p6-7)。例如，通过使根据本发明的大花马齿苋提取物经过具有特定截留分子量的超滤膜而获得的馏分，以及通过进一步进行不同的提纯方法、例如通过不同类型的层析法(设计用于根据大小、电荷、疏水性或亲合力的分离)的分离而获得的活性馏分也被包括在根据本发明的大花马齿苋馏分中。

活性馏分为具有更高生理活性的馏分，其为由所述馏分分离出的，并由此称为活性部分或者有效馏分。具有更高活性的特定活性馏分可以通过由馏分分离出活性组分来制备，其中根据活性组分的性质，使用浓度梯度柱层析法等，通过常规分馏方法(例如系统分馏)获得不同的组分。通过使用填料的柱层析法来分离并提纯活性馏分，所述填料选自由硅胶、sephadex、lh-20、ods凝胶、rp-18、聚酰胺、toyopearl和xad树脂组成的组。根据需要，柱层析法可以使用适当的填料进行数次，但是本发明并不限于此。在相关领域中常用的溶剂、速率或时间适用于在层析法中使用的洗脱溶剂、洗脱速率和洗脱时间。

在本发明的一种示例性实施方式中，所获得的大花马齿苋甲醇提取物通过添加蒸馏水而被悬浮，并添加乙酸乙酯、丁醇或水以分别获得乙酸乙酯馏分、丁醇馏分或水馏分(实施例1和实施例2)。

根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分可被用于预防或治疗由抑制已知为炎症相关因子的一氧化氮(no)、前列腺素(pge2)、inos和/或cox-2基因或蛋白的表达引发的神经炎症或神经退行性疾病的目的。

在本发明中，术语“神经炎症”通常是指在神经系统(即神经细胞、神经组织等)中，引起的所有类型的炎症反应。该术语包括如下情况：在中枢神经系统中存在的免疫细胞，即小神经胶质细胞可以由不同的外因和内因物质活化，从而生成并释放例如炎症因子tnf-α和il-1β、一氧化氮、前列腺素、过氧化物等的物质。已知的是，所述物质的产生在短期内引发免疫反应，但是过量或持续产生的物质会引起相邻神经细胞的死亡，从而导致神经退化。

在本发明的一个试验实施方式中，发现大花马齿苋提取物或其馏分对于预防或治疗神经炎症是有效的，通过确认所述提取物或馏分抑制已知为炎症相关因子的no，pge2，inos和cox-2蛋白或mrna的表达水平，而不会导致对神经细胞的毒性(试验实施例2)。

而且，根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分可用于预防或治疗神经退行性疾病的目的，通过抑制已知为阿尔茨海默症相关酶的β-ctf和β-分泌酶(bace1)的表达。

在本发明中，术语“神经退行性疾病”通常是指在中枢神经系统的神经细胞中产生不同的退行性变化症状的所有类型的疾病，并且特别地包括减退的认知功能、学习能力或者记忆力、或者伴有神经炎症反应的神经退行性疾病。根据本发明的代表性的神经退行性疾病包括痴呆、阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿病、卢·格里克病(肌萎缩性脊髓侧索硬化症，als)、克雅二氏病(cjd)、中风、多发性硬化病、认知障碍、学习困难、记忆损伤等。

其中，阿尔茨海默症(ad)已成为老年性痴呆病中最重要的疾病，并且被认为是由于淀粉样蛋白β(aβ)的大脑内聚集并产生神经毒性所导致的。aβ被认为是由于淀粉样前蛋白(app)与膜蛋白酶(例如β-分泌酶1(bace1)和γ-分泌酶)的连续作用而形成的。因此，显然地，阿尔茨海默症可以通过抑制bace1蛋白的表达而被预防或治疗。

在本发明的一个试验实施方式中，发现大花马齿苋提取物或其馏分具有预防或治疗神经退行性疾病的作用，通过确认所述提取物或馏分抑制已知为阿尔茨海默症相关基因的β-分泌酶-裂解的羧基终端片段(β-ctf)和β-分泌酶1，β-部位app-裂解酶1(bace1)的蛋白或mrna的表达水平(试验实施例3)。

在本发明中，术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指在给药所述组合物时，所有类型的抑制或延迟神经炎症或神经退行性疾病发作的作用，并且术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在使用所述组合物时，所有类型的改善或减轻由神经炎症或神经退行性疾病所产生的症状的作用。

包括根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分的药物组合物可以进一步包括适用于在制备药物组合物时常用的载体、辅料或稀释液。在这种情况中，在组合物中包括的大花马齿苋提取物或其馏分并未被特别地限制，但是它们的含量可以是0.001wt％至99wt％，优选0.01wt％至50wt％，基于组合物总重量计。

药物组合物可被制成任意一种选自由片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮液、内服液体、乳液、糖浆、无菌水性溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳液、冻干试剂、和栓剂组成的组的剂型，并且还可被制成用于口服或者非肠道给药的不同剂型。当配制的时候，组合物可以使用在相关领域中常用的稀释液或辅料来制备，例如填料、疏松剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊等。这样的固体制剂可以通过混合至少一种辅料(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、凝胶等)和一种或多种化合物来制备。而且，除了简单的辅料，还可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂包括悬浮液、内服液体、乳液、糖浆等。在这种情况中，液体制剂包括不同的辅料，例如润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等，除了常用的简单稀释液，例如水、液体石蜡等。用于非肠道给药的制剂包括无菌水性溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳液、冻干制剂、栓剂等。丙二醇、聚乙二醇和植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等可被用作为非水性溶剂和悬浮剂。witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、三月桂酸甘油酯脂状物、甘油明胶等可被用作为栓剂的基底。

根据另一个方面，本发明提供了一种预防或治疗神经炎症或神经退行性疾病的方法，其包括将药物组合物给药至可能患有神经炎症或神经退行性疾病的受试者。

在本发明中，可能患有神经炎症或神经退行性疾病的受试者涉及所有动物类型，包括已经患有所述疾病或者可能患有所述疾病的人类。可以通过将本发明的药物组合物给药至可能患有神经炎症或神经退行性疾病的受试者而对受试者进行有效地治疗。所述药物组合物以及神经炎症或神经退行性疾病为如上所述的。

在本发明中，术语“给药(administering)”或者“给药(administration)”是指使用任意合适的方法将本发明的药物组合物给药至可能患有神经炎症或神经退行性疾病的受试者。在这种情况中，所述组合物可以通过口服或者非肠道给药的不同途径来给药，只要使用这些给药途径所述组合物可以到达目标组织。

根据本发明的药物组合物可以以药学上的有效量而被给药。

在本发明中，术语“药学上的有效量”是指以适用于任何医药治疗的合理的利益/风险比足够治疗疾病的量。在这种情况中，有效量的水平可以根据受试者的类型、严重程度、年龄和性别，疾病种类、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、以及分泌速率、治疗周期、包括联合用药的因素、和医药领域中已知的其它因素而确定。本发明的组合物可以作为单独治疗试剂给药，或者可以与其它治疗试剂联合给药。在这种情况中，组合物可以与常规治疗试剂顺序或者同时给药。并且，本发明的组合物可以单次剂量或者多次剂量给药。考虑到所有上述的因素，重要的是，以最小剂量给药时，以实现最大效果且不产生任何副作用的剂量来给药组合物。由此，组合物的剂量可以由本领域技术人员容易地确定。

根据本发明的药物组合物适用于不存在任何特别限制的任何受试者，只要药物组合物用于神经炎症或者神经退行性疾病。例如，任何非人类的动物，例如猴、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪、山羊等，人类，鸟类和鱼类可被使用。药物组合物可以是非肠道、皮下、腹膜内、肺内和鼻内给药，并且根据需要可以使用包括病灶内给药的适当方法来给药以用于局部治疗。根据本发明的药物组合物的优选剂量可以根据受试者的状况和体重、疾病的严重程度、药物形状、给药途径、和给药周期而不同，但是可以由本领域技术人员适当地选择。例如，药物组合物可被口服、直肠内或静脉内给药，或者可以通过肌肉、皮下、子宫颈内或者脑血管内注射而给药，但是本发明并不限于此。

合适的使用组合物的每日总剂量可以通过医学判断范围内的处方来确定。在这种情况中，组合物通常的给药剂量为0.001至1,000mg/kg，优选为0.05至200mg/kg，更优选为0.1至100mg/kg，每天一次或数次。

根据另一个方面，本发明提供了一种包含大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分的食物组合物，用于预防或减轻神经炎症或神经退行性疾病。

大花马齿苋提取物和其馏分，以及神经炎症或神经退行性疾病为如上所述的。

在本发明中，术语“减轻(ameliorating)”或者“减轻(amelioration)”是指所有类型的用于改善或者有益于已经发展成的或可能具有如神经炎症的疾病或者神经退行性疾病的受试者症状的作用，其使用包括大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分的组合物来预防或治疗。

特别地，根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分可被添加至食物组合物，用于预防或减轻神经炎症或神经退行性疾病的目的。

根据本发明的食品组合物可以包括丸剂、粉末、颗粒、浸剂、片剂、胶囊或溶液的形式。可以添加根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分的食品种类并未被特别地限定，包括例如各种饮料、口香糖、茶、维生素复合物、保健食品等。

除了大花马齿苋提取物或其馏分，食品组合物还可以添加其它组分，并且其它组分的种类并未被特别地限定。例如，与常规食品一样，可以包括各种草本植物提取物、营养学可接受的辅助性食品添加剂、或者天然碳水化合物作为附加组分，但是本发明并不限于此。

术语“辅助性食品添加剂”是指可以辅助添加至食物的组分，并由此可被添加以制备用于单独制剂的健康功能性食物，并且可以由本领域技术人员适当地选择和使用。辅助性食品添加剂的例子包括各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成和天然调味剂)、着色剂和填料、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化试剂等，但是根据本发明的辅助性食品添加剂的种类并不限于如上所列的辅助性食品添加剂的例子。

天然碳水化合物的例子包括单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。除了如上所列的调味剂，天然调味剂(奇异果甜蛋白等)、甜叶菊提取物(甜菊双糖苷a，甘草甜素等)，以及合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)可被用作为调味剂。

根据本发明的食品组合物可以包括健康功能性食物。“健康功能性食物”是指以片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体和丸剂的形式制备和加工的食物，其使用功能上对人体有益的原材料或组分。在本文中，术语“功能性”是指相对于人体的结构和功能调节营养素的情况，或者实现对健康护理有用的效果，例如生理作用。根据本发明的健康功能性食物可以使用在相关领域中常用的方法来制备，并且可以通过添加在健康功能性食物的制备相关领域中通常添加的原材料和组分来制备。而且，健康功能性食物具有这样的优点，与常见的药物不同，因为以食物为原材料，因此健康功能性食物不具有在长期使用药物时可能会出现的副作用，并且可以是高度便携的。

可以根据使用目的(预防疾病、健康疗法或者治疗性治疗)适当地确定混合活性成分的量。一般来说，根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分的添加量可以是1至50wt％，优选5至10wt％，基于制备食物的原材料组合物的总量计，但是本发明并不限于此。然而，根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分用于健康或者卫生的目的或者调节健康的目的而长期使用时可以使用小于或等于所述量的含量。

食物的种类并未被特别地限定。可添加上述材料的食物的实例可以包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果、快餐、糕点、披萨、拉面、其它面条、口香糖、包括冰激凌的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和维生素复合物，并且可以包括所有种类的常规健康功能性食物。

根据又一个方面，本发明提供了一种包含大花马齿苋提取物或其馏分作为活性成分的组合物，用于提高或者改善记忆力和学习能力。

大花马齿苋及其提取物或馏分为如上所述的。

根据本发明的一种试验实施方式，大花马齿苋提取物或其馏分在小鼠模型中施用。结果证实大花马齿苋提取物或其馏分在y型迷宫试验中具有提高工作记忆力的作用，并且在避暗试验中具有提高记忆力的作用。因此，根据本发明的大花马齿苋提取物或其馏分可被用于提高记忆力和学习能力。在这种情况中，组合物可以是药物组合物、卫生辅助组合物或者食品组合物。

而且，本发明提供了大花马齿苋提取物或其馏分用以制备用于预防、治疗或减轻神经炎症或神经退行性疾病的药物组合物或食品组合物的应用。

另外，本发明提供了大花马齿苋提取物或其馏分用以制备用于提高或改善记忆力和学习能力的食品组合物的应用。

此外，本发明提供了一种提高或改善受试者记忆力和学习能力的方法，包括给药大花马齿苋提取物或其馏分至需要的受试者。

具体实施方式

在下文，将参考实施例更加详细地描述本发明的结构和效用。然而，应当理解的是，下文的实施例仅仅是优选实施例，其仅用于说明性的目的，并不意图限制或限定本发明的范围。

1.药物和试剂

淀粉样蛋白β25-35(aβ25-35)，二甲基亚砜(dmso)，30％过氧化氢(h2o2)，脂多糖，磷酸，聚-d-赖氨酸，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)，n-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐，磺胺，吐温-20,东莨菪碱和抗-β-肌动蛋白抗体购自西格玛化学公司(sigmachemicalco.)(st.louis,mo,美国)。dulbecco改良的eagle培养基(dmem)购自hyclone(logan,ut,美国)。胎牛血清(fbs)，0.25％胰蛋白酶-edta和盘尼西林/链霉素混合物购自gibco-brl(grandisland,na,美国)。兔抗-兔辣根过氧化物酶连接的igg抗体购自cellsignaling(boston,ma,美国)。兔抗-app，兔抗-bace1，兔抗-cox-2和兔抗-inos抗体购自epitomics(burlingame,ca,美国)，并且trizol，cdna合成试剂盒购自invitrogen(molecularprobes,or,美国)。本发明使用pge2elisa试剂盒(cayman,mi,美国)。此外，购买最优质的产品并用作在试验中使用的试剂。

2.实验室动物的准备

四周大的icr雄鼠(25至30g)由koatech(gyeonggi-do,韩国)提供，并在成均馆大学的药学院动物饲养室内饲养并适应至少一周，随后使用。自由供给水和饲料，并且自动控制温度(23±2℃)、湿度(55±10％)和光/暗周期(12小时)。

<aβ25-35诱导的痴呆模型的制备>

aβ25-35被溶解于最终浓度为1mm的盐水中，并在37℃下活化5天。其后，使用entobar麻醉4周大的icr雄鼠(25至30g)，并使用立体定位器将6nmol/3μl的aβ25-35注射至左心室内。注射后，实验室动物在37℃或更高的恒定温度下稳定，以恢复。

3.细胞培养

人的成神经细胞瘤sh-sy5y细胞，瑞典sh-sy5y(sh-sy5yswedish)转化株细胞和鼠bv-2小神经胶质细胞在dulbecco改良的eagle培养基(dmem,hyclone,thermo,美国)中培养，补充灭活的10％胎牛血清(fbs)和抗生素。培养箱被维持在37℃的温度下，并且95％空气和5％co2的混合气体被持续供给以产生合适的细胞培养条件。在试验24小时前，于6、24和96孔板中以2.5×10⁴，5×10⁵和1×10⁶个细胞的密度培养细胞。过氧化氢的浓度被设定为400μm，并且lps的浓度被设定为100ng/ml。大花马齿苋甲醇粗制提取物被溶解于100％dmso中，并以0.1％或更小的最终浓度来使用。

4.统计处理

所有的试验结果使用单向方差分析(anova)进行统计处理，并且当测试显著性时，使用newman-keuls试验以p<0.05或更小的水平进行显著性试验。

实施例1.大花马齿苋甲醇提取物的制备

收集自中国云南并在阴凉处干燥的大花马齿苋(分配号：fbm016-068)由韩国生物科学和生物技术研究所的国际生物材料研究中心分发和使用。300g干燥的大花马齿苋被完全干燥并研磨。随后，300g的大花马齿苋于3l95％甲醇中在85℃的温度下反复提取三次，使用真空蒸发器(eyela,n-1000,日本)在减压下浓缩，并经冷冻干燥以获得90g大花马齿苋甲醇粗制提取物。

实施例2.大花马齿苋馏分的制备

实施例2-1：大花马齿苋乙酸乙酯馏分的制备

以与实施例1相同的方式由300g的大花马齿苋获得的36.3g的大花马齿苋甲醇粗制提取物悬浮于1l水中，并随后使用1l乙酸乙酯(etac)提取两次以获得8g乙酸乙酯可溶馏分。

实施例2-2：大花马齿苋丁醇馏分的制备

使用1l丁醇(buoh)再次提取实施例2-1中分馏之后剩余的水层两次，获得5.79g的丁醇可溶馏分。

实施例2-3：大花马齿苋水馏分的制备

在实施例2-2中获得的大花马齿苋丁醇可溶馏分的分馏之后剩余的水层被浓缩，以获得20.55g的水馏分。

每个大花马齿苋提取物和馏分均使用热水处理，在减压下浓缩，并随后用于试验。

试验实施例1：大花马齿苋提取物对神经细胞的保护作用

为了检查通过大花马齿苋提取物进行处理后神经细胞(sh-sy5y)的活性，使用mtt还原试验。mtt溶液被添加至96孔板的每个孔，以0.5mg/ml的最终浓度进行试验。所获得的混合物在培养箱中反应2小时，并去除培养基和mtt溶液。加入dmso，并搅拌。当dmso完全溶解时，使用酶标仪(moleculardevice,美国)在540nm下测量uv光密度。

细胞活性通过将测得的光密度值代入如下的数学公式1计算得出。

[数学公式1]

细胞活性(％)＝(对照组光密度-试验组光密度)/对照组光密度×100

结果证实，当单独使用过氧化氢处理、而不使用大花马齿苋提取物处理细胞时，细胞活性显著降低至48％，但使用大花马齿苋处理细胞时，细胞活性以提取物剂量依赖性方式提高，表明大花马齿苋提取物具有显著的神经保护作用(图1)。

试验实施例2：大花马齿苋提取物的抗炎症作用

试验实施例2-1：大花马齿苋提取物对一氧化氮(no)生成的抑制作用

为了检查大花马齿苋提取物的抗炎作用，对作为炎症介质的no的生成量进行定量测量。具体地，在试验开始24小时之前，将2.5×10⁵bv-2小神经胶质细胞接种在24孔板的每个孔中，并添加100ng/ml的神经炎症诱导物、lps和在实施例1中制备的不同浓度大花马齿苋提取物，在培养箱中反应24小时。随后，将50μlgriess试剂(1％磺胺/0.1％n-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐/5％磷酸盐)添加至每个孔中，并随后反应15分钟。然后，使用酶标仪(moleculardevice,美国)在540nm的波长下测量对神经炎症反应的抑制作用。

结果证实，当使用lps处理细胞时，在bv-2小神经胶质细胞中的no生成量显著增加，并且通过lps处理而显著增加的no生成量被大花马齿苋提取物以剂量依赖性方式抑制(图2)。

试验实施例2-2：大花马齿苋提取物对前列腺素e2(pge2)生成的抑制作用

为了检查大花马齿苋提取物的抗炎作用，对作为炎症介质的pge2的生成量进行定量测量。特别地，在试验24小时前，bv-2小神经胶体细胞在24孔板的每个孔中以2.5×10⁵细胞/ml的密度接种，添加100ng/ml的神经炎症诱导物、lps和在实施例1中制备的递增浓度的大花马齿苋提取物，并随后在培养箱中反应24小时。24小时之后，丛每个浓度处理的孔收集上层清液，并且使用离心机使收集的细胞以400g沉淀3分钟。随后，使用pge2elisa试剂盒确定细胞浓度，并使用酶标仪(moleculardevice,美国)在490nm下测量uv光密度。使用所测量光密度值绘制的标准曲线定量图计算pge2产物。

结果证实，当使用lps处理细胞时，bv-2小神经胶质细胞中pge2的生成量显著增加，并且通过lps处理而显著增加的no生成量被大花马齿苋提取物以剂量依赖性方式抑制(图3)。

试验实施例2-3：大花马齿苋提取物对inos和cox-2蛋白以及mrna表达的抑制作用

对于通过大花马齿苋提取物对bv-2小神经胶质细胞中神经炎症相关蛋白和mrna的表达的鉴定试验，进行western杂交和rt-pcr试验。进行试验的6孔板使用大花马齿苋提取物预处理30分钟，使用lps处理，并随后在培养箱中反应6小时或24小时。在6小时或24小时后，从每个浓度处理的孔收集上层清液，并使用离心机使已收集的细胞在400g下沉淀3分钟，并使用冷pbs冲洗。之后，添加100μl的tper细胞裂解缓冲溶液(thermo,美国)，并裂解细胞30分钟。使用离心机使溶解产物以10,000g在4℃离心15分钟。在离心之后，于70℃下储存上层清液，直至用作试验样品。使用bca定量分析试剂盒(thermo,美国)定量分析蛋白，使用8％至12％sds凝胶洗脱，并转移至pvdf膜。为了检查蛋白的表达，使用增强化学发光(ecl)进行荧光显影。首先，所述膜使用5％脱脂奶粉反应1小时，利用一级抗体inos，cox-2和β-肌动蛋白于4℃标记过夜，使用ttbs冲洗五次，并随后使用辣根过氧化物酶(hrp)共轭的抗兔和抗鼠抗体作为二级抗体在室温下标记1小时。在标记之后，所述膜使用ttbs冲洗五次，持续10分钟。之后，经冲洗的膜在x光片上使用ecl显影。根据定量分析方法使用定量分析程序(fujifilm,日本)分析浓度。而且，为了检查mrna表达，使用trizol(invitrogen)提取全长度rna，并使用cdna合成试剂盒(invitrogen)进行rt-pcr。用于inos,cox-2和β-肌动蛋白的引物在rt-pcr中使用。引物的序列在下文的表1中列出。

[表1]

结果证实，inos和cox-2蛋白以及mrna的表达水平通过lps处理而显著增加，但是当施用大花马齿苋提取物时，蛋白和mrna的表达水平会显著下降(图4和5)。

试验实施例3：大花马齿苋提取物对阿尔茨海默症相关基因和蛋白表达的抑制作用

对于通过大花马齿苋提取物在瑞典sh-sy5y转化株神经细胞系中痴呆(阿尔茨海默症)相关蛋白和mrna表达的鉴定试验，对β-ctf和bace1分别进行western杂交和rt-pcr试验。进行试验的6孔板使用大花马齿苋提取物预处理24小时，并随后在培养箱中进行反应。在24小时后，从每个浓度处理的孔收集上层清液，并使用离心机在400g下沉淀所收集的细胞3分钟，并使用冷pbs冲洗。随后，添加100μl的tper细胞裂解缓冲溶液(thermo,美国)，并裂解细胞30分钟。使用离心机使溶解产物以10,000g在4℃离心15分钟。在离心之后，于70℃下储存上层清液，直至用作试验样品。

使用bca定量分析试剂盒(thermo,美国)定量分析蛋白，使用12.5％sds凝胶洗脱，并转移至pvdf膜。为了检查蛋白的表达，使用增强化学发光(ecl)进行荧光显影。首先，所述膜使用5％脱脂奶粉反应1小时，利用一级抗体app，β-ctf，bace1和β-肌动蛋白于4℃标记过夜，使用ttbs冲洗五次，并随后使用辣根过氧化物酶(hrp)共轭的抗兔和抗鼠抗体作为二级抗体在室温下标记1小时。在标记之后，所述膜使用ttbs冲洗五次，持续10分钟。然后，经冲洗的膜在x光片上使用ecl显影。根据定量分析方法使用定量分析程序(fujifilm,日本)分析浓度。

同时，为了检查mrna表达，使用trizol(invitrogen)提取全长度rna，并使用cdna合成试剂盒(invitrogen)进行rt-pcr。用于bace1和β-肌动蛋白的引物在rt-pcr中使用。引物的序列在下文的表2中列出。

[表2]

结果证实，β-分泌酶-裂解的羧基末端片段(β-ctf)蛋白的表达水平被已处理的大花马齿苋提取物以剂量依赖性方式抑制(图6)。

已证实，bace1蛋白和mrna的表达水平也被已处理的大花马齿苋提取物以剂量依赖性方式抑制(图7a和7b)。

试验实施例4：大花马齿苋提取物或其馏分对提高工作记忆力的作用

试验实施例4-1：使用y型迷宫试验确认大花马齿苋提取物或其馏分对提高工作记忆力的作用

将小鼠分为四组，每组由14只组成。第一组为给药包含10％吐温20的蒸馏水的组(对照组)，并且第二至第四组为分别以剂量6.25,12.5和25mg/kg给药大花马齿苋提取物或其丁醇、乙酸乙酯和水溶性馏分的组(试验组)。

将每种大花马齿苋提取物或其馏分均溶解于包含10％吐温20的蒸馏水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的剂量口服给药小鼠。1小时后，将小鼠置于y型迷宫内，并确定小鼠是否自由地进入每个a、b和c臂。在这种情况中，当鼠进入新的臂时会给出一点，并且根据如下的数学公式2计算得出交叉行为(crossoverbehavior)(％)。

[数学公式2]

交叉行为(％)＝[小鼠进入三个臂的次数/(小鼠进入每个臂的总次数-2)]×100

结果证实，与未给药大花马齿苋提取物或其馏分的第一组(对照组)鼠相比，给药大花马齿苋提取物或其馏分的第二至第四组(试验组)小鼠中，交叉行为(％)通过大花马齿苋提取物或其馏分以浓度依赖性方式提高。

这些结果显示大花马齿苋提取物或其馏分在y型迷宫试验中具有提高工作记忆力的作用。根据试验结果，已证实大花马齿苋提取物或其馏分显著地提高了每只小鼠的工作记忆力(图8a至8d)。

试验实施例4-2：在东莨菪碱诱导的记忆损伤模型中，使用y型迷宫试验确认大花马齿苋提取物或其馏分对改善工作记忆力的作用

将小鼠分为五组，每组由14只组成。第一组为给药包含10％吐温20的蒸馏水的组(对照组)，第二组为给药东莨菪碱和包含10％吐温20的蒸馏水的组(阳性对照组)，并且第三至第五组为给药大花马齿苋提取物或其丁醇、乙酸乙酯和水溶性馏分的组(试验组)。

将每种大花马齿苋提取物或其馏分均溶解于包含10％吐温20的蒸馏水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的剂量口服给药小鼠。30分钟后，将0.5mg/kg东莨菪碱皮下注射至鼠。

1小时后，将小鼠置于y型迷宫内，并确定鼠是否自由地进入每个a、b和c臂。在这种情况中，当小鼠进入新的臂时会给出一点，并且根据如下的数学公式2计算得出交叉行为(％)。

[数学公式2]

交叉行为(％)＝[小鼠进入三个臂的次数/(小鼠进入每个臂的总次数-2)]×100

结果证实，与未给药东莨菪碱的第一组(对照组)小鼠相比，在给药东莨菪碱的第二组(阳性对照组)小鼠中，交叉行为(％)有所下降，表明健忘被诱发。

同时，已证实的是在给药大花马齿苋提取物或其馏分的第三至第五组(试验组)鼠中，交叉行为(％)有所提高。根据试验结果，已证实的是大花马齿苋提取物或其馏分有效地防止了记忆损伤(图9a至9d)。

试验实施例4-3：在aβ25-35诱导的痴呆模型中，使用y型迷宫试验确认大花马齿苋提取物对改善工作记忆力的作用

将小鼠分为五组，每组由11至12只组成。第一组为给药包含10％吐温20的蒸馏水的组(对照组)，第二组为给药aβ25-35和包含10％吐温20的蒸馏水的组(阳性对照组)，并且第三至第五组为给药不同浓度的大花马齿苋提取物的组(试验组)。

将大花马齿苋提取物溶解于包含10％吐温20的蒸馏水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的剂量口服给药小鼠。1小时后，使用立体定位器将6nmol的aβ25-35注射至左心室内。大花马齿苋提取物以6.25，12.5和25mg/kg的剂量与包含10％吐温20的蒸馏水一起给药每个组的小鼠，持续5天。

在第五天，于给药大花马齿苋提取物1小时后，将鼠置于y型迷宫内，并确定小鼠是否自由地进入每个a、b和c臂。在这种情况中，当鼠进入新的臂时会给出一点，并且根据如下的数学公式2计算得出交叉行为(％)。

[数学公式2]

交叉行为(％)＝[小鼠进入三个臂的次数/(小鼠进入每个臂的总次数-2)]×100

结果证实，与未给药aβ25-35的第一组(对照组)小鼠的交叉行为(67％)相比，给药aβ25-35的第二组(阳性对照组)小鼠中，交叉行为(52％)有所下降，表明痴呆被诱发(p<0.01)。

同时，已证实的是与aβ25-35诱导的痴呆模型组(阳性对照组)的小鼠相比，以6.25mg/kg的剂量给药大花马齿苋甲醇提取物的组中，以12.5mg/kg的剂量给药大花马齿苋甲醇提取物的组中，和以25mg/kg的剂量给药大花马齿苋甲醇提取物的组中，交叉行为分别为58％、67％和62％，其数值显著地提高。

根据试验结果，已证实的是大花马齿苋提取物有效地防止了阿尔茨海默症的记忆损伤(图12)。

试验实施例5：大花马齿苋提取物或其馏分对提高记忆力和学习能力的作用

试验实施例5-1：使用避暗试验确认大花马齿苋提取物或其馏分对提高记忆力和学习能力的作用

将小鼠分为四组，每组由11至12只组成。第一组为给药包含10％吐温20的蒸馏水的组(对照组)，并且第二至第四组为分别以剂量6.25，12.5和25mg/kg给药大花马齿苋提取物或其可溶馏分(乙酸乙酯、丁醇和水)的组(试验组)。

每个大花马齿苋提取物或其可溶馏分(乙酸乙酯、丁醇和水)均被溶解于包含10％吐温20的蒸馏水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的剂量口服给药小鼠。1小时后，将小鼠置于避暗装置中，并且在小鼠进入暗箱内的时候，通过施加0.25ma电击3秒来训练。24小时后，从小鼠被置于灯箱内的时间到小鼠返回至暗箱内的时间之间的停留时间被测量，并被用作记忆力和学习能力的指标。在这种情况中，小鼠的截止时间被设定为300秒，并随后与对照组进行比较。

结果证实，与未给药大花马齿苋提取物或其馏分的第一组(对照组)小鼠相比，在给药大花马齿苋提取物或其馏分的第二至第四组(试验组)小鼠的停留时间有所提高。

根据试验结果，已证实的是大花马齿苋甲醇粗制提取物或其馏分显著地提高了记忆力和学习能力(图10a至10d)。

试验实施例5-2：在东莨菪碱诱导的记忆损伤模型中，使用避暗试验确认大花马齿苋提取物或其馏分对改善记忆力和学习能力的作用

将小鼠分为五组，每组由14只组成。第一组为给药包含10％吐温20的蒸馏水的组(对照组)，第二组为给药东莨菪碱和包含10％吐温20的蒸馏水的组(阳性对照组)，并且第三至第五组为给药大花马齿苋提取物或其可溶馏分(乙酸乙酯、丁醇和水)的组(试验组)。

将每种大花马齿苋提取物或其馏分均溶解于包含10％吐温20的蒸馏水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的剂量口服给药小鼠。30分钟后，将0.5mg/kg的东莨菪碱皮下注射至小鼠。

30分钟后，将小鼠置于避暗装置中，并且在小鼠进入暗箱内时，通过施加0.25ma电击3秒来训练。对于东莨菪碱诱导的健忘，24小时后，从小鼠被置于灯箱内的时间到小鼠返回至暗箱内的时间之间的停留时间被测量，并被用作记忆力和学习能力的指标。在这种情况中，小鼠的截止时间被设定为300秒，并随后与对照组进行比较。

结果证实，与未给药东莨菪碱的第一组(对照组)小鼠相比，给药东莨菪碱的第二组(阳性对照组)小鼠的停留时间有所减短，表明健忘被诱发。

同时，已证实的是给药大花马齿苋提取物或其乙酸乙酯、丁醇和水溶性馏分的第三至第五组(试验组)小鼠的停留时间有所增加。根据试验结果，已证实的是大花马齿苋甲醇提取物或其馏分有效地防止记忆损伤(图11a至11d)。

试验实施例5-3：在aβ25-35诱导的记忆损伤模型中，使用避暗试验确认大花马齿苋提取物对改善记忆力和学习能力的作用

将小鼠分为五组，每组由11至12只组成。第一组为给药包含10％吐温20的蒸馏水的组(对照组)，第二组为给药aβ25-35和包含10％吐温20的蒸馏水的组(阳性对照组)，并且第三至第五组为给药不同浓度的大花马齿苋甲醇提取物的组(试验组)。

将大花马齿苋提取物溶解于包含10％吐温20的蒸馏水中，并以6.25，12.5和25mg/kg的剂量口服给药小鼠。1小时后，使用立体定位器将6nmol的aβ25-35注射至左心室。大花马齿苋提取物以6.25，12.5和25mg/kg的剂量与包含10％吐温20的蒸馏水一起给药至每个组的小鼠，持续5天。

1小时后，将小鼠置于避暗装置中，并且在小鼠进入暗箱内时，通过施加0.3ma电击3秒来训练。对于aβ25-35诱导的痴呆，24小时后，从小鼠被置于灯箱内的时间到小鼠返回至暗箱内的时间之间的停留时间被测量，并被用作记忆力和学习能力的指标。在这种情况中，小鼠的截止时间被设定为300秒，并随后与对照组进行比较。

结果证实，与未给药aβ25-35的第一组(对照组)小鼠的停留时间(218秒)相比，给药aβ25-35的第二组(阳性对照组)小鼠的停留时间(73秒)有所减短，表明健忘被显著诱发(p＜0.001)。

同时，已证实的是与aβ25-35诱导的痴呆模型组(阳性对照组)的小鼠相比，以6.25mg/kg的剂量给药大花马齿苋甲醇提取物的组中，以12.5mg/kg的剂量给药大花马齿苋甲醇提取物的组中，和以25mg/kg的剂量给药大花马齿苋甲醇提取物的组中，停留时间分别为97秒、163秒和153秒，其数值显著提高。

根据试验结果，再次证实的是大花马齿苋提取物有效地防止了阿尔茨海默症的记忆损伤(图13)。