本发明涉及细胞工程
技术领域：
，特别涉及一种用于治疗肝衰竭的干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：我国慢性乙型肝炎约三千多万人，其中肝硬化的年发生率约3％，5年累计发生约16％，乙肝肝硬化代偿期或失代偿期的5年病死率分别是14％～20％和70％～80％，临床上最终表现为慢性肝功能衰竭症状。加上酒精、自身免疫或继发性损害等，导致发生肝功能衰竭的患者为数众多，既成为社会负担，也为临床治疗带来了难题。原位肝移植因其能够从根本上改善肝功能、延长发生肝衰竭患者的生存期成为一种较好的治疗方法，但由于缺乏供体，手术风险大，费用昂贵，存在免疫排斥反应等因素限制了其广泛应用。血浆置换、白蛋白透析等辅助性人工肝技术的应用，虽可暂时缓解病情，改善症状，肝功能得到一定改善，但对中晚期肝衰竭患者疗效不佳，且目前血液制品来源紧张，费用相对昂贵，也限制了人工肝技术的应用。常见的内科综合治疗虽能暂时解除患的痛苦，但不能从根本上解决病情。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCS)是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大、横向分化能力强，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员关注。近来有研究报道，在骨髓、软骨和脂肪组织之外的脐带血和脐带等胎儿附属组织中发现了MSCS。间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一种成体干细胞，其具有强大的增殖和多向分化的潜能，免疫原性低，并能在体内外分化为肝细胞、肌细胞和成骨细胞等，对于治疗乙肝等肝脏疾病的研究有着重要的意义。目前有研究表明，采用间充质干细胞制成的单一细胞制剂能够在一定时间内修复肝功能，但修复效率差，且无法达到长久修复的目的。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中用于治疗肝衰竭的药物疗效差等缺陷，提供一种能够提高肝衰竭疗效的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂及其制备方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于治疗肝衰竭的干细胞制剂，包括间充质干细胞和血管内皮细胞。在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为(4～6)×106个/ml，所述血管内皮细胞的浓度为(1～2)×106个/ml。在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，还包括干细胞因子、黄芪、岩藻多糖和Y-27632。在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，干细胞因子的浓度为10～200μg/ml、黄芪的浓度为100mg/L～200mg/L、岩藻多糖的浓度为1～100μg/mL、和Y-27632的浓度为10～50μM。在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，还包括质量分数为2.5～5.0％的枸橼酸钠。在本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，间充质干细胞的浓度为5×106个/ml、血管内皮细胞的浓度为1.5×106个/ml、干细胞因子的浓度为100μg/ml、黄芪的浓度为150mg/L、枸橼酸钠的质量分数为3.8％、岩藻多糖的浓度为50μg/mL、和Y-27632的浓度为30μM。本发明进一步保护上述用于治疗肝衰竭的干细胞制剂的制备方法，获取间充质干细胞的过程包括以下步骤：无菌环境下，取脐带，用含有双抗的PBS溶液清洗，剪切成组织块，并用培养基湿润所述组织块；然后，添加间充质干细胞生长培养基进行培养，每2～4天更换间充质干细胞生长培养基；当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，胰酶消化，待细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液，离心后重悬细胞，按1：2～1：3的比例进行传代培养至收获第3～5代中任一代间充质干细胞。获取血管内皮细胞的过程包括以下步骤：取所述第3～5代中任一代间充质干细胞，以(3～6)×105个/皿的密度接种，加入诱导培养基诱导培养至间充质干细胞转化为原代血管内皮细胞，再对所述原代血管内皮细胞进行传代扩增培养至收获第3～5代中任一代血管内皮细胞。在本发明用于治疗肝衰竭的干细胞制剂的制备方法中，所述诱导培养基中添加有40～60μg/L的血管内皮生长因子和5～15μg/L的人碱性成纤维生长因子。本发明进一步保护上述干细胞制剂在制备治疗肝衰竭的药物中的应用。实施本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂及其制备方法，可以达到以下有益效果：通过利用间充质干细胞能够分化成肝细胞的潜能，以及间充质干细胞能够抑制肝炎症状，改善肝功能等功能；同时，结合血管内皮细胞与肝细胞共同作用调控肝细胞细胞的生长及功能，相较于单一干细胞制剂能够达到快速有效恢复肝功能的目的。具体实施方式本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂，包括间充质干细胞和血管内皮细胞。在干细胞制剂中，间充质干细胞的浓度为(4～6)×106个/ml，血管内皮细胞的浓度为(1～2)×106个/ml。肝衰竭时体内产生大量的炎性因子如TNF等，刺激输入体内的间充质干细胞在其细胞表面上表达大量的ICAM-1和VCAM-1，从而吸引已激活的T细胞，使间充质干细胞与T细胞粘附得更加紧密，在人体内间充质干细胞产生IDO，因此，在人体内IDO起到了抑制T细胞的作用，从而使得体内炎症反应得到抑制，TNF-α的产生减少，肝脏细胞功能得以逐渐恢复，体内总胆红素水平逐渐下降，凝血功能逐渐恢复。另外，间充质干细胞植入体内后可激活肝细胞，使间充质干细胞发生迁移、增殖和分化，间充质干细胞分化为肝细胞替代损伤后肝细胞，能够改善肝脏的病理结构，并能够改善肝功能，降低血清INF-γ与TNF-α的水平，同时提高血清ALB水平。其中，间充质干细胞可来源于骨髓、脐带、胎盘等，来源广泛、扩增潜能较强，横向分化能力较强，可逃避免疫识别和抑制免疫反应等，具有其他干细胞无法比拟的优势，如细胞活力较好、扩增能力稳定、无免疫原性、无致瘤性等优点。在本发明中，优先采用第3～5代中任一代间充质干细胞，具有细胞活性较强，存活率较高且生长增殖旺盛等优势。进一步地，血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞，在肝小叶中，内皮细胞和肝细胞互相连接排列形成多层三维组织结构，通过细胞连接、细胞外基质调控肝细胞的生长、分化、凋亡及功能，将干细胞制剂注射体内后，血管内皮细胞与肝细胞共培养能够维持肝细胞的活性及功能，从而达到恢复肝功能的目的。优选地，本发明所采用的血管内皮细胞为第3～5代中任一代血管内皮细胞；。进一步地，本发明提供的干细胞制剂中还包括干细胞因子、黄芪、岩藻多糖和Y-27632。在干细胞制剂中，干细胞因子的浓度为10～200μg/ml、黄芪的浓度为100mg/L～200mg/L、岩藻多糖的浓度为1～100μg/mL、和Y-27632的浓度为10～50μM。其中，干细胞因子是一种具有多种功能的细胞因子，能够阻止肥大细胞在周围组织中的凋亡，并且对肝细胞生长有明显的调控作用，促进肝细胞分裂，抑制干细胞凋亡；干细胞因子与其受体c-kit之间相互作用能够促进间充质干细胞的迁移、增殖，并指出受损纹状体区域产生的干细胞因子是促进干细胞移植物进入病变肝组织的重要因素，能够趋化间充质干细胞定向迁移。优选地，在干细胞制剂中，干细胞因子的浓度为100μg/ml。黄芪具有清除氧自由基、超氧阴离子的作用，从而抗氧化、抗损伤、保护细胞膜、促进干细胞由静止期进入增殖期，促进间充质干细胞定向分化为肝细胞，缩短细胞诱导分化的时间；除此之外，黄芪也能够在一定程度上改善肝脏功能。优选地，在干细胞制剂中，黄芪的浓度为150mg/L。岩藻多糖是一种独特的结合有硫酸基团的水溶性多糖，具有双向调节免疫力，清除自由基，抗凝血和抗血栓，增强肝功能等作用，抑制白细胞在内皮细胞上的滚动、黏附和迁移，减少组织损伤。优选地，在干细胞制剂中，岩藻多糖的浓度为50μg/mL。Y-27632(Rho激酶抑制剂)是Rho激酶活性的特异性抑制剂，能够阻断Rho/Rho激酶信号转导通路，阻止细胞骨架蛋白的收缩，促进间充质干细胞的增殖和分化，并降低间充质干细胞分化为肝细胞的凋亡率。优选地，在干细胞制剂中，Y-27632的浓度为30μM。更为优选地，本发明提供的干细胞制剂中，还包括枸橼酸钠，且其在干细胞制剂中的质量分数为2.5～5.0％。枸橼酸钠具有较好的生物相容性和抗凝性，能够纠正酸中毒，补充钠离子，减少血栓的形成，对于肝功能衰竭出血症状起到一定的控制作用。优选地，干细胞制剂中，枸橼酸钠的质量分数为3.8％。本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：S1、获取间充质干细胞的过程为：无菌环境下，取脐带，用含有双抗的PBS溶液清洗，剪切成组织块，并用培养基湿润所述组织块；然后，添加间充质干细胞生长培养基进行培养，每2～4天更换间充质干细胞生长培养基；当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，胰酶消化，待细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液，离心后重悬细胞，按1：2～1：3的比例进行传代培养至收获第3～5代中任一代间充质干细胞。其中，干细胞生长培养基为血清培养基，且其中添加有10-6～10-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。采用该血清培养基培养间充质干细胞不仅能够促进间充质干细胞生长和增殖，提高间充质干细胞活性，而且可避免培养过程中产生的细菌对细胞活性造成的影响。S2、获取第3～5代中任一代血管内皮细胞的过程为：取所述第3～5代中任一代间充质干细胞，以(3～6)×105个/皿的密度接种，加入诱导培养基诱导培养至间充质干细胞转化为原代血管内皮细胞；再对原代血管内皮细胞进行传代扩增培养至收获第3～5代中任一代血管内皮细胞。其中，诱导培养基中添加有40～60μg/L的血管内皮生长因子和5～15μg/L的人碱性成纤维生长因子，以使间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮细胞。S3、将干细胞因子、黄芪、枸橼酸钠、岩藻多糖、和Y-27632混合物逐滴加入上述间充质干细胞和血管内皮细胞中，边添加边混合，混合均匀后，分装到预充注射器中，冻存，待用。另外，本发明进一步保护上述干细胞制剂在制备治疗肝衰竭的药物中的应用。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂，包括以下成分；且细胞制剂中，各成分浓度如下：间充质干细胞的浓度为5×106个/ml、血管内皮细胞的浓度为1.5×106个/ml、干细胞因子的浓度为100μg/ml、黄芪的浓度为150mg/L、枸橼酸钠的质量分数为3.8％、岩藻多糖的浓度为50μg/mL、和Y-27632的浓度为30μM。该干细胞制剂的制备方法，包括：S1、获取间充质干细胞的过程包括以下步骤：取正常足月健康婴儿脐带，浸泡于每毫升含25U肝素钠的生理盐水中。超净台内取出脐带，以含有1％青链霉素的PBS液充分冲洗脐带外表面，20ml注射器冲洗脐动、静脉管腔后，将其置于1％青链霉素的PBS液中10分钟，取出后将其剪切成1mm×1mm×1mm大小的组织块，在剪切时向所操作的组织上滴加1-2滴培养液，以保持组织湿润。将组织块接种于培养瓶中，均匀铺放，上置盖玻片，待2h后，再加入间充质干细胞生长培养液，置入37℃含有5％CO2的细胞培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察细胞自组织块周边游出、贴壁后，每隔3d更换培养液。当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，以0.25％的胰酶/0.02％EDTA消化。轻轻摇动培养瓶，使消化液覆盖所有细胞表面，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化。反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液，取一滴消化后传代的细胞悬液，加入苔盼蓝染液，显微镜观察细胞活性，活细胞率大于98％时，其余单细胞悬液置于离心管中，1000rpm，离心3min。用间充质干细胞生长培养液重悬细胞，按1：2～1：3的比例传代培养，并标记为Passage1(P1)，每3d换液，倒置相差显微镜下观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增，至收获形态较为单一的P3代细胞。S2、获取血管内皮细胞的过程，包括以下步骤：取步骤S1中获得的间充质干细胞，以细胞浓度为5×105个/皿接种于100mm培养皿，贴壁24小时后，加入10％胎牛血清的EGM-2培养体系(购于LONZA公司，瑞士)其中，该培养体系中含有50μg/L的血管内皮生长因子和10μg/L的人碱性成纤维生长因子，每孔含诱导体系1ml，诱导2周，每3天更换一次诱导培养基体系，然后扩增三代后收集使用，血管内皮干细胞诱导成功后的生长状态为长梭型细胞。S3、将干细胞因子、黄芪、枸橼酸钠、岩藻多糖、和Y-27632混合物逐滴加入上述间充质干细胞和血管内皮细胞中，边添加边混合，混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-80℃冰箱中冻存，待用。实施例2本实施例提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂，包括以下成分，且各成分在细胞制剂中的浓度如下：间充质干细胞的浓度为4×106个/ml、血管内皮细胞的浓度为1×106个/ml、干细胞因子的浓度为10μg/ml、黄芪的浓度为100mg/L、枸橼酸钠的质量分数为2.5％、岩藻多糖的浓度为1μg/mL、和Y-27632的浓度为10μM。该干细胞制剂的制备方法与实施例1大致相同。实施例3本实施例提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂，包括以下成分，且各成分在细胞制剂中的浓度如下：间充质干细胞的浓度为6×106个/ml、血管内皮细胞的浓度为2×106个/ml、干细胞因子的浓度为200μg/ml、黄芪的浓度为200mg/L、枸橼酸钠的质量分数为5.0％、岩藻多糖的浓度为100μg/mL、和Y-27632的浓度为50μM。该干细胞制剂的制备方法与实施例1大致相同。为进一步验证本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。实验动物分组和模型构建C57BL/6小鼠(6-8周)80只，体重25±5g，由上海交通大学中科院上海生命健康研究所实验动物中心提供，实验前一周领取动物，分笼饲养，给与自由进食和饮水，饲养23℃左右，相对温度60.0±10.0％，每隔12小时开灯照明。80只小鼠随机分实验组1-3和对照组四组，各20只，小鼠按0.32ml/20g体征给予20％四氯化碳玉米油灌胃，每周1次，共诱导8周，给予普通颗粒饲料喂养，同时每周监测小鼠体重变化，第8周取2组各5只小鼠，采集其眼眶血测肝功能及TNF-α，INF-γ，切取部分肝右叶做病理组织学检查。实验组1-3第8周时停服四氯化碳，并经其尾静脉分别对应移植0.4ml本发明实施例1-3提供的干细胞制剂(含1×106个细胞)，对照组为等量单纯间充质干细胞制剂，空白对照组为等量生理盐水。至第8周时，实验组1-3小鼠出现体重下降，毛发凌乱无光泽，食欲差，精神萎糜活动少，对外界刺激反应慢，各组取5只取材。取材时，采集其眼眶血，3000g离心10分钟留取血清，检测结果如下表1：表1实验结果：由表1中数据可知，实验组1-3小鼠血清中INF-γ和TNF-α浓度相较于对照组和空白对照组均大幅下降，由此说明小鼠肝脏细胞功能得以恢复。综上所述，本发明提供的用于治疗肝衰竭的干细胞制剂，通过利用间充质干细胞能够分化成肝细胞的潜能，以及间充质干细胞能够抑制肝炎症状，改善肝功能等功能；同时，结合血管内皮细胞与肝细胞共同作用调控肝细胞细胞的生长及功能，从而达到有效恢复肝功能的目的。以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。当前第1页1 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