专利名称：一种游离肝癌细胞的检测和分选方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种游离肝癌细胞的检测和分选方法。
技术背景肿瘤转移是一个多阶段、多步骤的复杂过程。存在于原发瘤和转移瘤之外的肿瘤细胞统 称为游离肿瘤细胞(Isolated tumor cell, ITC)，亦称播散肿瘤细胞(Disseminated tumor cell, DTC)，包括淋巴结、骨髓和血液等组织中的单个或小簇肿瘤细胞。其中进入血流的又 称循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell, CTC)。原发性肝细胞癌是我国最常见、多发的恶性肿瘤之一。尽管近年来治疗手段不断增加， 但并没有从根本上改变肝癌高死亡率的状况。究其原因，转移复发率高是影响肝癌远期疗效 的主要因素。肝癌细胞可以在很早期播散，大多通过血液和淋巴系统转移，甚至播散到胸水、 腹水等体液中。因此，游离肝癌细胞检测可以作为肝癌早期诊断的一个标记物、作为肝癌细 胞隐匿播散的一个确凿证据以及作为监测疗效和预测复发的一个独立指标。以往通常采用RT-PCR检测白蛋白和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)mRNA来检测血 循环中的肝癌细胞，但RT-PCR法有其固有局限，如特异性不高、操作耗时且难以标准化、不 能估算样本中肿瘤细胞的数目等。流式细胞术(flow cytometry, FCM)是一种采用流式细胞仪对悬浮的细胞或其它生物微 粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。其中，流式细胞分选技术又称荧光激活细 胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)。目前FCM已被用于检测神经 母细胞瘤、血液系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌病人的CTC。相比于RT-PCR法，FCM具有省时、 操作易标准化等优点，并可进行CTC计数，因而可提供更准确的诊断信息。遗撼的是，由于缺乏相应的肝癌细胞表面抗体，迄今未见FCM用于检测和分选游离肝癌 细胞的报道。虽然从理论上讲上皮细胞表面抗体也可被用来检测和分选属于上皮类的肝癌细 胞，但是这些抗体通常只能识别部分肝癌细胞。比如上皮细胞表面抗体Ber-EP4单抗只能 识另ij约67%白勺肝癌细月包(Latza U et al. Ber—EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelial [J]. J Clin Pathol， 1990, 43(3):213-9.)。Ashwell和Morell于20世纪60年代发现，哺乳动物的肝实质细胞膜表面存在一种肝结合蛋白——去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein rec印tor， ASGPR)，又称半乳糖受体 (Morell AG et al. Physical and chemical studies on ceruloplasmin. V. Metabolic studies on sialic acid-free ceruloplasmin in vivo J Biol Chem, 1968，243(1) :155-159.) 。 ASGPR是一种跨膜蛋白，其胞外区含有糖识别区(carbohydrate recognition domain, CRD)，能专一性识别和结合以半乳糖残基和N-乙酰半乳糖胺残基为 端基的糖蛋白(配体)。ASGPR主要表达于哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞表面，密度很高， 每个肝细胞表面可多达500,000个受体。这一特性己被用于设计多种实验研究。.比如，利用 放射性核素标记上述糖蛋白进行肝显像；而以上述糖蛋白为载体介导基因或药物导向肝实质 细胞，则是肝靶向治疗领域的一个研究命题。但至今未有基于ASGPR检测或分选游离肝癌细 胞的报道。因此，本领域迫切需要开发一种敏感性高、特异性强、易于操作，而又对受试者无损伤 的肝癌细胞的检测和分选方法。发明内容本发明的目的是提供一种游离肝癌细胞的检测和分选方法，以及本发明方法所分选到的 肝癌细胞。本发明的第一方面提供了一种肝癌细胞的检测方法，所述检测方法包括以下步骤(a) 采集样品；(b) 从样品中分离单个核细胞；(c) 以与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异结合的物质A与单个核细胞中的肝癌细胞结合，形成复合物B;(d) 以荧光素间接标记复合物B;(e) 用流式细胞仪检测样品中的肝癌细胞。 上述物质A选自ASGPR的配体或抗体。上述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度细胞分离法。 上述样品选自骨髓、血液或其他体液。 上述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。上述物质A为ASGPR的配体，上述ASGPR的配体为可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白、 糖、多肽或核酸。上述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为以半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白，优选去唾液酸胎球蛋白。上述物质A为ASGPR的配体，上述步骤(c)中ASGPR的配体与生物素相连接。 上述步骤(d)中采用荧光素-链霉亲和素或荧光素-生物素抗体标记复合物B。 上述步骤(c)中去唾液酸胎球蛋白反应浓度为0. 1-0. 8mg/ml ，较佳的反应浓度为0. 4-0. 8mg/ml ，优选0. 4mg/ml 。在另一实施例中，上述物质A为ASGPR胞外区的单克隆抗体，如小鼠抗人ASGPR单抗、兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。优选小鼠抗人ASGPR单抗。 所述步骤(d)中采用荧光素-二抗标记复合物B。上述步骤(c)中ASGPR单抗的反应浓度为0. 1-5.0ng/ml，较佳的反应浓度为2. 0-5. 0 y g/ml ，优选2. 0 ti g/ml 。上述步骤(e)采用FACSAria流式细胞仪(Becton Dickinson公司)及CellQuest软件 检测分析。本发明的第二方面提供了一种肝癌细胞的分选方法，所述分选方法包括以下步骤(a) 采集样品；(b) 从样品中分离单个核细胞；(c) 以与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异结合的物质A与单个核细胞中的肝癌细胞结 合，形成复合物B;(d) 以荧光素间接标记复合物B;(e) 用流式细胞仪分选样品中的肝癌细胞。 上述物质A选自ASGPR的配体或抗体。上述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度细胞分离法。 上述样品选自骨髓、血液或其他体液。 上述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。上述物质A为ASGPR的配体。上述ASGPR的配体为可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白、 糖、多肽或核酸。所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为以半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺 残基为端基的糖蛋白，优选去唾液酸胎球蛋白。上述物质A为ASGPR的配体，上述步骤(c)中ASGPR的配体与生物素相连接。 上述步骤(d)中采用荧光素-链霉亲和素或荧光素-生物素抗体标记复合物B。 上述步骤(c)中去唾液酸胎球蛋白反应浓度为0. 1-0. 8mg/ml ，较佳的反应浓度为 0. 4-0. 8mg/ml,优选0. 4mg/ml 。在另一实施例中，上述物质A为ASGPR胞外区的单克隆抗体，如小鼠抗人ASGPR单抗、 兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。优选小鼠抗人ASGPR单抗。
上述步骤(c)中ASGPR单抗的反应浓度为O. 1-5.0 ug/ml，较佳的反应浓度为2. 0-4. 0 U g/ml ，优选2. 0 y g/ml 。
上述步骤(d)中采用荧光素-二抗标记复合物B。
上述步骤(e)采用FACSAria流式细胞仪(Becton Dickinson公司)及CellQuest软件进 行分选。
本发明的第三方面提供了上述分选方法分选到的肝癌细胞。
按照上述分选方法分选到的肝癌细胞完整无破坏。所述肝癌细胞可以用于形态学观察、 免疫细胞化学染色、免疫荧光染色，从而进行鉴定、计数；并可用于培养扩增以及进一步的 分子生物学研究。
发明人利用ASGPR配体或针对ASGPR胞外区的单克隆抗体，创建了基于ASGPR的流式细 胞仪检测和分选游离肝癌细胞的技术，从而解决了由于缺乏特异的肝癌细胞表面单克隆抗体 所面临的困扰。由于正常肝细胞不会进入血循环或体液中，只有肝癌细胞才有可能，因此按 照本发明方法检测和分选到的细胞就是肝癌细胞。上皮细胞抗体Ber-EP4单抗只能识别约67% 的肝癌细胞，而ASGPR配体或针对ASGPR胞外区的单抗则可识别绝大多数肝癌细胞。利用本 发明方法检测和分选游离肝癌细胞，敏感性高，特异性强，易于操作，对受试者几乎无损伤。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1.氨基生物素试剂Sulfo-NHS-1C-Biotin与蛋白质的反应原理。 图2.不同浓度的生物素化去唾液酸胎球蛋白标记H印3B细胞的流式图。 A、 B、 C中，生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度依次为O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml。 D 中，生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为0. 4mg/ml。
图3.不同浓度的小鼠抗人ASGPR单抗标记H印3B细胞的流式图。
A、 B、 C中，小鼠抗人ASGPR单抗浓度依次为1.0ug/ml、 2. 0yg/ml、 4. 0ug/tnl。 D中， 小鼠抗人ASGPR单抗浓度为2. 0ug/ml。
图4.采用ASGPR配体检测肝癌患者外周血游离肝癌细胞的流式图。 图5.采用ASGPR抗体检测肝癌患者外周血游离肝癌细胞的流式图。 图6.采用ASGPR配体从肝癌患者外周血中分选到的游离肝癌细胞。图7.采用ASGPR抗体从肝癌患者外周血中分选到的游离肝癌细胞。
具体实施方式
如本文所述"二抗"，通常也称第二抗体，是相对第一抗体而言的。在本发明中，ASGPR 为抗原，ASGPR抗体为第一抗体，针对ASGPR抗体的抗体是二抗。在本发明中， 一抗为小鼠 抗人ASGPR单抗，则二抗就是抗小鼠抗体；如果一抗为兔抗人ASGPR单抗，则二抗就是抗兔 抗体。本发明所述其他体液为除血液外的常规体液，包括但不限于淋巴液、胸水、腹水。本文所述"反应浓度"为步骤(c)中与肝癌细胞上的ASGPR结合时，ASGPR的配体或者抗 体的初始浓度。在具体实施例中，为去唾液酸胎球蛋白的初始浓度或小鼠抗人ASGPR单抗的 初始浓度。在本发明中，分别通过在分离到的单个核细胞中加入无血清DMEM培养液或PBS洗 液来调节ASGPR的配体或抗体的初始浓度。本发明所述"多肽"是指由3-50个氨基酸通过酰胺键(也称肽键)相互连接而成的化合 物。氨基酸数目在50个以上的多肽称为蛋白质。本发明所述"糖"包括多糖和单糖。单糖如半乳糖或N-乙酰半乳糖等，均可以作为配体 与肝癌细胞上的ASGPR结合。本发明所述步骤(b)中从样品中分离单个核细胞的方法有多种方法。如可以采用Ficoll或Percoll等密度梯度液分离单个核细胞，也可以采用红细胞裂解液裂解样品中的红细胞，再离心获得单个核细胞。本发明所述荧光素间接标记指，ASGPR的抗体先与目的细胞(即肝癌细胞)上的ASGPR结合，然后用荧光素-二抗与ASGPR的抗体结合；或者先用生物素化的ASGPR的配体与目的细胞(即肝癌细胞)上的ASGPR结合，再用荧光素-生物素抗体或荧光素-链霉亲和素与目的细胞上的生物素结合。因此间接标记复合物B后，其结构为目的细胞-ASGPR的抗体-二抗-荧光素、目的细胞-ASGPR的配体-生物素-生物素抗体-荧光素或目的细胞-ASGPR的配体-生物素-链霉亲和素-荧光素。本发明所述荧光素选自异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗达明、四甲基异硫氰酸罗达 明或藻红蛋白(PE)。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重 量计算。
实施例l生物素化去唾液酸胎球蛋白的制备
主要材料氨基生物素化试剂Sulfo-NHS-1C-Biotin (Pierce)，去唾液酸胎球蛋白 (Sigma) ， BCA蛋白定量试剂盒(Pierce) ， L-赖氨酸(国药)，离心超滤管(截留分子量 50, 000) (Millipore)。
实验歩骤去唾液酸胎球蛋白与氨基生物素化试剂反应按照产品说明书进行。氨基生物 素化试剂Sulfo-NHS-1C-Biotin能选择性地和蛋白质中的游离氨基发生反应，反应式如图1 所示。
反应结束后，将反应液移入离心超滤管，25°C, 4000g，离心20min。然后在离心管中加 入双蒸水和L-赖氨酸，使总体积为3ml， L-赖氨酸终浓度为0. 08mg/ml，室温放置lh。再将 离心超滤管于25°C， 4000g，离心20niin。吸出超滤管中残留液体，加适量双蒸水稀释。用 BCA蛋白定量试剂盒按照说明书操作，测定生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度。最后用双蒸水 调整去唾液酸胎球蛋白浓度为3mg/ml， 0.22um滤器无菌过滤后50ul/管分装，-2(TC保存。
实施例2确定ASGPR配体和抗体的理想流式工作浓度
1.以下实验用流式细胞仪验证生物素化去唾液酸胎球蛋白与ASGPR的反应性，及确定生 物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作浓度。
主要材料PE标记的小鼠抗人CD45单抗(IgGl)、 PE标记的小鼠同型单抗(IgGl) 、 FITC 标记的链霉亲和素，均购自晶美公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自制。PBS洗液 (PBS+1%FBS),自配。
实验步骤
1) 计数500万个H印3B肝癌细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，20°C, 300g，离心5min，弃上清，用550 u 1无血清DMEM培养液重悬，充分混匀，100nl/管，分装 入5个EP管，依次编为1 5号。l号管为空白对照管，2号管为同型对照管，3 5号管为 测试管。
2) 向3 5号管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3 5号管生物素化去唾液酸胎 球蛋白的终浓度依次为0. 2mg/ml、 0.4mgM、 0.8mg/ml'终体积均为150nl (体积不足部分 用无血清DMEM培养液补充)。向1、 2号管中各加入无血清DMEM培养液50ul。 1 5号管37。C孵育lh。
3) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，2(TC, 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
4) 向1 5号管中各加入100u 1无血清DMEM培养液。向2 5号管中各加入10 y 1 FITC 标记的链霉亲和素。向1号管中加入10 u 1无血清DMEM培养液。1 5号管室温避光孵育20min。
5) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。 每管500ul PBS洗液重悬。
6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果
图2中，A、 B、 C所对应的生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度依次为0.2mg/ml、 0.4mg/ml、
0. 8mg/ml。从图中可以看出，当生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度从0. 2mg/ml增加到0. 4mg/ml 时，H印3B细胞荧光强度也相应增加；而当浓度继续增加到0.8mg/ml时，H印3B细胞荧光强 度与浓度为0. 4mg/ml时相比并未增加。可见，生物素化去唾液酸胎球蛋白与ASGPR的反应性 好，当生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为0. 4mg/ml时，H印3B细胞表面的ASGPR即已饱和； 而当浓度为0.8tng/ml时，生物素化去唾液酸胎球蛋白是过量的。故选择0.4mg/ml作为生物 素化去唾液酸胎球蛋白的候选流式工作浓度。
以下实验进一步评价0. 4mg/ml是否为生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作浓度。 实验步骤
1) 计数250万个HL-60细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)和100万个 H印3B肝癌细胞，混合后2(TC， 300g,离心5min，弃上清，用350 u 1无血清DMEM培养液重 悬，充分混匀，100wl/管，分装入3个EP管，依次编为1 3号。l号管为空白对照管，2号 管为同型对照管，3号管为测试管。
2) 向3号管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3号管生物素化去唾液酸胎球蛋白 的终浓度为0.4mg/ml，终体积均为150ul (体积不足部分用无血清DMEM培养液补充)。向
1、 2号管中各加入无血清DMEM培养液50ul 。 1 3号管37'C孵育lh。
3) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
4) 向1 3号管中各加入10(Hi 1无血清DMEM培养液。向3号管中各加入l(Hi 1 PE标记 的小鼠抗人CD45单抗和10ul FITC标记的链霉亲和素。向2号管中加入10ul PE标记的小 鼠同型单抗和10li 1 FITC标记的链霉亲和素。向1号管中加入20y 1无血清DMEM培养液。1 3号管室温避光孵育20min。
5) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液，20'C, 300g，离心5min，弃上清。重复1次。每管500u 1 PBS洗液重悬。6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果图2 (D)中，横坐标为ASGPR-FITC，纵坐标为CD45-PE。 CD45-ASGPR+定义为H印3B细胞， CD45+ASGPR—定义为HL-60细胞，CD45+ASGPR+定义为非特异性染色细胞。从图中可以看出，当 生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为0. 4mg/ml时，H印3B细胞被充分标记，且无非特异性染色。 可见，0.4mg/ml为生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作浓度。2、流式细胞仪验证小鼠抗人ASGPR单抗与ASGPR胞外域的反应性，及确定小鼠抗人ASGPR 单抗的理想流式工作浓度。主要材料小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，为法国Dendritics公司产品。小鼠同型单抗 (IgGl) 、 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体、PE标记的大鼠抗人CD45单抗(IgG2a)、 PE标 记的大鼠同型单抗(IgG2a)，均购自晶美公司。PBS洗液(PBS+1%FBS)，自配。FACSAria 流式细胞仪，为Becton Dickinson公司产品。实验步骤-1) 计数500万个H印3B肝癌细胞，20。C， 300g，离心5min，弃上清，用550y 1 PBS洗 液重悬，充分混匀，100y 1/管，分装入5个EP管，依次编为1 5号。l号管为空白对照管， 2号管为同型对照管，3 5号管为测试管。2) 向3 5号管中加入小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，使得3 5号管小鼠抗人ASGPR单抗 的终浓度依次为1.0ug/ml、 2.0ug/ml、 4. 0 n g/ml ，终体积均为110yl。向1号管中加入 PBS洗液10y 1，向2号管中加入10u 1小鼠同型单抗(IgGl)。l 5号管室温避光孵育20min。3) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，2(TC, 300g，离心5min，弃上清。重复1次。4) 向1 5号管中各加入100y 1 PBS洗液。向2 5号管中各加入10u 1 FITC标记的大 鼠抗小鼠IgGl。向l号管中加入10ul PBS洗液。1 5号管室温避光孵育20min。5) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。 每管500ul PBS洗液重悬。6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果图3中，A、 B、 C所对应的小鼠抗人ASGPR单抗浓度依次为1.0ug/ml、 2.0ug/ml、 4.0 Ug/ml。从图中可以看出，当小鼠抗人ASGPR单抗浓度为2. 0ug/ml和4. Oixg/ml时，H印3B细胞荧光强度也相应增加；而当浓度继续增加到4. 0ug/ml时，H印3B细胞荧光强度与浓度 为2. Oug/ml时相比并未增加。可见，小鼠抗人ASGPR单抗与ASGPR的反应性好，当小鼠抗 人ASGPR单抗浓度为2. 0 p g/ml时，H印3B细胞表面的ASGPR即已饱和；而当浓度为4. 0 u g/ml 时，小鼠抗人ASGPR单抗是过量的。故选择2. Oug/ml作为小鼠抗人ASGPR单抗的候选流式 工作浓度。
以下实验进一步评价2. 0 u g/ml是否为小鼠抗人ASGPR单抗的理想流式工作浓度。 实验步骤
1) 计数250万个HL-60细胞和100万个H印3B肝癌细胞，混合后20。C， 300g，离心5min， 弃上清，用350n 1 PBS洗液重悬，充分混匀，100ul/管，分装入3个EP管，依次编为1 3 号。l号管为空白对照管，2号管为同型对照管，3号管为测试管。
2) 向3号管中加入小鼠抗人ASGPR单抗，使终浓度为2. Oug/ml，终体积为110ul。向 1号管中加入PBS洗液10ul，向2号管中加入10"1小鼠同型单抗(IgGl) 。 1 3号管室 温避光孵育20min。
3) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
4) 向1 3号管中各加入100p1PBS洗液。向3号管中各加入10ul PE标记的小鼠抗人 CD45单抗(IgG2a)和10ul FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。向2号管中加入10pl PE 标记的大鼠同型单抗(IgG2a)和10ulFITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。向1号管中加入 20ylPBS洗液。1 3号管室温避光孵育20min。
5) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液，2CTC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。 每管500yl PBS洗液重悬。
6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果
图3 (D)中，横坐标为ASGPR-FITC,纵坐标为CD45-PE。 CD45-ASGPR+定义为H印3B细胞， CD45+ASGPR—定义为HL-60细胞，CD45+ASGPR+定义为非特异性染色细胞。从图中可以看出，当 生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为2. Opg/ml时，H印3B细胞被充分标记，且无非特异性染 色。可见，2.0yg/ml是小鼠抗人ASGPR单抗的理想流式工作浓度。
实施例3采用ASGPR配体检测游离肝癌细胞
即基于生物素化去唾液酸胎球蛋白的流式细胞仪检测游离肝癌细胞的技术。采用Ficoll 分离外周血单个核细胞，然后先用生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞膜上的ASGPR结合，再用生物素抗体-FITC (也可以用链霉亲和素-FITC)与生物素化去唾液酸胎球 蛋白结合，从而使肝癌细胞被间接荧光标记。接着用小鼠抗人CD45-PE标记外周血单个核细 胞。然后用流式细胞仪即可检测到标本中是否含有游离肝癌细胞(CD45—ASGPR+定义为肝癌细 胞，CD45+ASGPR—定义为血细胞)。
主要材料10ml肝癌患者志愿者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-Paque Plus,购自GE Healthcare。 PE标记的小鼠抗人CD45单抗(IgGl) 、 PE标记的小鼠同型单抗(IgGl) 、 FITC 标记的链霉亲和素，均购自晶美公司。无血清DMEM培养液，购自Gibco公司。PBS洗液(含 0. 5%BSA、80U/ml肝素)，自配。FACSAria流式细胞仪、Trucount绝对计数管、鞘流液FACSFlow， 均为Becton Dickinson公司产品。
实验步骤
(1) Ficoll分离外周血单个核细胞
1) 将患者10ml肝素抗凝血、0. 4ml肝素、10mlPBS洗液于50ml离心管中混匀，平铺于 14mlFicoll上，18°C， 600g，离心25min。
2) 吸弃上层血清。
3) 吸取单个核细胞层，置于15ml离心管中。
4) 加3倍体积PBS洗液，18°C， 300g，离心10min。
5) 吸弃上清，8ml PBS洗液重悬，18'C， 300g，离心10min。
6) 彻底吸弃上清。
(2) 流式细胞仪检测游离肝癌细胞
1) 将上述步骤所获患者单个核细胞用200 ul PBS洗液重悬，100nl/每管分装入2个 L5ml EP管中，分别标为同型对照管和测试管。
2) 向测试管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，并加入PBS洗液，使生物素化去唾液酸 胎球蛋白的终浓度为0. 4mg/ml，终体积为150u 1。向同型对照管中加入50 p 1 PBS洗液。 37。C孵育lh。
3) 每管各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
4) 每管各用lO(Hil PBS洗液重悬细胞，测试管中加入10ul PE标记的小鼠抗人CD45 单抗和10ul FITC标记的链霉亲和素。同型对照管中加入10nl PE标记的小鼠同型单抗和 10 ul FITC标记的链霉亲和素。室温避光孵育20min。
5) 各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
6) 毎管500u 1 PBS洗液重悬，并移入2个Trucount绝对计数管中，混匀，相应标为同型对照管和测试管。7) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果如图4, CD45-ASGPR+定义为播散肝癌细胞，CD45'ASGPR—定义为血细胞。 同型对照管未检测到CD45—ASGPR+细胞(游离肝癌细胞)(图4A)。测试管检测到11个CD45—ASGPR+细胞(游离肝癌细胞)(图4B)，即该肝癌患者5ml血中 含ll个游离肝癌细胞。实施例4采用ASGPR抗体检测游离肝癌细胞即基于ASGPR单抗的流式细胞仪检测游离肝癌细胞的技术。采用Ficoll分离外周血单个 核细胞，然后先用小鼠抗人ASGPRIgGl与肝癌细胞膜上的ASGPR结合，再用大鼠抗小鼠IgGl 抗体-FITC与小鼠抗人ASGPR IgGl结合，从而使肝癌细胞被间接荧光标记。接着用大鼠抗人 CD45-PE标记外周血单个核细胞。然后用流式细胞仪即可检测到标本中是否含有游离肝癌细 胞(CD45—ASGPR+定义为肝癌细胞，CD45+ASGPR—定义为血细胞)。主要材料10ml肝癌患者志愿者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-Paque Plus,购自GE Healthcare。小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，为法国Dendritics公司产品。小鼠抗人同型单抗 (IgGl) 、 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体、PE标记的大鼠抗人CD45单抗(IgG2a)、 PE标 记的大鼠同型单抗(IgG2a),均购自晶美公司。PBS洗液(含1，BS、 80U/ml肝素)，自配。 FACSAria流式细胞仪、Trucount绝对计数管、鞘流液FACSFlow，均为Becton Dickinson公 司产品。实验步骤(1) Ficoll分离外周血单个核细胞1) 将患者10ml肝素抗凝血、0. 4ml肝素、10mlPBS洗液于50ml离心管中混匀，平铺于 14ml Ficoll上，18°C， 600g，离心25min。2) 吸弃上层血清。3) 吸取单个核细胞层，置于15ml离心管中。4) 加3倍体积PBS洗液，1S。C， 300g，离心10min。5) 吸弃上清，8mlPBS洗液重悬，18°C， 300g，离心10min。6) 彻底吸弃上清。(2) 流式细胞仪检测游离肝癌细胞-.1) 将上述步骤所获患者单个核细胞用200ul PBS洗液重悬，100ul/每管分装入2个 1.5ml EP管中，分别标为同型对照管和测试管。2) 向测试管中加入小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，使小鼠抗人ASGPR单抗的终浓度为2.0 Pg /ml，终体积为110iU。向同型对照管中加入lOul小鼠同型单抗(IgGl)。室温 避光孵育20min。3) 每管各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。4) 每管各用100nl PBS洗液重悬细胞，测试管中加入10ul PE标记的大鼠抗人CD45 单抗(IgG2a)和10y 1 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。同型对照管中加入10ul PE标记 的大鼠同型单抗(IgG2a)禾卩10y 1 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。室温避光孵育20min。5) 每管各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。6) 每管500u 1 PBS洗液重悬，并移入2个Trucount绝对计数管中，混匀，相应标为同 型对照管和测试管。7) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果如图5， CD45-ASGPR+定义为游离肝癌细胞，CD45+ASGPR—定义为血细胞。 同型对照管未检测到CD45—ASGPR+细胞(游离肝癌细胞)(图5A)。测试管检测到15个CD45—ASGPR+细胞(游离肝癌细胞)(图5B)，即该肝癌患者5ml血中 含15个游离肝癌细胞。实施例5利用ASGPR配体分选游离肝癌细胞即基于生物素化去唾液酸胎球蛋白的流式细胞仪分选游离肝癌细胞的技术。采用Ficoll 分离外周血单个核细胞，然后先用生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞膜上的 ASGPR结合，再用抗生物素抗体-FITC (也可以用亲和素-FITC)与生物素化去唾液酸胎球蛋 白结合，从而使肝癌细胞被间接荧光标记。接着用小鼠抗人CD45-PE标记外周血单个核细胞。 然后用流式细胞仪即可分选标本中的游离肝癌细胞(CD45—ASGPR+定义为肝癌细胞，CD45+ASGPR— 定义为血细胞)。主要材料10ml肝癌患者志愿者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-P叫ue Plus,购自GE Healthcare。 PE标记的小鼠抗人CD45单抗(IgGl) 、 PE标记的小鼠同型单抗(IgGl) 、 FITC 标记的链霉亲和素，均购自晶美公司。无血清固EM培养液，购自Gibco公司。PBS洗液(含 0. 5%BSA、 80U/ml肝素)，自配。FACSAria流式细胞仪、分选质控试剂Accudrop Beads、鞘流液FACSFlow，均为Becton Dickinson公司产品。 实验步骤(1) Ficoll分离外周血单个核细胞1) 将患者10ml肝素抗凝血、0. 4ml肝素、10mlPBS洗液于50ml离心管中混匀，平铺于 14mlFico11上，18°C, 600g，离心25min。2) 吸弃上层血清。3) 吸取单个核细胞层，置于15ml离心管中。4) 加3倍体积PBS洗液，18°C， 300g，离心10min。5) 吸弃上清，8ml PBS洗液重悬，18°C， 300g，离心10min。6) 彻底吸弃上清。(2) 流式细胞仪检测游离肝癌细胞1) 将上述步骤所获患者单个核细胞用200 u 1 PBS洗液重悬，100y 1/每管分装入2个 L5ml EP管中，分别标为同型对照管和测试管。2) 向测试管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，并加入PBS洗液，使生物素化去唾液酸 胎球蛋白的终浓度为0. 4mg/ml，终体积为150ti 1。向同型对照管中加入50u 1 PBS洗液。 37。C孵育lh。3) 每管各加入lml PBS洗液'20°C, 300g，离心5tnin，弃上清。重复1次。4) 每管各用100ul PBS洗液重悬细胞，测试管中加入10ul PE标记的小鼠抗人CD45 单抗和10ul FITC标记的链霉亲和素。同型对照管中加入10yl PE标记的小鼠同型单抗和 10yl FITC标记的链霉亲和素。室温避光孵育20min。5) 各加入lml PBS洗液，20'C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。6) 每管50(Ui 1 PBS洗液重悬。7) 采用FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件进行分析和分选。 结果-将测试管分选到的细胞悬液离心涂片后，用CK3-6H5抗体进行免疫细胞化学染色，见图 6。如图所示视野中有2个胞桨呈棕黄色(图中为深灰色)的细胞，即肝癌细胞。实施例6 利用ASGPR抗体分选游离肝癌细胞即基于ASGPR单抗的流式细胞仪分选游离肝癌细胞的技术。采用Ficoll分离外周血单个 核细胞，然后先用小鼠抗人ASGPRIgGl与肝癌细胞膜上的ASGPR结合，再用大鼠抗小鼠IgGl抗体-FITC与小鼠抗人ASGPR IgGl结合，从而使肝癌细胞被间接荧光标记。接着用大鼠抗人 CD45-PE标记外周血单个核细胞。然后用流式细胞仪即可分选标本中的游离肝癌细胞 (CD45ASGPR+定义为肝癌细胞，CD45'ASGPR—定义为血细胞)。主要材料10ml肝癌患者志愿者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-P叫ue Plus,购自GE Healthcare。小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，为法国Dendritics公司产品。小鼠抗人同型单抗 (IgGl) 、 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体、PE标记的大鼠抗人CD45单抗(IgG2a)、 PE标 记的大鼠同型单抗(IgG2a)，均购自晶美公司。PBS洗液(含1，BS、 80U/ml肝素)，自配。 FACSAria流式细月包仪、分选质控试齐U Accudrop Beads、鞘流液FACSFlow，均为Becton Dickinson公司产品。实验步骤(1) Ficoll分离外周血单个核细胞1) 将患者10ml肝素抗凝血、0.4ml肝素、10mlPBS洗液于50ml离心管中混匀，平铺于 14ml Ficoll上，1S。C， 60。g，离心25min。2) 吸弃上层血清。3) 吸取单个核细胞层，置于15ml离心管中。4) 加3倍体积PBS洗液，18°C， 300g，离心10min。5) 吸弃上清，8mlPBS洗液重悬，18°C， 300g，离心10min。6) 彻底吸弃上清。(2) 流式细胞仪检测游离肝癌细胞1) 将上述步骤所获患者单个核细胞用200ul PBS洗液重悬，100ul/每管分装入2个 L5ml EP管中，分别标为同型对照管和测试管。2) 向测试管中加入小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，使小鼠抗人ASGPR单抗的终浓度为2.0 Ug /ml，终体积为110 ul。向同型对照管中加入10 ul小鼠同型单抗(IgGl)。室温 避光孵育20min。3) 每管各加入lml PBS洗液，20。C， 300g,离心5min，弃上清。重复1次。4) 每管各用100ul PBS洗液重悬细胞，测试管中加入10ul PE标记的大鼠抗人CD45 单抗(IgG2a)和10ul FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。同型对照管中加入10ul PE标记 的大鼠同型单抗(IgG2a)禾UlOu 1 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。室温避光孵育20min。5) 每管各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。6) 每管500u 1 PBS洗液重悬。7)采用FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件进行分析和分选。 结果-
将测试管分选到的细胞悬液离心涂片后，用CK3-6H5抗体进行免疫细胞化学染色，见图 7。如图所示视野中有3个胞浆呈棕黄色(图中为深灰色)的细胞，即肝癌细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作 为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种肝癌细胞的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(a)采集样品；(b)从样品中分离单个核细胞；(c)以与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异结合的物质A与单个核细胞中的肝癌细胞结合，形成复合物B；(d)以荧光素间接标记复合物B；(e)用流式细胞仪检测样品中的肝癌细胞。
2. 权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述物质A选自ASGPR的配体或抗体。
3. 权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度细 胞分离法。
4. 权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品选自骨髓、血液或其他体液。
5. 权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。
6. 权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR的配体，所述ASGPR的配 体为可与ASGPR的糖识别区(CRD)特异结合的蛋白、糖、脂类、多肽或核酸。
7. 权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为以半 乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白。
8. 权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为去唾 液酸胎球蛋白。
9. 权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR胞外区的抗体。
10. 权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
11. 权利要求l-8任一权利要求所述的检测方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR的配体， 所述步骤(c)中ASGPR的配体与生物素相连接，步骤(d)中采用荧光素-链霉亲和素或荧光 素-生物素抗体标记复合物B。
12. 权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(c)中去唾液酸胎球蛋白的反应浓 度为0. 1-0. 8mg/ml。
13. 权利要求11或12所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(c)中去唾液酸胎球蛋白的 反应浓度0. 4-0.8mg/ml。
14. 权利要求10所述的检测方法,其特征在于，所述抗体为小鼠抗人ASGPR单抗、兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。
15. 权利要求14所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(d)中采用荧光素-二抗标记复合 物B。
16. 权利要求14所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(c)中ASGPR单抗的反应浓度为 0. 1-5. 0u g/ml。
17. 权利要求16所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(c)中ASGPR单抗的反应浓度为 2. 0-4. g/ml。
18. 权利要求17所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(c)中抗体为小鼠抗人ASGPR单抗。
19. 一种肝癌细胞的分选方法，其特征在于，包括以下步骤(a) 采集样品；(b) 从样品中分离单个核细胞；(c) 以与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异结合的物质A与单个核细胞中的肝癌细胞结合， 形成复合物B;(d) 以荧光素间接标记复合物B;(e) 用流式细胞仪分选肝癌细胞。
20. 权利要求19所述的分选方法，其特征在于，所述物质A选自ASGPR的配体或抗体。
21. 权利要求19所述的分选方法，其特征在于，所述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度 细胞分离法。
22. 权利要求19所述的分选方法，其特征在于，所述样品选自血液、骨髓或其他体液。
23. 权利要求22所述的分选方法，其特征在于，所述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。
24. 权利要求20所述的分选方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR的配体，所述ASGPR的 配体为可与ASGPR的糖识别区(CRD)特异结合的蛋白、糖、多肽或核酸。
25. 权利要求24所述的分选方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为以 半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白。
26. 权利要求25所述的分选方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为去 唾液酸胎球蛋白。
27. 权利要求26所述的分选方法，其特征在于，所述步骤(c)中去唾液酸胎球蛋白的反应浓 度为0. 1-0. 8mg/ml。
28. 权利要求27所述的分选方法，其特征在于，所述步骤(c)中去唾液酸胎球蛋白的反应浓 度为0. 4-0. 8mg/ml。
29. 权利要求20所述的分选方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR胞外区的单克隆抗体。
30. 权利要求29所述的分选方法，其特征在于，所述ASGPR胞外区的抗体为小鼠抗人ASGPR 单抗、兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。
31. 权利要求19-23任一权利要求所述的分选方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR的配体， 所述步骤(c)中ASGPR的配体与生物素相连接，步骤(d)中采用荧光素-链霉亲和素或荧光 素-生物素抗体标记复合物B。
32. 权利要求30所述的分选方法，其特征在于，所述步骤(d)中采用荧光素-二抗标记复合 物B。
33. 权利要求30所述的分选方法，其特征在于，所述步骤(c)中ASGPR单抗的反应浓度为 0. 1-5. Ou g/ml。
34. 权利要求33所述的分选方法，其特征在于，所述步骤(c)中ASGPR单抗的反应浓度为 2. 0-4. 0 u g/ml 。
35. 权利要求35所述的分选方法，其特征在于，所述步骤(c)中抗体为小鼠抗人ASGPR单抗。
36. 权利要求19-30、 32-35任一权利要求所述的分选方法分选到的肝癌细胞。
37. 权利要求31所述的分选方法分选到的肝癌细胞。
全文摘要
本发明提供了一种游离肝癌细胞的检测方法，所述检测方法基于肝癌细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体，利用去唾液酸糖蛋白受体的配体或者抗体与肝癌细胞结合形成复合物，然后用荧光素间接标记所述复合物，再用流式细胞仪对样品中的肝癌细胞进行检测计数或分选。该方法可用于肝癌的诊断、转移复发预测及疗效监测等。本发明方法可以检测和分选游离肝癌细胞，其敏感性高、特异性好，且操作简便。
文档编号G01N33/48GK101303352SQ20081004019
公开日2008年11月12日 申请日期2008年7月3日 优先权日2008年7月3日
发明者康晓燕, 文 徐, 施乐华, 殷正丰 申请人:中国人民解放军第二军医大学