抗肝癌干细胞单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗肝癌干细胞单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC?No.8800的小鼠杂交瘤细胞4P-120分泌产生，该单克隆抗体经实验证实，能够特异性结合肝癌细胞并特异性识别肝癌组织，其所识别的抗原在人肝癌的癌组织中高表达而在癌旁组织中不表达或低表达，并在细胞增殖过程中存在阳性向阴性的分化以及阴性向阳性的逆分化；相比抗原低表达细胞，抗原高表达细胞有更强的增殖能力、克隆形成能力、成球能力、划痕迁移能力和侵袭转移能力；因此，本发明为靶向肿瘤干细胞的肝癌治疗提供了有应用前景的功能性单克隆抗体，其可以用于制备肝癌治疗药物。
【专利说明】抗肝癌干细胞单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其病死率居恶性肿瘤的第3位，肝癌患者5年生存率仅有14%~30%。原发性肝癌具有发病隐袭、病死率高的特点，早期诊断及防止复发对预后意义重大。自单克隆抗体技术问世后，人们试图通过应用抗肝癌单克隆抗体提高肝癌的早期诊断率及治疗效果，但目前获得的抗肝癌单克隆抗体的特异性尚不令人满意，由于肿瘤异质性的存在，又使其临床应用受到一定影响。因此，有必要寻找更好的抗肝癌特异性单克隆抗体，以提高对肝癌诊治的特异性。近年来，肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)已成为肿瘤研究的新热点。由于CSC是肿瘤转移、复发和耐药的根源，因此，建立靶向CSC的治疗新策略有望克服临床上现有治疗手段的缺陷，改善肝癌患者的预后。发明人所在课题组前期基于肿瘤干细胞同胚胎干细胞的相似性，以Nanog作为分选标记，构建了以Nanog为启动子调控GFP表达的慢病毒报告系统Lv-Nanog (p) -GFP,分选获得的Nanog阳性的肝癌细胞经体内外试验证实具有肿瘤干细胞特性(Hepatology2012)。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的在于以Nanog阳性的肝癌细胞作为免疫原及筛选抗原，通过单克隆抗体技术筛选出针对肝癌干细胞的单克隆抗体，并对该单克隆抗体针对的抗原进行研究，以期为靶向肿瘤干细胞的肝癌治疗提供有应用前景的功能性单克隆抗体。
[0004]经研究，本发明提供如下技术方案:
[0005]1.抗肝癌干细胞单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC N0.8800的小鼠杂交瘤细胞4P-120分泌产生。
[0006]2.抗肝癌干细胞单克隆抗体在制备肝癌治疗药物中的应用。
[0007]本发明的有益效果在于:本发明以Nanog阳性的肝癌细胞作为免疫原及筛选抗原，通过单克隆抗体技术筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株4P-120，其分泌的单克隆抗体经实验证实，能够特异性结合肝癌细胞并特异性识别肝癌组织；该单克隆抗体所识别的抗原在人肝癌的癌组织中高表达而在癌旁组织中不表达或低表达，并在细胞增殖过程中存在阳性向阴性的分化以及阴性向阳性的逆分化；相比抗原低表达细胞，抗原高表达细胞有更强的增殖能力、克隆形成能力、成球能力、划痕迁移能力和侵袭转移能力；因此，本发明为靶向肿瘤干细胞的肝癌治疗提供了有应用前景的功能性单克隆抗体，其可以用于制备肝癌治疗药物。
[0008]生物材料保藏 [0009]小鼠杂交瘤细胞4P-120于2014年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.8800。【专利附图】
【附图说明】
[0010]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0011]图1为鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120与不同细胞系的反应情况。
[0012]图2为鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120与人肝癌组织及正常肝脏组织的反应情况。
[0013]图3为鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120所识别的抗原在人肝癌组织和癌旁组织中的表达情况。
[0014]图4为鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogros单克隆抗体4P-120所识别的抗原在细胞增殖过程中的表达变化情况。其中，A、B为从PLC-Nanog细胞中分别分选4P-120抗原与Nanog双阴性细胞(P9)、4P-120抗原单阳性细胞(P8)、4P-120抗原与Nanog双阳性细胞(P6)、4P-120抗原单阴性细胞(P7)这四个细胞群体；(:、03、？为对分选出的？9、？8、？7、？6细胞群体进行流式回测的结果； G、H、1、J为培养7d后对P9、P8、P7、P6细胞群体进行4P-120抗原分化情况的流式检测结果。
[0015]图5为4P-120抗原高表达细胞有更强的增殖能力。
[0016]图6为4P-120抗原高表达细胞有更高的克隆形成能力。
[0017]图7为4P-120抗原高表达细胞有更高的成球能力。
[0018]图8为4P-120抗原高表达细胞有更高的划痕迁移能力。
[0019]图9为4P-120抗原高表达细胞有更高的侵袭转移能力。
【具体实施方式】
[0020]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0021]一、鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体的制备
[0022]1、鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras杂交瘤细胞株的获得
[0023]将培养的PLC-NanograsNanogneg细胞(即以Nanog为启动子调控GFP表达的肝癌细胞PLC)流式分选出PLC-Nanogros细胞(即Nanog阳性的PLC细胞)，作为免疫原；取体重14~18g的4~6周龄健康BALB/c小鼠，于每只小鼠腹腔内注射I X IO6个PLC-Nanogpos细胞进行首次免疫，之后每间隔2周再以相同方法加强免疫2次。于末次加强免疫后第10天，取小鼠尾血，分离血清，采用细胞间接酶联免疫吸附(ELISA)法检测抗体效价。
[0024]ELISA法检测抗体效价具体如下^fPLC-Nanogras细胞接种于96孔细胞培养板，每孔IX IO4个细胞，次日取出细胞培养板，弃上清后PBS洗3次，用4%多聚甲醛溶液于室温下固定20分钟，PBS漂洗3次，再用10%胎牛血清(FBS)于37°C封闭30分钟，弃上清，不同细胞培养孔分别加入连续10倍稀释的免疫小鼠血清，每孔lOOul，同时以首次免疫前的小鼠血清作为阴性对照，PBS作为空白对照，37 °C孵育I小时后弃上清，PBST洗板5次，再加入用封闭液按1:1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔lOOul，37°C孵育30分钟，弃去标记抗体溶液，PBST洗板5次，再加入OPD显色液，37°C孵育20分钟后，用2mol/L硫酸终止反应，测量各组OD49tlnm值；实验组OD49tol值大于或等于阴性对照2.1倍者判为阳性，以判为阳性的最高稀释倍数作为抗体效价。
[0025]选取抗体效价最高的一只小鼠，以PLC-Nanogros细胞进行脾脏加强，3天后，取其脾脏制备脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。所得融合细胞用含HAT的1640培养液平均分到5-7个96孔细胞培养板中培养，于培养第7天左右，用含HAT的1640培养液全量换液一次，第10天收集培养上清，采用ELISA法进行阳性细胞筛选。
[0026]ELISA法筛选阳性细胞具体如下:于融合细胞培养第9天，将PLC-Nanogras细胞接种于另一 96孔细胞培养板，每孔I X IO4个细胞，第10天取出细胞培养板，弃上清后PBS洗3次，用4%多聚甲醛溶液于室温下固定20分钟，PBS漂洗3次，再用10% FBS于37°C封闭30分钟，弃上清，各孔分别加入不同融合细胞培养上清，每孔lOOul，同时以1:100稀释的免疫小鼠血清作为阳性对照，以SP2/0细胞 培养上清作为阴性对照，37°C孵育I小时，弃上清，PBST洗板5次，再加入用封闭液按1:1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔lOOul，37°C孵育30分钟，弃去标记抗体溶液，PBST洗板5次，再加入OPD显色液，37°C孵育20分钟后，用2mol/L硫酸终止反应，测量各组OD49tlnm值，实验组OD49tol值大于或等于阴性对照2.1倍者判为阳性。
[0027]将阳性孔细胞用含HAT的1640培养液换液培养，次日采用前述ELISA法进行复检，检测出的阳性孔细胞进一步进行单克隆化筛选。
[0028]单克隆杂交瘤细胞株的获得:采用有限稀释法对阳性孔细胞进行亚克隆，每次亚克隆后第七天左右，挑选出单克隆细胞孔并采用前述ELISA法进行检测，保留1-2个阳性孔，重复亚克隆三次以上，直至所有亚克隆均为阳性，对该细胞株进行扩大培养并冻存，即得单克隆杂交瘤细胞株。
[0029]本发明经过四次融合筛选，共获得64株单克隆杂交瘤细胞株，经鉴定确认，命名为4P-120的小鼠杂交瘤细胞能够稳定分泌具有肝癌特异性的单克隆抗体。
[0030]2、鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体的获得
[0031]选取体重20g以上、8周龄以上健康BALB/c小鼠，腹腔注射由液体石蜡与羊毛脂按质量比为3:1混合制得的佐剂，每只0.3ml, 7-10天后将培养的小鼠杂交瘤细胞4P-120用PBS或生理盐水洗一次后注射入小鼠腹腔，7-10天后取小鼠腹水，用ProteinG柱按说明书进行纯化，即得鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120，测定抗体浓度，-20°C保存。
[0032]二、鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体的特异性鉴定
[0033]1、流式细胞仪检测抗体特异性
[0034]选取不同肿瘤细胞系:三种肝癌细胞系(PLC，HU-7，T1224)，二种胃癌细胞系(Xn0422, SGC7901)，二种胶质瘤细胞系(U87，U251)，三种结肠癌细胞系(SW480, SW620，HCT-116)，以及二种正常细胞系(293，L02)和三例正常CIK细胞(CIK-1，CIK-2，CIK-3)，将培养细胞用PBS洗I次，加入小鼠杂交瘤细胞4P-120培养上清，4°C孵育30分钟，PBS洗3次，再加入用PBS按1:500稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG(Sigma公司)，4°C孵育30分钟，PBS洗三次，用PBS400ul复溶后，流式细胞仪检测。
[0035]结果如图1所示，小鼠杂交瘤细胞4P-120培养上清对三种肝癌细胞系均呈明显的高反应，对其它肿瘤细胞系呈低反应，对正常细胞系呈阴性反应，说明由小鼠杂交瘤细胞4P-120分泌的鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120能够特异性结合肝癌细胞。
[0036]2、免疫荧光鉴定抗体特异性
[0037]分别切取人肝癌组织和正常肝脏组织，用冷丙酮固定20分钟，PBS洗4次，再用10% BSA于37°C孵育30分钟，再加入10ug/ml鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120，4°C冰箱过夜，PBS洗5次，再加入用PBS按1:500稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG，37°C孵育50分钟，再加入1:500稀释的DAPI，37°C孵育10分钟，PBS洗5次，40%甘油封片，激光共聚焦检测。
[0038]结果如图2所示，鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogros单克隆抗体4P-120与人肝癌组织呈强阳性反应，而对人正常肝脏组织呈阴性反应，说明该单克隆抗体能够特异性识别肝癌组织。
[0039]3、免疫组化鉴定抗体特异性[0040]分别选取人肝癌的癌组织及癌旁组织石蜡切片，灯下烤20分钟，用二甲苯浸泡2次(每次10分钟)，再依次用无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡5分钟，再依次用蒸馏水、PBS各洗3次，加入抗原修复液，800W微波加热3分15秒，150W微波加热16分钟，冷却后蒸馏水洗3次，再加入3%过氧化氢，37°C孵育15分钟，PBS洗3次，再加入封闭血清，37°C孵育15分钟，再加入5ug/ml鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120，4°C冰箱过夜，PBS洗5次，再加入1:500稀释的山羊抗小鼠IgG(Sigma公司)，37°C孵育25分钟，PBS洗5次，再加入辣根过氧化物酶，37°C孵育15分钟，PBS洗3次，DAB染色，自来水终止反应，苏木素复染约10秒，再依次用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各浸泡5分钟，干燥封片，显微镜下观察。
[0041]结果如图3所示，鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120所识别的抗原在人肝癌的癌组织中高表达，在癌旁组织中不表达或低表达；统计分析结果也显示，单克隆抗体4P-120所识别的抗原在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。
[0042]三、鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体的抗原表达及不同抗原表达量细胞的功能特性检测
[0043]1、鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体所识别的抗原在细胞增殖过程中的表达情况
[0044]将培养的PLC-NanogrosNanogneg细胞用胰酶消化，PBS洗I次，1000rpm离心3分钟，弃上清，加入50ug/ml鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogros单克隆抗体4P_120100ul，室温孵育15分钟，用PBS重悬细胞1000rpm离心洗涤3次，再加入1:1000稀释的Alexa Fluo647标记的抗小鼠IgG，4°C孵育15分钟，用流式细胞仪分选出鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogras单克隆抗体4P-120的抗原高表达细胞群与抗原低表达细胞群，用含10% FBS的DMEM培养基分别培养，并将培养前细胞抗原表达情况与7天后回测结果进行比较。
[0045]结果如图4所示，鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogros单克隆抗体4P-120所识别的抗原在细胞增殖过程中存在阳性向阴性的分化以及阴性向阳性的逆分化。
[0046]2、不同抗原表达量的细胞群体的功能特性检测
[0047]分别取未分选的PLC细胞、从PLC细胞系中分选出的鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogpos单克隆抗体4P-120的抗原高表达细胞、抗原低表达细胞各1000个，接种于96孔细胞培养板中，用含10% FBS的DMEM培养基培养，I~4天后用cell tilter blue细胞增殖检测试剂盒测定细胞增殖能力差异，数据由全波长酶标仪检测560nm/590nm比值获得。结果如图5所示，4P-120抗原高表达细胞具有显著强于未分选PLC细胞、4P-120抗原低表达细胞的增殖能力。
[0048]分别取未分选的PLC细胞、从PLC细胞系中分选出的鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogpos单克隆抗体4P-120的抗原高表达细胞、抗原低表达细胞各50个，接种于24孔细胞培养板中，用含10 % FBS的DMEM培养基培养，2天换液一次，14天后对克隆形成数进行计数并统计。结果如图6所示，相较于单克隆抗体4P-120的抗原低表达细胞，4P-120抗原闻表达细胞有更闻的克隆形成能力。
[0049]分别取未分选的PLC细胞、从PLC细胞系中分选出的鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogpos单克隆抗体4P-120的抗原高表达细胞、抗原低表达细胞各20个，接种于96孔细胞培养板中，用无血清成球培养基培养，14天后对成球数进行计数并统计。结果如图7所示，相较于未分选细胞及4P-120抗原低表达细胞，4P-120抗原高表达细胞有更高的成球能力。
[0050]分别取未分选的PLC细胞、从PLC细胞系中分选出的鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogpos单克隆抗体4P-120的抗原高表达细胞、抗原低表达细胞各IO5个，接种于24孔细胞培养板中，用含2% FBS的低血清培养液培养，待铺满孔板后进行划痕并拍照，24小时后再次拍照，统计划痕的平均宽度愈合情况。结果如图8所示，相较于未分选细胞及4P-120抗原低表达细胞，4P-120抗原高表达细胞有更高的划痕迁移能力。
[0051]分别取未分选的PLC细胞、从PLC细胞系中分选出的鼠抗人肝癌干细胞PLC-Nanogpos单克隆抗体4P-120的抗原高表达细胞、抗原低表达细胞各IO5个，接种于8umtranswell小室中，小室内为200ul无血清DMEM培养基，下层24孔板中为1300ul含10%FBS的DMEM培养基，24小时后对穿孔细胞数进行染色，统计穿孔细胞数。结果如图9所示，相较于4P-120抗原低表达细胞，4P-120抗原高表达细胞有更高的侵袭转移能力。
[0052]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.抗肝癌干细胞单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCN0.8800的小鼠杂交瘤细胞4P-120分泌产生。
2.如权利要求1所述的抗肝癌干细胞单克隆抗体在制备肝癌治疗药物中的应用。
【文档编号】C07K16/18GK103923214SQ201410167963
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】钱程, 洪娟, 赵文旭, 沈俊杰, 单娟娟 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院