技术领域本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种抗禽传染性支气管炎病毒的植物提取物。
背景技术：
现有技术中半夏乙醇提取物具有多种用途，例如：对桃蚜的控制、对人胃癌细胞的影响等等，而其在其它方面是否具有意想不到的效果，仍是我们追溯研究的方向。
技术实现要素：
本发明的目的是研究半夏乙醇提取物在病毒抑制上的效用。本发明一种抗禽传染性支气管炎病毒的植物提取物，包括如下步骤：S1、重组病毒的获得：在禽传染性支气管炎病毒基因组上，通过替换禽传染性支气管炎病毒基因组的3ab片段，以获得能够融合表达荧光素酶的重组病毒IBV-3ab-luc,用该重组病毒IBV-3ab-luc作为指示病毒；S2、对指示病毒的检测：用指示病毒感染细胞，病毒复制一次，表达的荧光素酶的量也相应增加一次，感染后取样，测定荧光素酶的活力，以确定该指示病毒具有与IBV相同的感染力；S3、半夏乙醇提取物的制备：在半夏生长旺盛期，采集半夏茎叶洗净晾干后，切碎称重，用溶剂浸泡切碎后的半夏茎叶后过滤备用；S4、细胞无毒浓度的确定：用乙醇做溶剂，等倍稀释步骤S3中获得的半夏乙醇提取物备用；将备用的不同浓度的半夏乙醇提取物分别加入细胞培养板中后观察细胞生长情况，细胞变形脱落死亡视为该浓度的半夏乙醇提取物对细胞有害，据此选取对细胞无毒影响的半夏乙醇提取物最高浓度进行后续实验；S5、病毒感染：在细胞培养板中，培养细胞，待细胞的覆盖度达到85％以上时，选取步骤S4获得的对细胞无毒影响的浓度的半夏乙醇提取物加入细胞培养液中，24h后，采用步骤S1制备的重组病毒IBV-3ab-luc感染；S6、酶活力的测定与病毒效力的评价：感染24h后，进行荧光素酶活力的检测，明确抗病毒的效力，同时半夏乙醇提取物对重组病毒IBV-3ab-luc抑制效果明显。优选地，步骤S3中，用80％乙醇做溶剂浸泡切碎后的半夏茎叶，7d后，再过滤备用；优选地，上述过滤所采用的过滤器为0.22μm过滤器；优选地，步骤S4中，选用80％乙醇做溶剂；细胞培养板为24孔，且经过48h后观察细胞生长情况；本发明一种抗禽传染性支气管炎病毒的植物提取物，其优点是：通过替换IBV基因组上的3ab片段，以获得能够融合表达荧光素酶的指示病毒，侵染细胞，在病毒侵染细胞的前后过程中，加入半夏乙醇提取物，从而确定加入的半夏乙醇提取物对禽类IBV有抑制作用。具体实施方式本发明的工作原理是：在禽传染性支气管炎病毒(IBV)基因组上，通过替换IBV基因组的3ab片段，获得能够融合表达荧光素酶的重组病毒IBV-3ab-luc,用该重组病毒作为指示病毒，侵染细胞，通过荧光素酶的活力可以明确病毒的复制量。采用这种方法体系，可在病毒侵染细胞的前后过程中，加入某些特定物质，从而确定加入的特定物质是否对禽传染性支气管炎病毒有抑制作用，同时，观测出特定物质对禽传染性支气管炎病毒的抑制效力。一种抗禽传染性支气管炎病毒的植物提取物，包括如下步骤：S1、重组病毒的获得：在禽传染性支气管炎病毒基因组上，通过替换禽传染性支气管炎病毒基因组的3ab片段，以获得能够融合表达荧光素酶的重组病毒IBV-3ab-luc,用该重组病毒IBV-3ab-luc作为指示病毒；S2、对指示病毒的检测：用指示病毒感染细胞，病毒复制一次，表达的荧光素酶的量也相应增加一次，感染后取样，测定荧光素酶的活力，以确定该指示病毒具有与IBV相同的感染力。S3、半夏乙醇提取物的制备：在半夏生长旺盛，采集半夏茎叶洗净晾干后，切碎称重，用80％乙醇做溶剂浸泡切碎后的半夏茎叶，7d后，用过滤器过滤后备用；S4、细胞无毒浓度的确定：用80％乙醇做溶剂，2倍稀释步骤S3中获得的半夏乙醇提取物,半夏乙醇提取物的初始浓度为0.8534g/mL,稀释后浓度依次为：0.4267g/mL、0.2134g/mL和0.1067g/mL；将备用的不同浓度的6μL半夏乙醇提取物分别加入盛有DF-1细胞(鸡胚成纤维细胞,培养液为DMEM,血清为FBS)的24孔细胞板中，48h后观察细胞的生长情况，细胞变性脱落死亡视为该浓度的半夏乙醇提取物对细胞有害，据此选取对细胞无毒影响的半夏乙醇提取物浓度(0.2134g/mL)进行后续实验；S5、病毒感染：在24孔细胞培养板中，用500μLDMEM培养DF-1细胞，待细胞的覆盖度达到85％以上时，进行试验，选取步骤S4获得的对细胞无毒的最大浓度半夏乙醇提取物2-6μL，在指示病毒侵染细胞前24h和病毒侵染细胞2h后，分别加入到细胞培养液中(其中提取物处理细胞24h后，换掉培养液，加入500μL的DMEM，再行病毒感染)；S6、酶活力的测定与病毒效力的评价：病毒感染24h后，处理细胞，进行荧光素酶活力的检测，明确抗病毒的效力。(具体结果见下表)，半夏乙醇提取物在病毒感染细胞前24h处理细胞后，病毒再感染受阻明显(酶活力与对照相比，比值达到255897)，而病毒侵染细胞2h之后，再用半夏提取物处理，抑制效果很差(比值为39)，综合结果表明：半夏乙醇提取物具有预防病毒侵染的作用。下面结合具体实施例为本发明作进一步说明：实施例一：半夏乙醇提取物对鸡传染性支气管炎病毒的性能测定：S1、重组病毒的获得：选取感染有传染性支气管炎病毒的鸡，获取鸡上传染性支气管炎病毒基因组，再通过替换鸡的传染性支气管炎病毒基因组的3ab片段，以获得能够融合表达荧光素酶的重组病毒IBV-3ab-luc,将此病毒命名为重组病毒Ⅰ，用重组病毒Ⅰ作为指示病毒；S2、对指示病毒的检测：用重组病毒Ⅰ感染细胞，病毒复制一次，表达的荧光素酶的量也相应增加一次，感染后取样，测定荧光素酶的活力，以确定该指示病毒具有与IBV相同的感染力；S3、将无毒浓度的半夏乙醇提取物2mL，摄入对未感染传染性支气管炎病毒的鸡体内，将鸡放入感染有传染性支气管炎病毒的鸡群中生长，观察7d之后，发现放入的鸡未出现禽传性支气管炎典型症状，室内realtime-PCR检测，发现鸡体内存在禽传染性支气管炎病毒，但是病毒量很低，鸡的生长状况良好；根据实施例一，结论为：半夏乙醇提取物具有良好的预防IBV侵染的作用。实施例二：半夏乙醇提取物对鸭传染性支气管炎病毒的性能测定：S1、重组病毒的获得：选取感染有传染性支气管炎病毒的鸭，获取鸭上传染性支气管炎病毒基因组，再通过替换鸭的传染性支气管炎病毒基因组的3ab片段，以获得能够融合表达荧光素酶的重组病毒IBV-3ab-luc,将此病毒命名为重组病毒Ⅱ，用重组病毒Ⅱ作为指示病毒；S2、对指示病毒的检测：用重组病毒Ⅱ感染细胞，病毒复制一次，表达的荧光素酶的量也相应增加一次，感染后取样，测定荧光素酶的活力，以确定该指示病毒具有与IBV相同的感染力。S3、将无毒浓度的半夏乙醇提取物3mL，摄入对未感染传染性支气管炎病毒的鸭体内，将鸭放入感染有传染性支气管炎病毒的鸭群中生长，观察7d之后，发现放入的鸭未出现禽传性支气管炎典型症状，室内realtime-PCR检测，发现鸭体内存在禽传染性支气管炎病毒，但是病毒量很低，鸭的生长状况良好；根据实施例二，结论为：半夏乙醇提取物具有良好的预防IBV侵染的作用。