一种治疗肾纤维化的中药组合物的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗肾纤维化的中药组合物。

背景技术：

肾纤维化是各种肾脏疾病发展至终末期肾脏病的共同通路。目前认为，终末期肾脏病的病理改变是不可逆的，因此，控制肾纤维化的发生发展至关重要。肾纤维化的发病机制极其复杂，是多环节、多因素间相互作用的缓慢过程，主要机制包括：炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、肌成纤维细胞的活化与增殖、细胞外基质的合成与降解失衡等。传统中医理论中虽无肾间质纤维化一词，但各种慢性肾脏疾病最终因久病伤正而导致正虚邪实，浊毒内蕴，与现代医学中肾脏纤维化的病理改变后最终导致慢性肾功能不全所出现的疾病进程相一致。患者可见浮肿，少尿，纳呆，恶心，腰酸，舌淡暗，苔薄，脉细弦。

目前临床上对于肾纤维化的治疗主要包括：原发病的治疗(如梗阻性肾病等)、相关危险因素的消除和干预(如感染、药物等)及针对发病机制的治疗(如非甾体类抗炎药物、降压药物)。尽管上述治疗方法能够对肾纤维化起到一定的治疗作用，但并不能完全阻止慢性肾病向终末期逐渐进展。由于纤维化疾病的发病机制复杂、涉及因素多，单分子药物、单个治疗措施等在治疗肾纤维化疾病上，存在一定的先天性不足，因此，目前对于多靶点、多通道的抗纤维化药物的研究显得尤为重要。中医药着眼于宏观过程的调控与干预，抗纤维化具有多靶点特性，这恰恰在某种程度上弥补了化学合成药物单一靶点的不足。从单味药到复方制剂，从水煎剂到有效成分提取物，单味药如大黄、黄芪、冬虫夏草、丹参等，复方制剂如尿毒清(大黄、黄芪、桑白皮、苦参、白术、茯苓、白芍、制何首乌、丹参、车前草等组成)、抗纤灵冲剂(制大黄30g，丹参30g，牛膝15g，当归15g，桃仁12g等组成)等，均显示了良好的抗纤维化作用。但是，在中药防治纤维化疾病的研究过程中，仍然存在组方复杂，处方剂量大，抗纤维化作用有限等特点。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术中组方复杂，处方剂量大，抗纤维化作用有限等问题，提供一种能有效治疗肾纤维化的中药组合物。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

所述治疗肾纤维化的中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲5—20，黄芩3—15。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲5—20，黄芩3—15，大黄10—25。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲5—20，黄芩3—15，大黄10—25，丹参3—20。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲5—20，黄芩3—15，大黄10—25，丹参3—20，莪术3—20。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲10，黄芩6。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲10，黄芩6，大黄15。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲10，黄芩6，大黄15，丹参3—20。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲10，黄芩6，大黄15，丹参6。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲10，黄芩6，大黄15，丹参6，莪术3—20。

优选地，所述中药组合物包括如下重量份的组分：杜仲10，黄芩6，大黄15，丹参6，莪术6。

优选地，所述中药组合物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂。

本中药组合组分通过相互协同，起到治疗慢性肾功能不全的作用。方中大黄，既能清泻浊毒，又能破血行瘀；杜仲在《雷公炮制药性解》中记载“入肾经。”有补肝肾，强筋骨之功；而黄芩归肺经、大肠经，功能燥湿解毒，能使浊毒表散下泻，与泻下之大黄合用，清解排毒之力尤甚，可为佐助之药；莪术、丹参化瘀排毒，佐助大黄排泄浊毒。全方组合，祛邪为主，不失扶正，使邪祛正不伤。符合肾脏纤维化浊毒内蕴的治疗思路。适应于正虚邪实，浊毒内蕴所致食欲不振，恶心，腰膝酸软，心烦寐差为主要表现的慢性肾功能不全患者。

本发明所述中药组合物的制备方法：取本中药组合药材，用水或乙醇回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，制成适宜剂型。

本发明所述中药组合物的研究过程及药理实验如下：

一、本发明中药组合物研究过程：

本发明选用肾间质纤维化的经典动物模型——单侧输尿管结扎(unilateralureteralobstruction，uuo)所致的sd大鼠肾间质纤维化模型为研究对象，以10ml/kg为给药剂量，选用arb类药物氯沙坦作为阳性对照，旨在观察和评估不同中药组合抗肾间质纤维化的作用和疗效，从而选出最优组合物配方：

1.中药组合物的筛选实验

1.2.1实验动物的分组

雄性sd大鼠120只，适应性喂养1周后，观察其体重及一般情况的变化。实验过程中，大鼠称重、灌胃、手术及处死均在超净操作台内进行，每次实验前超净操作台均用紫外线照射30分钟灭菌。sd大鼠随机分为11组：⑴假手术组(sham，10只)、⑵uuo模型组(uuo，10只)、⑶氯沙坦组(uuo+losartan,10只)、⑷中药分为9组(分别为a-i组，uuo+zy，每组10只)。

各组大鼠于手术后当天开始，连续术后的14天内，每天1次，尽量在同一时间点进行相应剂量药物的灌胃。

(1)假手术组(sham)：0.9％生理盐水10ml/kg，灌胃，每天一次；

(2)uuo模型组(uuo)：0.9％生理盐水10ml/kg，灌胃，每天一次；

(3)氯沙坦组(uuo+losartan)：10mg/kg，灌胃,每天一次；

(4)中药组(uuo+zy)：中药提取液10ml/kg，灌胃,每天一次。

a组：大黄15g，杜仲10g，黄芩6g；

b组：大黄15g，杜仲10g，黄芩6g，丹参6g；

c组：大黄15g，杜仲10g，莪术6g，丹参6g，黄芩6g；

d组：大黄15g，杜仲10g；

e组：大黄15g，黄芩6g；

f组：杜仲10g，黄芩6g；

g组：大黄15g，

h组：杜仲10g；

i组：黄芩6g。

1.2.2检测指标及方法

光镜下观察肾组织形态学变化：肾组织病理光镜检查取左侧肾组织用10％中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，以3¨m的石蜡切片行he、masson染色。双盲法观察肾皮质问质变化情况。观察连续不重叠的10个高倍皮质视野，综合进行评定，行he染色、 masson染色，评估梗阻侧肾脏的间质损伤及胶原沉积。

结果判定：200倍光学显微镜下观察he染色切片，观察每个标本的皮质区，随机选取的20个不含肾小球的视野，肾小管间质病变由8个参数判定(见表1)，分别为肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞空泡变性、红细胞管型、蛋白管型、间质炎症细胞浸润、间质水肿、及间质纤维化程度，每个参数按0-3分评定，具体数值见表中所示(0分：正常；1分：轻度受损；2分：中度受损；3分：重度受损)。该标本的肾间质损伤指数选取10个视野的均值。

表1显微镜下肾小管间质损伤指数评分标准

结果判定：显微镜下观察masson染色切片，蓝绿色为阳性染色。每张切片选择20个不重复的200倍视野，以蓝绿色胶原沉积为阳性信号，评估胶原沉积。评分标准如下：0分，无染色；1分，<25％阳性面积；2分，25-50％阳性面积；3分，50-75％阳性面积；4分，75-100％阳性面积。

1.2.3实验结果

1.2.3.1he染色肾间质损伤指数评分

对各组大鼠梗阻侧肾组织的he染色进行评分，结果表明：与假手术组相比，uuo模型组梗阻侧肾脏的肾间质损伤指数显著升高(p<0.05)，提示造模成功。与uuo模型组相比，a组(大黄，杜仲，黄芩)、c组(大黄，杜仲，莪术，丹参，黄芩)、e组(大黄，黄芩)、f组(杜仲10g，黄芩)和氯沙坦治疗组的肾间质损伤评分显著降低(p<0.05)，提示治疗有效。中药b组(大黄，杜仲，黄芩，丹参)、d组(大黄，杜仲)、g组(大黄)、h组(杜仲)、i(黄芩)组的肾间质损伤评分降低，显示有一定的治疗效果，但没有统计学意义，可能跟实验动物的数量有关，见表2。

表2各组大鼠肾间质损伤指数评分

*：与假手术组比较，p<0.05；#：与uuo模型组比较，p<0.05

1.2.3.2masson染色肾间质胶原评分

对masson染色切片进行肾间质胶原评分，结果提示：与假手术组相比，uuo模型组的肾间质胶原沉积明显增加，其肾间质胶原评分显著增高(p<0.05),a-i组和和氯沙坦组与模型组比较，肾间质的胶原沉积明显减少，肾间质胶原评分显著降低(p<0.05)。见表3。

表3uuo各组大鼠梗阻肾间质胶原面积百分比

*：与假手术组比较，p<0.05；#：与uuo模型组比较，p<0.05

综上所述，9组实验都有不同程度的抗纤维化作用，其中实验a组(大黄，杜仲，黄芩)、c组(大黄，杜仲，莪术，丹参，黄芩)、e组(大黄，黄芩)、f组(杜仲10g，黄芩)，he染色肾间质损伤指数评分和masson染色肾间质胶原评分都显示治疗效果有统计学意义。为了进一步确定本发明的治疗效果，选择a组进行进一步药效学研究。

二、本发明中药组合物药理学实验结果：

本发明选用肾间质纤维化的经典动物模型——单侧输尿管结扎(unilateralureteralobstruction，uuo)所致的sd大鼠肾间质纤维化模型为研究对象，以10ml/kg为给药剂量，选用arb类药物氯沙坦作为阳性对照，以观察和评估中药a组(大黄15g，杜仲10g，黄芩6g)抗肾间质纤维化的作用和疗效为例：

1材料与方法

1.1研究对象

实验动物：雄性sprague-dawley清洁级健康大鼠50只，购自长沙斯莱克实验动物有限公司，体重200±20g，月龄2月左右，生长状况良好。大鼠均饲养于中南大学湘雅医学院动物学部,每笼3-4只，清洁级无菌环境，饲养温度22±2℃，湿度55±2％。饲料、垫料购自长沙斯莱克实验动物有限公司,均经无菌处理,每周更换垫料两次,每周更换笼具一次， 饮用水由中南大学实验动物学部提供。动物使用符合中南大学动物管理委员会管理条例。1.2方法

雄性sd大鼠50只,适应性喂养1周后，观察其体重及一般情况的变化。实验过程中，大鼠称重、灌胃、手术及处死均在超净操作台内进行，每次实验前超净操作台均用紫外线照射30分钟灭菌。sd大鼠随机分为4组：假手术组(sham，12只)、uuo模型组(uuo，12只)、中药a组(uuo+zy6，12只)、氯沙坦组(uuo+losartan,12只)。

各组大鼠于手术后当天开始，连续术后的14天内，每天1次，尽量在同一时间点进行相应剂量药物的灌胃。

(1)假手术组(sham)：0.9％生理盐水10ml/kg，灌胃，每天一次；

(2)uuo模型组(uuo)：0.9％生理盐水10ml/kg，灌胃，每天一次；

(3)中药a组(uuo+zy6)：中药a组溶液10ml/kg，灌胃,每天一次；

(4)氯沙坦组(uuo+losartan)：10mg/kg，灌胃,每天一次。

2.实验结果

2.1各组大鼠肾脏大体观

uuo术后第14天时结束实验，观察各组大鼠一般情况良好，毛发白，活动正常。大鼠处死前禁食一晚，麻醉后剖开腹腔，分离肾脏。可见假手术组大鼠左侧肾脏形态大小正常，与对侧肾脏无明显区别；uuo模型组大鼠左侧梗阻肾脏体积较对侧明显增大，沿矢状面剖开肾脏后，见澄清尿液流出，肾皮质明显萎缩变薄，肾盂肾盏显著扩张变形，提示单侧输尿管梗阻造模成功(见图1)。予以一定剂量的中药a组及氯沙坦治疗后，梗阻侧肾脏皮质较模型组增厚。

2.2各组大鼠肾脏he染色

2.2.1he染色病理改变

在普通光学显微镜下观察肾脏组织he染色切片，结果发现，假手术组肾组织无明显病理改变，肾小管、肾间质等均未见明显异常。和假手术比较，uuo模型组病变明显，可见大量肾小管的扩张和萎缩、肾间质增宽、肾小管上皮细胞空泡变性，伴有间质弥漫性的炎症细胞浸润、间质细胞增生及胶原纤维增多等改变。观察中药a组及氯沙坦治疗组的he染色发现，与uuo模型组相比，其肾小管的扩张和萎缩、炎症细胞浸润等明显改善(见图2)。

2.2.2he染色肾间质损伤指数评分

对各组大鼠梗阻侧肾组织的he染色进行评分，结果表明：与假手术组相比,uuo模 型组梗阻侧肾脏的肾间质损伤指数显著升高(p<0.05)，提示造模成功。与uuo模型组相比,中药a组和氯沙坦治疗组的肾间质损伤评分显著降低(p<0.05)，提示治疗有效。比较中药a组与氯沙坦组，发现两个治疗组之间无明显差异(p>0.05)，见表4。

表4各组大鼠肾间质损伤指数评分

△：与假手术组比较，p<0.05；*：与uuo模型组比较，p<0.05

2.3各组大鼠肾脏masson染色

2.3.1masson染色病理改变

在普通光学显微镜下观察各组大鼠梗阻侧肾组织的masson染色切片，结果发现，假手术组左侧肾组织在肾小球系膜、基底膜、肾小管基底膜、脉管区有蓝色的阳性表达区域。与假手术组比较,uuo模型组除在上述区域可见蓝染的胶原外，在肾间质内可见大量的纤维条索状的胶原蓝染区域。中药a组和氯沙坦组和模型组相比，蓝色的阳性区域明显减少，两个治疗组之间无明显差别(见图3)。

2.3.2masson染色肾间质胶原评分

对masson染色切片进行肾间质胶原评分，结果提示：与假手术组相比，uuo模型组的肾间质胶原沉积明显增加，其肾间质胶原评分显著增高(p<0.05),中药a组和氯沙坦组与模型组比较，肾间质的胶原沉积明显减少，肾间质胶原评分显著降低(p<0.05)。两个治疗组之间相比，其肾间质的胶原沉积及评分无明显差异(p>0.05)。见表5。

表5各组大鼠肾间质胶原评分

2.4肾脏组织免疫组化检测

2.4.1肾组织i型胶原的表达

显微镜下观察各组大鼠肾组织i型胶原的免疫组化染色，结果发现，假手术组的肾组织仅在血管周围有少量的棕黄色胶原染色，而肾间质则未见明显的棕黄色区域。uuo模型组与假手术组相比，除血管周围见阳性染色外，在肾间质也可见大量染成棕黄色条索状的i型胶原。中药a组和氯沙坦组的肾间质阳性染色较模型组明显减少，两个治疗组之间无明显差别。见图4。

2.4.2肾组织i型胶原半定量评分

对各组大鼠肾组织i型胶原的表达进行半定量评分分析，结果显示：uuo模型组肾间质i型胶原的面积半定量评分显著高于假手术组(p<0.05)；中药a组和氯沙坦组的i型胶原半定量评分较uuo模型组明显降低(p<0.05)；两治疗组之间无明显差异(p>0.05)。见表5。

表5各组大鼠肾间质i型胶原半定量评分

注：△：与假手术组比较，p<0.05；*：与uuo模型组比较，p<0.05

2.4.3肾组织iii型胶原的表达

显微镜下观察各组大鼠肾组织iii型胶原的免疫组化染色，结果显示：假手术组除在血管周围有棕黄色胶原表达，肾间质无明显表达；与假手术组相比，uuo模型组的肾间质内可见大量染成棕黄色条索状iii型胶原表达；中药a组和氯沙坦组的肾间质iii型胶原表达较模型组明显减少，两治疗组之间无明显差异。见图5。

2.4.4肾组织iii型胶原半定量评分

对各组大鼠肾组织iii型胶原的表达进行半定量评分分析，结果显示：uuo模型组肾间质iii型胶原的面积半定量评分显著高于假手术组(p<0.05)；中药a组和氯沙坦组的iii型胶原半定量评分较uuo模型组明显降低(p<0.05)；两治疗组之间无明显差异(p>0.05)。 见表6。

表6uuo第14天各组大鼠梗阻侧iii型胶原阳性面积百分比

注：△：与假手术组比较，p<0.05；*：与uuo模型组比较，p<0.05

2.5各组大鼠肾组织α-sma的蛋白表达

westernblot检测各组大鼠肾脏的α-sma的蛋白表达，结果显示：假手术组肾组织仅有少量α-sma表达，uuo模型组与假手术相比，α-sma的蛋白表达明显增多(p<0.05)；中药a组和氯沙坦组的α-sma表达较模型组明显减少(p<0.05)，两个治疗组之间无明显差异(p>0.05)，见图6。

通过上述实验表明，本发明所述中药组合物适应于正虚邪实，浊毒内蕴所致食欲不振，恶心，腰膝酸软，心烦寐差为主要表现的肾纤维化患者。

附图说明

图1为各组大鼠双侧肾脏大体观图，图中：a为假手术组(sham)，b为uuo模型组(uuo)，c为中药a组(uuo+中药)，d为氯沙坦组(uuo+losartan)；

图2为各组大鼠梗阻侧肾组织he染色(x200)，图中：a为假手术组(sham)，b为uuo模型组(uuo)，c为中药a组(uuo+中药)，d为氯沙坦组(uuo+losartan)；

图3为各组大鼠梗阻侧肾组织masson染色(x200)，图中：a为假手术组(sham)，b为uuo模型组(uuo)，c为中药a组(uuo+中药)，d为氯沙坦组(uuo+losartan)；

图4为各组大鼠梗阻侧肾组织i型胶原免疫组化(x200)，图中：a为假手术组(sham)，b为uuo模型组(uuo)，c为中药a组(uuo+中药)，d为氯沙坦组(uuo+losartan)；

图5为各组大鼠梗阻侧肾组织iii型胶原免疫组化(x200)，图中：a为假手术组(sham)，b为uuo模型组(uuo)，c为中药a组(uuo+中药)，d为氯沙坦组(uuo+losartan)；

图6为各组大鼠肾组织α-sma的表达(n＝3)，图中：△：与假手术组(sham)比较，p<0.05；*：与uuo模型组(uuo)比较，p<0.05

具体实施方式

实施例1：颗粒剂的制备

取大黄15g，杜仲10g，黄芩6g，用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇制粒，低温干燥，整粒，分装，即得。

实施例2：胶囊剂的制备

取大黄10g，杜仲20g，黄芩15g，用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇制粒，低温干燥，整粒，灌装胶囊，即得。

实施例3：片剂的制备

取大黄25g，杜仲6g，黄芩20g，用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇制粒，低温干燥，整粒，压片，即得。

实施例4：颗粒剂的制备

取大黄25g，杜仲20g，黄芩20g用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇制粒，低温干燥，整粒，分装，即得。

实施例5：颗粒剂的制备

取大黄15g，杜仲10g，莪术6g，丹参6g，黄芩6g，用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇制粒，低温干燥，整粒，分装，即得。

实施例6：片剂的制备

取大黄10g，杜仲5g，莪术6g，丹参6g，黄芩3g，用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇 制粒，低温干燥，整粒，压片，即得。

实施例7：颗粒剂的制备

取杜仲20g，黄芩3g，用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇制粒，低温干燥，整粒，分装，即得。

实施例8：胶囊剂的制备

取杜仲5g，黄芩15g，用水回流提取2次，第一次加12倍量回流提取90min，第二次加10倍量回流提取60min，滤过，合并滤液，减压浓缩成相对密度约为1.06(50℃)的浓缩液，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，用75％乙醇制粒，低温干燥，整粒，灌装胶囊，即得。